この作品は、パリVI大学とピエールファーブルイノベーション助成金によってサポートされていました。

すべての手順は、動物実験（イル=ド=フランス・パリ委員会、認可4270）のためのローカルの倫理委員会の承認を得て、実験動物の管理と使用のための欧州共同体の基準に準拠して行きました。 1.麻酔<ol><li>手術前に成体マウスにペントバルビタール（1ミリグラム/体重10gまで）を腹腔内（27ゲージの針および1-mlの注射器）の致死量を注入。 </li></ol> 2.船舶灌流注：血管灌流の間に目に獣医軟膏を適用する必要はありません。この手順は、（5-10分）迅速であり、動物の死で終わります。つま先のピンチと応答の欠如を確認してください。 <ol><li>ちょうど胸郭の下に、腹壁および腹膜に、虹彩のはさみを使用して、切開を行い、約4センチ。 </li><li> continuその後、振動板に小切開（数ミリ長い）を作成し、E胸郭の全長に沿って振動板の切開は胸膜腔を露出させます。 </li><li>離れて胸骨を持ち上げて、止血剤と胸骨の先端をクランプします。首に止血剤を配置します。慎重に心臓への胸骨を連結する脂肪組織をトリミングします。 </li><li>心尖に左心室を通って15ゲージの灌流針を渡します。 </li><li>最後に、コンセントを作成するために、肝葉の1をカットするはさみを使用しています。 注：代替出口は右心房への切開部を作成するために、虹彩のはさみを使用して作成することができます。 </li><li> 2.5ml /分の速度で作動するポンプを含むリン酸緩衝生理食塩水（PBS）の25〜50ミリリットルで動物を灌流。肝臓は血液のような湯通しをPBSに置換されるべきです。 </li><li>肝臓からの流体が完全にクリアされた後、約5分後、灌流を停止します。 </li><li>免疫染色や定期的な染色が計画されている場合は、パラホルムアルデヒド50mlで動物を灌流（PFA; PBS中4％）で15分間。 注：注意、PFAの煙は有毒です。 PFAと動物の灌流は、換気ドラフト内で行われるべきです。 </li></ol> 3.脳の単離とウィリスのサークル<ol><li> 脳の単離 <ol><li>手術用ハサミで頭を削除します。 </li><li>鼻に首から皮膚に沿って、アイリスハサミで正中切開を行います。 </li><li>頭蓋骨を露出させ、アイリスハサミで任意の残留筋肉や脂肪組織を除去するために皮膚を切り落とします。 </li><li>片側に大後頭孔にアイリスはさみの鋭い端を置き、慎重に（また、外耳道として知られている）外耳道に頭蓋骨の内面に沿って、それらをスライドさせます。 </li><li>対側に3.1.4で説明切開を再現し、矢状縫合の開始に間頭頂骨の内面に沿って切断正中線を作ります。 </li><li>植物アイリス前頭骨ではさみ、右眼の間、矢状縫合で、その後2で頭蓋骨を分割するためにそれらを開きます。 </li><li>嗅球をつかみ、その腹面に神経接続を遮断する虹彩のはさみを使用して、脳を持ち上げます。 </li><li>脳を外し牛の分離のための氷冷PBSを含む60 mmのペトリ皿に入れてください。完全にPBSで脳を浸します。脳は4％PFAで固定した場合（後続セク免疫染色や定期的な染色のため）、24時間4℃で4％PFAの浴に保管してください。 </li></ol></li><li> ウィリス動脈輪の単離 注：解剖顕微鏡をするCoW分離のために必要とされます。脳は全体の手順を通して4℃に保たれるべきです。 <ol><li>牛を可視化するために逆さまに（ すなわち、その背側表面上）脳を置きます。 </li><li> （嗅覚葉の基部で前大脳動脈（ACA）をつかむために、小さな鉗子を使用して、 <strオング&gt;、図1）および及ぼす圧力容器の連続からそれらを分離します。 B（ 図1）に、中大脳動脈（MCA）をカットするために、同じ手順を使用します。 </li><li>皮質から牛を形成する主要な動脈を持ち上げて除去するために鉗子の鋭い端を使用してください。 </li><li>ピンセットで中大脳動脈（MCA）を把持することにより、脳からそれらを切断し、後方の通信動脈（PCA）の開始を持ち上げます。前方動脈（ACAとMCA）をピックアップし、前方、背側方向の視交叉上で静かにそれらを引きます。 CoWの破壊を防止するために、他の動脈に対処するための手順を中断。 </li><li>繰り返しはdorsal-でそれらを引っ張って、3.2.2と優れたと後部小脳動脈（SCA）/（PCA）3.2.3（C、図1）および脳底動脈（BA） の（d、図1）のためのステップ前方方向。私記載された手順の最後で停止nは3.2.4。 </li><li>ピンセットで軽く引っ張ることにより、全体のCoWを削除します。氷冷PBSで満たされた60 mmのペトリ皿に牛を置き、小さなピンで所定の位置に牛を保持し、2鉗子で残っている添付の脳組織を除去します。 </li><li>またはタンパク質の抽出 - その後のRNA精製のための処理（約500 ngのRNAの抽出収率大量のRNA）のために-80℃で収穫したCoWを保管してください。 注：牛は、単離されたマウス嗅覚動脈用に開発された器官槽システムを適合させることにより、24時間のex vivoで維持することができる7。 </li></ol></li></ol><img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54352/54352fig1.jpg" /> 図1：マウス脳牛をハイライト牛は2前大脳動脈（ACA）に由来している2つの内部頚動脈（MCA）、から形成されているの腹側図の略図;。脳底動脈（BA）事後（PCA）と優れた（SCA）に分岐し、脳動脈、および2つの椎骨動脈（VA）。

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The authors have nothing to disclose.

ここではウィリス動脈輪の単離のための再現可能なプロトコルを記述します。牛を含む最も一般的な脳血管障害は、動脈血管の壁に影響を与えるのすべてがCAA関連血管障害、頭蓋内アテローム性動脈硬化症と頭蓋内動脈瘤、です。危険因子にはよく知られているが、これらの脳疾患の分子的病因はよくわかっていないままであり、その発生を予測するための特異的な生物学的マーカーが欠如しています。分子変化と肉眼観察をリンクするトランスジェニックマウスから牛を単離する方法にかなりの関心があります。例えば、（保坂ら 8で説明したように）特定の遺伝子がノックアウトされたマウスモデルで一貫動脈瘤を誘発し、牛を分析することにより、治療がこの遺伝子によってコードされるタンパク質を標的とするかどうかを決定することが可能でなければならない可能性頭蓋内動脈瘤および/またはクモ膜下出血を防ぎます。 Obviouずる、この方法はまた、ADの種々のトランスジェニックマウスモデルにおけるCAA関連血管障害の進行に対する特定の薬物の効果を分析するために使用することができます。 全体のマウスの微小血管を精製するよりも、マウスの動脈を単離することが容易であるが、そのようなサンプリングは、それにもかかわらず、ラットよりもマウスにおいてより困難です。実際、ラット牛により、一度に全体の構造を単離すること、非常に堅い髄膜に埋め込まれています。マウスにおける血管の小さなサイズの問題に加えて、この手順は、脳の除去の前にPBSとの灌流の後の血管の透過性にも厄介です。したがって、我々は、それが簡単に血管を区別することを可能にするために麻酔の後、ステップ3から開始し、注入することなく練習をお勧めします。マウス脳血管が非常に微細で、簡単に破る最後に、解剖はその全体構成を確保するために、急いですることなく、非常に慎重に行うべきです最初のACAをつかむことによって、一体的に隔離されています。 CoW調製物の純度は、神経および血管の遺伝子の発現のレベルを比較することによって評価することができます。 10遺伝子発現 - 練習では、単一の牛は5の研究のためだけに十分なRNAを提供します。大規模なスクリーニングのために、いくつかのマウス牛をプールする必要があります。 ゴーティエら 9は、平滑筋、または培養物中に維持することができ、内皮細胞を生じる（トラップそれらに脳のガラスビーズの断片を消化するためにコラゲナーゼ/ディスパーゼの使用に基づいて）微小血管の小片を単離するための方法を記載しました適切な培地に入れました。本手法の利点は、血管構造を変えることなく、大血管を分離することです。カウ特定枝の解剖も脳diseasに遺伝子発現の特定の分岐のプロファイルと可能感受性との間の相関を決定するために、関心のものであってもよいですこのような頭蓋内動脈瘤などのエス、。このようなアプローチは、いくつかのACA解剖学的および遺伝的変異は、ACA動脈瘤のより高い有病率と相関している理由の説明を提供してもよいです。