Name: auditory brainstem response and outer hair cell whole-cell patch clamp recording in postnatal rats
Uploaded: 2018-05-24T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
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この作品は、973 プログラム (2014CB943002) と、国家自然科学基金、中国の (11534013、31500841) からの助成金によって支えられました。

動物を対象とする実験のすべてのプロトコルは、南方医科大学の動物倫理委員会によって承認されました。
1 実験用のソリューションを準備します。
<ol><li>麻酔の準備 (材料の表を参照してください): 1.5% ペントバルビ タール ナトリウム溶解 ddH2o.</li>
	<li>郭清のソリューションを準備 (材料の表を参照してください): Leiboviz の L-15 パウダー 1 M NaOH で ddH2O. 調整 pH 7.3 の 1 L に 1 袋を溶かします。Osmometer および使用する前に 10 mM HEPES を使用して 300 330 mOsm に浸透圧を調整します。</li>
	<li>2 mg/mL コラゲナーゼ IV を解散 (材料表参照) ステップ 1.2 で郭清溶液で。</li>
	<li>(材料の表を参照してください) 染色ソリューションを準備: リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で 4% パラホルムアルデヒドを解散。 注意: パラホルムアルデヒドは有毒である;適切な保護具を着用します。</li>
	<li>PBS で 0.3% 透水剤を希釈します。ブロック バッファーとして PBS で 10% ヤギ血清を希釈します。ブロック バッファーのプレスチン抗体 1: 200 を希釈します。ブロック バッファーで抗体の Alexa488 共役 1:600 を希釈します。PBS でファロイジン Tetramethylrhodamine B イソチオ シアン酸 1: 200 を希釈します。</li>
	<li>細胞外の溶液を準備 (材料の表を参照してください): (ステップ 1.2) 上記のように Leiboviz の L-15 媒体を準備します。</li>
	<li>細胞内の溶液を調製 (材料の表を参照してください)。</li>
</ol>2. ABR 記録
注: ABR 記録は、以前私たちの以前の研究9で詳細に記載されています。
<ol><li>ペントバルビ タール ナトリウム 1.5% (22 mg/kg の子犬および大人、腹腔内の 30 mg/kg、(i. p.)) の単一の注入と SD) ラット (1 14 日古い子犬、生後 2 ヶ月の大人、男女ともに) を麻酔します。</li>
	<li>動物の体を動けなくポリエチレン発泡金型に麻酔下の動物を配置します。音減衰部屋の防振テーブルに動物を配置します。37.5 ° C 加熱パッドで動物の体の温度を保ちます。</li>
	<li>(巻/巻) 70% エタノールでヘッドの領域を拭いてください。良いはさみを使用して、参照電極または地上に配置する外部の耳介に腹の 1-2 mm の切開を加えます。頭蓋骨の頂点 (図 1 a) 皮下針電極 (電極記録) があります。</li>
	<li>関数発生器を使用して様々 な周波数のキャリブレーション トーン バースト (1 ms 立上り/立下り、3 ms 高原) を生成する (2、4、8、16、24、および 32 kHz) と強度 (85 から 5 dB ステップで 10 dB SPL に減少した)。周波数と振幅を手動で変更またはコンピューターを使用しています。動物の頭に向かって離れて 10 cm に位置する静電スピーカーから音刺激を提供します。</li>
	<li>(100-1,000 Hz) をフィルター、増幅し、平均 (256 回) サウンド誘発可能性多機能プロセッサを使用して、Abr を取得します。ABR のトレースには、オンラインとオフラインで分析できるストアドが監視されます。1 つの動物から記録 ABR を完了する約 40 分かかります。 注: (波私波 VII) 通常、3 ~ 7 ピーク遅延時間が 15 ms にすることができます未満は (図 1 b) を識別します。ABR 閾値は、I と II が波を検出できる最小の音圧レベルとして定義されます。</li>
	<li>動物 (0.3 mL 1.5% ナトリウム, ペントバルビ タールの腹腔内投与) と麻酔から覚める前に安楽死させます。</li>
</ol>3. コルチ器官 (OC) 郭清
<ol><li>ラットを麻酔します。ラット未満 6 日古いの (< P6)、100 mm の培養皿で動物を維持し、10 分間氷で包みます。ラット用 > P6、1.5% ナトリウム ペントバルビ タール (22 mg/kg, i. p.) の単回投与で動物を麻酔します。麻酔後ラット仔の首をはねます。</li>
	<li>頭を 70% (巻/巻) エタノールを噴霧して消毒します。</li>
	<li>ハサミの矢状面の正中線に沿って頭蓋骨を開く脳、内耳を公開するを削除します。</li>
	<li>3 ml 冷たい L-15 (図 2 a) の 35 mm のペトリ皿に内耳を転送します。</li>
	<li>解剖顕微鏡の下で微細鉗子を使用して (図 2 b) 蝸牛の硬骨を削除します。</li>
	<li>OC の包みを開けるし、蝸牛軸から耳用 (SV) を関連付けられています。</li>
	<li>押し鉗子、SV の基底部 OC SV から完全に分離ベース-apex (図 2) からゆっくりとアンワインドしています。</li>
	<li>高級はさみ (図 2 D) を使って OC を 3 個に均等に切る。</li>
</ol>4. 蛍光抗体染色
<ol><li>200 μ L ピペット チップを使用して、スライド ガラス上に OC (ステップ 3.8) のセグメントに転送、4 ° C で、少なくとも 4 時間のための 4% のパラホルムアルデヒドの 100 μ L で固定 注意: パラホルムアルデヒドは有毒である;適切な保護具を着用します。</li>
	<li>新鮮な pbs 100 μ L でパラホルムアルデヒドを置き換えたり、組織を洗います。10 分間 3 回ティッシュを洗います。</li>
	<li>室温で 30 分間 PBS で 0.3% 透過性エージェントと組織を孵化させなさい。</li>
	<li>PBS で透磁率エージェントを破棄し、PBS に組織を 3 回洗います。</li>
	<li>室温で 1 時間 PBS で 10% ヤギ血清をブロックします。</li>
	<li>一晩 2 時間室温でまたは 4 ° C で解決を妨げる抗プレスチン C 末端抗体 (レバレッジ) で孵化させなさい。</li>
	<li>3 回を PBS で 5 分間洗浄します。</li>
	<li>暗闇の中で室温で 1 時間ブロッキング液で Alexa488 共役二次抗体 (1:600) を孵化させなさい。</li>
	<li>3 回を PBS で暗闇の中で 5 分間洗浄します。</li>
	<li>ローダミン ファロイジン (レバレッジ) と暗闇の中で室温で 10 分間インキュベートします。</li>
	<li>3 回を PBS で暗闇の中で 5 分間洗浄します。</li>
	<li>スライド ガラス (DAPI を含む) メディアをマウントをマウントします。405 を使用して共焦点顕微鏡画像 nm、488 nm、および 594 nm のレーザー。レーザー電力設定 0.1 0.5 mW とスキャンは 0.5 フレーム/秒で高速化します。</li>
</ol>5. パッチク ランプ記録の分離
<ol><li>ピペットの引き手を使用し、パッチを作るに偽造者のマイクロ ピペット先端径 2-3 μ m. 埋戻し細胞内ソリューションとピペット。通常、パッチ ピペットの最初の抵抗は、バス ソリューションの 2.5 から 3.5 の MΩ だった。</li>
	<li>200 μ L ピペット チップを使用して、35 mm のペトリ皿に (ステップ 3.8) から OC の一部を転送します。100 μ L の酵素消化中で組織を消化 (コラゲナーゼ IV、参照テーブルの材料) 室温で 5 分間。</li>
	<li>L-15 の 100 μ L の酵素消化中を転置します。組織を有毛細胞を分離するマイクロ メスを使用する小さな断片にカットします。</li>
	<li>穏やかなピペッティング後自家製小型プラスチック製チャンバーにセルを転送 (直径 〜 1.5 cm) 無料の酵素入浴液でいっぱい (〜 1.5 mL材料表を参照してください)。</li>
	<li>倒立顕微鏡のステージでチャンバーを配置します。健康表示の孤独な内耳を見つけます。</li>
	<li>700 b アンプのヘッド ステージにパッチ ピペットをロードします。マイクロマニピュレーターによってパッチ ピペットを慎重に移動し、外有毛細胞 (図 3 a) の下部に位置します。</li>
	<li>細胞は、細胞体の側壁をシールで、OHC をクランプします。細胞膜が破裂するまで光の吸引を適用します。-70 で潜在的な開催を設定 mV。10 〜 17 MΩ 抵抗と膜抵抗セルは 100 〜 500 MΩ、成功した全体セル構成と見なされます。</li>
	<li>コンピューター制御を使用して過分極・脱分極電圧を適用 (250 ms 期間と +94 −140 に至る 13 mV 刻みで mV) 全細胞の流れを引き出すためにセルに。</li>
	<li>全細胞の流れを増幅、700 b アンプで (角周波数 5 kHz) をフィルターします。1440A コンバーターとオフライン解析のための店でデータを変換します。</li>
	<li>パッチ クランプ ソフトウェアによって制御される 2 つの正弦波電圧刺激プロトコルを使用して内耳の膜の静電容量を測定します。-140 から刺激する電圧範囲を 110 に設定 mV。オフライン分析用のデータを格納します。</li>
</ol>

<ol>
	<li>He, D. Z., Zheng, J., Kalinec, F., Sacchi Kakehata, S. S. a. n. t. o. s. -., J, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuning+in+to+the+amazing+outer+hair+cell:+membrane+wizardry+with+a+twist+and+shout.">Tuning in to the amazing outer hair cell: membrane wizardry with a twist and shout.</a> J Membr Biol. 209, 119-134 (2006).</li><li>Dallos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochlear+amplification,+outer+hair+cells+and+prestin.">Cochlear amplification, outer hair cells and prestin.</a> Curr Opin Neurobiol. 18, 370-376 (2008).</li><li>Zheng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prestin+is+the+motor+protein+of+cochlear+outer+hair+cells.">Prestin is the motor protein of cochlear outer hair cells.</a> Nature. 405, 149-155 (2000).</li><li>Abe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+expression+of+the+outer+hair+cell+motor+prestin+in+the+mouse.">Developmental expression of the outer hair cell motor prestin in the mouse.</a> J Membr Biol. 215, 49-56 (2007).</li><li>Waguespack, J., Salles, F. T., Kachar, B., Ricci, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stepwise+morphological+and+functional+maturation+of+mechanotransduction+in+rat+outer+hair+cells.">Stepwise morphological and functional maturation of mechanotransduction in rat outer hair cells.</a> J Neurosci. 27, 13890-13902 (2007).</li><li>Zhang, L. I., Bao, S., Merzenich, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+and+specific+influences+of+early+acoustic+environments+on+primary+auditory+cortex.">Persistent and specific influences of early acoustic environments on primary auditory cortex.</a> Nat Neurosci. 4, 1123 (2001).</li><li>De, V. -. S. E., Chang, E. F., Bao, S., Merzenich, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+period+window+for+spectral+tuning+defined+in+the+primary+auditory+cortex+(A1)+in+the+rat.">Critical period window for spectral tuning defined in the primary auditory cortex (A1) in the rat.</a> J Neurosci. 27, 180-189 (2007).</li><li>He, D. Z., Evans, B. N., Dallos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+appearance+and+development+of+electromotility+in+neonatal+gerbil+outer+hair+cells.">First appearance and development of electromotility in neonatal gerbil outer hair cells.</a> Hearing Res. 78, 77-90 (1994).</li><li>Hang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronized+Progression+of+Prestin+Expression+and+Auditory+Brainstem+Response+during+Postnatal+Development+in+Rats.">Synchronized Progression of Prestin Expression and Auditory Brainstem Response during Postnatal Development in Rats.</a> Neural Plast. , 4545826 (2016).</li><li>Ehret, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+absolute+auditory+thresholds+in+the+house+mouse+(Mus+musculus).">Development of absolute auditory thresholds in the house mouse (Mus musculus).</a> J Am Audiol Soc. 1, 179-184 (1976).</li><li>M&#248;ller, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Hearing:anatomy, physiology, and disorders of the auditory system. , (2006).</li><li>He, D. Z., Zheng, J., Edge, R., Dallos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+cochlear+inner+hair+cells.">Isolation of cochlear inner hair cells.</a> Hearing Res. 145, 156-160 (2000).</li><li>Tang, J., Pecka, J. L., Tan, X., Beisel, K. W., He, D. Z. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+Pendrin+Protein,+an+Anion+Transporter+and+Molecular+Motor.">Engineered Pendrin Protein, an Anion Transporter and Molecular Motor.</a> J Biological Chem. 286, 31014-31021 (2011).</li><li>Fu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Effects+of+Urethane+on+Rat+Outer+Hair+Cells.">The Effects of Urethane on Rat Outer Hair Cells.</a> Neural Plast. 2016, 1-11 (2016).</li></ol>

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11 日目より若いラット、聴覚野6,7で音刺激電位が観察できません。したがって、生後 11 日目は、「聴覚発症"10として記述されます。聴覚の発症がよくまだ研究されていない前に聴覚機能の開発。大人の ABR 記録のため同様のメソッドを使用して、Abr が仔 P11 より若いから純粋なトーン バーストによって誘発されることを示す (<stro...

哺乳類の聴覚の感覚の蝸牛の有毛細胞の 2 つの異なる機能が欠かせない: mechanoelectric 伝達 (MET) と electromotility1,2。MET チャネル髪束、Ihc (Ihc), 変換音振動膜電位変化と神経らせん神経節細胞の電気信号であります。内耳膜電位とそのセルの長さを変更し、低音の振動を増幅します。Electromotility と呼ばれるこの活動は,3の外側の壁にあるタンパク質モータプレスチンによって派生します。
齧歯動物を含む多くの種で、公聴会の関数は初期産後エポック4,5に未熟です。聴覚発症6、7の前に聴覚野における音声信号への応答で活動電位が検出されません。形態の開発と蝸牛の機能はラット4,5,8スナネズミ、マウスで広く研究されています。メカノトランスダクションと有毛細胞の electromotility の初期の開発もエポック社の生活の5。
生後隔世でラットの聴覚感度を評価するためにラット記録脳幹反応 (ABR) の手法を提案します。全細胞パッチク ランプは、生理、内耳を調査する理想的な技術です。ただし、ニューロンと他の上皮細胞で実行パッチ クランプと比べると、全体携帯シールの低率は分離強大の electromotility の調査を制限しました。
ここで我々 は生後ラット急性解離の蝸牛の形態と生理、内耳を調査する手順をについて説明します。このメソッドは、内部の有毛細胞の開発と機能を制御する分子機構を研究する変更できます。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Anesthetic&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital sodium</td><td>Sigma</td><td>P3761</td><td>1.5% in water</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Dissection solution&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leiboviz&#039;s L-15 Medium</td><td>Life Technologies</td><td>41300-039</td><td>1 pack in 1 L water</td></tr><tr><td>Collagenase IV</td><td>Sigma</td><td>C5138</td><td>2 mg/mL in L-15</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>7365-45-9</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Immunostaining solutions&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td><td>PH 7.3</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma</td><td>158127</td><td>4% in PBS</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Amresco</td><td>ZS-0694</td><td>0.3% in PBS</td></tr><tr><td>Normal goat serum</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10000C</td><td>10% in PBS</td></tr><tr><td>prestin antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-22694</td><td>dil 1:200</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488-conjugated antibody</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11055</td><td>dil 1:600</td></tr><tr><td>Phalloidin-Tetramethylrhodamine B isothiocyanate</td><td>Sigma</td><td>P1951</td><td>dil 1:200</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Solarbio</td><td>C0060</td><td>dil 1:20</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Extracellular solution&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leiboviz&#039;s L-15 Medium</td><td>Life Technologies</td><td>41300-039</td><td>1 pack in 1 L water</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>7365-45-9</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Intracellular solution&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CsCl</td><td>Sigma</td><td>7647-17-8</td><td>140 mM</td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>7791-18-6</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>67-42-5</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>7365-45-9</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Osmometer</td><td>Gonotec</td><td>OSMOMAT 3000 basic</td><td></td></tr><tr><td>Forcep</td><td>WPI</td><td>14095</td><td>Tweezers dumont</td></tr><tr><td>Micropipette puller</td><td>Sutter Instrument</td><td>MODLE-P97</td><td></td></tr><tr><td>Micro Forge</td><td>Narishigen</td><td>MF-830</td><td></td></tr><tr><td>Mini Operating System</td><td>Sutter Instrument</td><td>MP-285</td><td></td></tr><tr><td>MultiClamp</td><td>Axon</td><td>700B</td><td></td></tr><tr><td>Low-Noise Data Acquisition System</td><td>Axon</td><td>1440A</td><td></td></tr><tr><td>ES1 speaker</td><td>Tucker-Davis Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TDT system 3</td><td>Tucker-Davis Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Software&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SigGenRP software</td><td>Tucker-Davis Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioSigRP software</td><td>Tucker-Davis Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>jClamp</td><td>Scientific Solutions</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Animal&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SD rat</td><td>Experimental Animal Center of Southern Medical University</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

auditory brainstem response and outer hair cell whole-cell patch clamp recording in postnatal rats

外の有毛細胞は哺乳類の蝸牛の感覚毛の細胞の 2 つのタイプの 1 つです。彼らは、低レベルの音声信号の弱い振動を増幅する潜在的な受容体とそのセルの長さを変更します。形態と内耳外有毛細胞の電気生理学的特性は、産後の早い年齢で開発します。外有毛細胞の成熟聴覚システムの開発に貢献するかもしれない。しかし、内耳の開発のプロセスはよく研究されていません。これは電気生理学的アプローチによるそれぞれの機能を測定する難しさの一因です。上記の問題を解決する簡単な方法を開発することを目的としてここで我々 は生後ラット急性解離の蝸牛における内耳の機能を勉強する段階的なプロトコルをについて説明します。この方法では、純音刺激の蝸牛神経の反応を評価し、表現レベルと強大でタンパク質モータプレスチンの機能を調べる。このメソッドは、内部の有毛細胞 (Ihc) を調査にも使用できます。

ABR は、麻酔したラットの子犬生後 7 日目より古い (P7) (図 1 a) 純粋なトーン バーストを使用してから誘発されることができます。図 1 bのように、仔と小振幅だけ 3 〜 4 明瞭な波を示したから ABR 波形が得られます。通常は、7 つのピークまで大人動物 (図 1 b) ABR 波形の観察されました。
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Auditory Brainstem Response and Outer Hair Cell Whole-cell Patch Clamp Recording in Postnatal Rats

このプロトコルは、生後ラットの聴性脳幹反応を記録する方法を説明します。外有毛細胞の機能の発達を調べると、全細胞パッチク ランプ分離外有毛細胞内記録の実験の手順がステップバイ ステップで説明されています。

聴性脳幹反応と生後ラットの外有毛細胞細胞パッチ ・ クランプ記録

The outer hair cell is one of the two types of sensory hair cells in the mammalian cochlea. They alter their cell length with the receptor potential to ...

auditory-brainstem-response-outer-hair-cell-whole-cell-patch-clamp

Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.4K ビュー.  Southern Medical University. このプロトコルは、生後ラットの聴性脳幹反応を記録する方法を説明します。外有毛細胞の機能の発達を調べると、全細胞パッチク ランプ分離外有毛細胞内記録の実験の手順がステップバイ ステップで説明されています。

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Patch Clamp Recordings on Intact Dorsal Root Ganglia from Adult Rats

Patch clamp studies from dorsal root ganglia (DRGs) neurons have increased our understanding of the peripheral nervous system. Currently, the majority of recordings are conducted on dissociated DRG neurons, which is a standard preparation for most laboratories. Neuronal properties, however, can be altered by axonal injury resulting from enzyme digestion used in acquiring dissociated neurons. Further, dissociated neuron preparations cannot fully represent the microenvironment of the DRG since loss of contact with satellite glial cells that surround the primary sensory neurons is an unavoidable consequence of this method. To overcome the limitations in using conventional dissociated DRG neurons for patch clamp recordings, in this report we describe a method to prepare intact DRGs and conduct patch clamp recordings on individual primary sensory neurons ex vivo. This approach permits the fast and straightforward preparation of intact DRGs, mimicking in vivo conditions by keeping DRG neurons associated with their surrounding satellite glial cells and basement membrane. Furthermore, the method avoids axonal injury from manipulation and enzyme digestion such as when dissociating DRGs. This ex vivo preparation can additionally be used to study the interaction between primary sensory neurons and satellite glial cells.

This manuscript describes how to prepare intact dorsal root ganglia for patch clamp recordings. This preparation maintains the microenvironment for neurons and satellite glial cells, thus avoiding the phenotypic and functional changes seen using dissociated DRG neurons.

成体ラットから無傷の後根神経節上のパッチクランプ記録

Patch clamp studies from dorsal root ganglia (DRGs) neurons have increased our understanding of the peripheral nervous system. Currently, the majority of ...

生化学

Postsynaptic Recordings at Afferent Dendrites Contacting Cochlear Inner Hair Cells: Monitoring Multivesicular Release at a Ribbon Synapse

The afferent synapse between the inner hair cell (IHC) and the auditory nerve fiber provides an electrophysiologically accessible site for recording the postsynaptic activity of a single ribbon synapse 1-4. Ribbon synapses of sensory cells release neurotransmitter continuously, the rate of which is modulated in response to graded changes in IHC membrane potential 5. Ribbon synapses have been shown to operate by multivesicular release, where multiple vesicles can be released simultaneously to evoke excitatory postsynaptic currents (EPSCs) of varying amplitudes 1, 4, 6-11. Neither the role of the presynaptic ribbon, nor the mechanism underlying multivesicular release is currently well understood.
The IHC is innervated by 10-20 auditory nerve fibers, and every fiber contacts the IHC with a unmyelinated single ending to form a single ribbon synapse. The small size of the afferent boutons contacting IHCs (approximately 1 &mu;m in diameter) enables recordings with exceptional temporal resolution to be made. Furthermore, the technique can be adapted to record from both pre- and postsynaptic cells simultaneously, allowing the transfer function at the synapse to be studied directly 2. This method therefore provides a means by which fundamental aspects of neurotransmission can be studied, from multivesicular release to the elusive function of the ribbon in sensory cells.

Whole-cell patch-clamp recordings from auditory nerve fiber dendrites at the inner hair cell ribbon synapse in the mammalian cochlea.

蝸牛内有毛細胞に接触求心性樹状突起でのシナプス後録音：リボンシナプスでのモニタリングの多胞体のリリース

The afferent synapse between the inner hair cell (IHC) and the auditory nerve fiber provides an electrophysiologically accessible site for recording the ...

神経科学

Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish

Patch clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated from a variety of species have been described previously1-4 but this video represents the first application of those techniques to hair cells from zebrafish. Here we demonstrate a method to isolate healthy, intact hair cells from all of the inner ear end-organs: saccule, lagena, utricle and semicircular canals. Further, we demonstrate the diversity in hair cell size and morphology and give an example of the kinds of patch clamp recordings that can be obtained. The advantage of the use of this zebrafish model system over others stems from the availability of zebrafish mutants that affect both hearing and balance. In combination with the use of transgenic lines and other techniques that utilize genetic analysis and manipulation, the cell isolation and electrophysiological methods introduced here should facilitate greater insight into the roles hair cells play in mediating these sensory modalities.

The purpose of this video is to demonstrate procedures for obtaining healthy, intact hair cells from the inner ear organs of adult zebrafish and then using them for patch clamp studies aimed at characterizing the biophysical properties of their voltage-gated channels.

内耳有毛細胞におけるパッチクランプ記録は、単離されたゼブラフィッシュから

Patch  clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated  from a variety of species have been described previously1-4 but this  ...

Trans-Tympanic Drug Delivery for the Treatment of Ototoxicity

The systemic administration of protective agents to treat drug-induced ototoxicity is limited by the possibility that these protective agents could interfere with the chemotherapeutic efficacy of the primary drugs. This is especially true for the drug cisplatin, whose anticancer actions are attenuated by antioxidants which provide adequate protection against hearing loss. Other current or potential otoprotective agents could pose a similar problem, if administered systemically. The application of various biologicals or protective agents directly to the cochlea would allow for high levels of these agents locally with limited systemic side effects. In this report, we demonstrate a trans-tympanic method of delivery of various drugs or biological reagents to the cochlea, which should enhance basic science research on the cochlea and provide a simple way of directing the use of otoprotective agents in the clinics. This report details a method of trans-tympanic drug delivery and provides examples of how this technique has been used successfully in experimental animals to treat cisplatin ototoxicity.

We present a technique for localized administration of drugs through the trans-tympanic route into the cochlea. Drug delivery through this route would not interfere with the anti-cancer efficacy of the chemotherapeutic drugs such as cisplatin.

難聴の治療のためのトランス鼓膜ドラッグデリバリー

The systemic administration of protective agents to treat drug-induced ototoxicity is limited by the possibility that these protective agents could ...

医学

Data Acquisition and Analysis In Brainstem Evoked Response Audiometry In Mice

Brainstem evoked response audiometry (BERA) is of central relevance in the clinical neurophysiology. As other evoked potential (EP) techniques, such as visually evoked potentials (VEPs) or somatosensory evoked potentials (SEPs), the auditory evoked potentials (AEPs) are triggered by the repetitive presentation of identical stimuli, the electroencephalographic (EEG) response of which is subsequently averaged resulting in distinct positive (p) and negative (n) deflections. In humans, both the amplitude and the latency of individual peaks can be used to characterize alterations in synchronization and conduction velocity in the underlying neuronal circuitries. Importantly, AEPs are also applied in basic and preclinical science to identify and characterize the auditory function in pharmacological and genetic animal models. Even more, animal models in combination with pharmacological testing are utilized to investigate for potential benefits in the treatment of sensorineural hearing loss (e.g., age- or noise-induced hearing deficits). Here we provide a detailed and integrative description of how to record auditory brainstem-evoked responses (ABRs) in mice using click and tone-burst application. A specific focus of this protocol is on pre-experimental animal housing, anesthesia, ABR recording, ABR filtering processes, automated wavelet-based amplitude growth function analysis, and latency detection.

Brainstem evoked response audiometry is an important tool in clinical neurophysiology. Nowadays, brainstem evoked response audiometry is also applied in the basic science and preclinical studies involving both pharmacological and genetic animal models. Here we provide a detailed description of how auditory brainstem responses can be successfully recorded and analyzed in mice.

マウスにおける脳幹誘発応答オーディオメトリーにおけるデータ獲得と分析

Brainstem evoked response audiometry (BERA) is of central relevance in the clinical neurophysiology. As other evoked potential (EP) techniques, such as ...

Isolating and Culturing Vestibular and Spiral Ganglion Somata from Neonatal Rodents for Patch-Clamp Recordings

The compact morphology of isolated and cultured inner ear ganglion neurons allows for detailed characterizations of the ion channels and neurotransmitter receptors that contribute to cell diversity across this population. This protocol outlines the steps necessary for successful dissecting, dissociating, and short-term culturing of the somata of inner ear bipolar neurons for the purpose of patch-clamp recordings. Detailed instructions for preparing vestibular ganglion neurons are provided with the necessary modifications needed for plating spiral ganglion neurons. The protocol includes instructions for performing whole-cell patch-clamp recordings in the perforated-patch configuration. Example results characterizing the voltage-clamp recordings of hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN)-mediated currents highlight the stability of perforated-patch recording configuration in comparison to the more standard ruptured-patch configuration. The combination of these methods, isolated somata plus perforated-patch-clamp recordings, can be used to study cellular processes that require long, stable recordings and the preservation of intracellular milieu, such as signaling through G-protein coupled receptors.

Presented here are methods providing detailed instructions for dissecting, dissociating, culturing, and patch-clamp recording from vestibular ganglion and spiral ganglion neurons of the inner ear.

パッチクランプ記録のための新生児げっ歯類からの前庭およびらせん状神経節体細胞の分離と培養

The compact morphology of isolated and cultured inner ear ganglion neurons allows for detailed characterizations of the ion channels and neurotransmitter ...

Measuring the Auditory Brainstem Response in Mice

<a href='https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/64286/modified-experimental-conditions-for-noise-induced-hearing-loss-mice'>Source: Lee, D., et. al. Modified Experimental Conditions for Noise-Induced Hearing Loss in Mice and Assessment of Hearing Function and Outer Hair Cell Damage. J. Vis. Exp. (2023)</a>This video demonstrates the measurement of auditory brainstem response (ABR) in a mouse. Electrodes are placed on the head, behind the ear, and near the tail of an anesthetized mouse. Acoustic stimuli at various intensities are delivered, and electric signals generated are recorded as waveforms.

Source: Lee, D., et. al. Modified Experimental Conditions for Noise-Induced Hearing Loss in Mice and Assessment of Hearing Function and Outer Hair Cell ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neuropathology

Neuromuscular Disorders

Perforated Patch-Clamp Recordings of Inner Ear Sensory Neuron Cell Bodies

Source: Iyer, M. R., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/64908">Isolating and Culturing Vestibular and Spiral Ganglion Somata from Neonatal Rodents for Patch-Clamp Recordings.</a> J. Vis. Exp. (2023).
This video demonstrates the patch-clamp technique for measuring ionic currents in inner ear sensory neuron cell bodies. It details the preparation and use of a polished patch-clamp pipette filled with an internal solution containing amphotericin B, which perforates the membrane to allow ion movement while preserving intracellular conditions. Voltage pulses are applied to trigger and record ion channel activity, providing insights into their properties and behavior.

穿孔パッチクランプによる内耳感覚ニューロン細胞体の記録

1. Recording
NOTE: In this procedure, patch-clamp recordings from the isolated ganglion are typically performed 12-24 h after the plating. Other labs have ...

Neurophysiology

Imaging and Optical Techniques

Recording Auditory Brainstem Responses in a Rat Pup

Source: Chang, A. et al., <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/56678">Auditory Brainstem Response and Outer Hair Cell Whole-cell Patch Clamp Recording in Postnatal Rats.</a> J. Vis. Exp. (2018).
This video demonstrates a method for recording auditory brainstem responses (ABRs) from rat pups. It outlines the steps for electrode placement, sound stimulus application, and signal processing analysis in the brainstem to assess neural responses.

ラットの子犬における聴覚脳幹反応の記録

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
1. ...

Electrophysiology Techniques

Whole-Cell Patch Clamp Recordings on Intact Rat Dorsal Root Ganglia

Source: Gong, K.,et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/54287">Patch Clamp Recordings on Intact Dorsal Root Ganglia from Adult Rats.</a> J. Vis. Exp. (2016)
This video demonstrates the examination of sensory neuron excitability in the dorsal root ganglia using the patch clamp technique to measure the rheobase and membrane potential, analyzing the neurons&#39; responses to incremental current injections.

聴性脳幹反応と生後ラットの外有毛細胞細胞パッチ・クランプ記録

要約

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成体ラットから無傷の後根神経節上のパッチクランプ記録

蝸牛内有毛細胞に接触求心性樹状突起でのシナプス後録音：リボンシナプスでのモニタリングの多胞体のリリース

内耳有毛細胞におけるパッチクランプ記録は、単離されたゼブラフィッシュから

難聴の治療のためのトランス鼓膜ドラッグデリバリー

マウスにおける脳幹誘発応答オーディオメトリーにおけるデータ獲得と分析

パッチクランプ記録のための新生児げっ歯類からの前庭およびらせん状神経節体細胞の分離と培養

Measuring the Auditory Brainstem Response in Mice

穿孔パッチクランプによる内耳感覚ニューロン細胞体の記録

ラットの子犬における聴覚脳幹反応の記録

Intact Rat背根神経節の全細胞パッチクランプ記録

聴性脳幹反応と生後ラットの外有毛細胞細胞パッチ ・ クランプ記録

要約

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成体ラットから無傷の後根神経節上のパッチクランプ記録

蝸牛内有毛細胞に接触求心性樹状突起でのシナプス後録音：リボンシナプスでのモニタリングの多胞体のリリース

内耳有毛細胞におけるパッチクランプ記録は、単離されたゼブラフィッシュから

難聴の治療のためのトランス鼓膜ドラッグデリバリー

マウスにおける脳幹誘発応答オーディオメトリーにおけるデータ獲得と分析

パッチクランプ記録のための新生児げっ歯類からの前庭およびらせん状神経節体細胞の分離と培養

Measuring the Auditory Brainstem Response in Mice

穿孔パッチクランプによる内耳感覚ニューロン細胞体の記録

ラットの子犬における聴覚脳幹反応の記録

Intact Rat背根神経節の全細胞パッチクランプ記録

聴性脳幹反応と生後ラットの外有毛細胞細胞パッチ・クランプ記録