この解剖牛の単離手順の開始時に、他のブランチからそれを分離するために、各特定の枝の基部に鉗子で発揮する圧力を必要とします。 したがって、それは可能にCoW 10から細胞を誘導するために、または遺伝子発現11およびタンパク質産生12または翻訳後タンパク質修飾をスクリーニングすることに加えて、この方法は、単純にするために開発された器官浴システムを適合させることにより、ex vivoでの研究のために使用することができます単離したマウス嗅覚動脈7抗生物質を含む培地中で全体のCoWのインキュベーションに続いて、この特定の構造により放出secretomeを得て、分析することができます。 CAAのマウスモデルにおいて、このsecretomeの分析は、それ経口になるだろうssible、例えば、これらの脳動脈のCAA関連の炎症状態を決定します。得られた馴化培地は、各血管壁の細胞型の表現型にsecretomeの効果を決定するために使用することができます。病理学のCoW製剤はまた、環状グアノシン一リン酸（cGMP）、サイクリックアデノシン一リン酸（cAMP）のような生化学的シグナルの可能な違いを識別するために使用される、または蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）を用いて検出可能なの Ca 2+濃度、ベースバイオセンサーことができます。ウイルス配信バイオセンサーは、錐体皮質ニューロンと線条体中型有棘ニューロン間のD1応答の深遠な違いの検出につながる、保存形態の実験的にアクセス可能な成熟した生きたニューロンを含む脳スライス標本上で使用されている。13 FRETベースのセカンドメッセンジャーセンサータンパク質14を発現するトランスジェニックマウスにおいて、脳血管疾患のモデル孤立したCoWでの生化学的シグナルのイメージングのために、さらに、これらの疾患の生化学、病態生理、および薬物療法へのさらなる洞察を提供する必要があります。

また、ウィリス（のCoW）、Willisorウィリス多角形のループの円として知られる脳動脈円（大脳動脈輪）は、）最初のそれは、光学キアズマとすることができ、視床下部の周囲に位置する循環吻合である1664にトーマス・ウィリスによって記述されました脳および周囲の構造に血液を供給する中央ハブとみなすこと。血液は、内頸動脈と椎骨動脈を経由してこの構造体に入り、それが内部の中間及び後大脳動脈を経由して、円の外に流れます。これらの動脈の各々は、円の両側の枝を左右しています。完全な円を動脈通信基底、郵便通信、及び前方（ 図1及び図2）。流出動脈のいずれかに血流障害のリスクは、それによって、十分な血液がBに供給されることを保証し、頸動脈および大脳動脈の円に入る血液の融合によって最小化されます雨。この構造は、内頸動脈の重症閉塞性疾患における側副血流のための主経路として機能します。 脳血管障害のいくつかの種類の牛にその起源を持っています。最も一般的には1、2、3これらの障害が原因で血管拡張に低灌流につながる可能性があります。脳アミロイド血管症（CAA）関連血管障害、頭蓋内アテローム性動脈硬化症と頭蓋内動脈瘤であり、脳内および/またはくも膜下出血は、最終的には、虚血性または出血性脳卒中またはに変換しますせいぜい、一過性脳虚血発作。おそらく血管造影法と組み合わせた神経画像などの診断手順における最近の進歩は、それが可能な脳生検を必要とせず、臨床的にこれらの主要な脳血管疾患を診断するために行きました。それにもかかわらず、効果的かつ具体的な治療法（薬理学的または血管内）は、現在不足していると、新しい定義する必要性が存在します分子標的。 ヒトにおけるこれらの疾患の予防のための新規な薬物標的の同定は、動物モデル牛などの脳血管系を単離する方法を必要とします。このようなモデルは、頭蓋内動脈瘤、CAAまたは頭蓋内アテローム性動脈硬化症の動物モデルにおける大血管の壁に生じる、炎症性変化を含む特定の変更、にの証拠や手がかりを提供する必要があります。4、5、6 当社は、CAAのようなアルツハイマー病（AD）における血管の炎症の研究および関連疾患を容易にするために、マウスのCoWを単離するための方法を確立しました。マウスの牛を単離するためのこの方法は、疾患の進行中の炎症性脳血管遺伝子発現の評価のために開発されました。一緒に軟膜および軟膜動脈の壁内のアミロイドβ沈着の検出と、この方法は、簡単に阻止するために作ることができます鉱山炎症性脳血管壁での遺伝子発現およびAβペプチドの蓄積の間の可能な関係。くも膜下空間内の軟膜および軟膜を含む脳の血管網は、ウィリス動脈輪を形成する大きな動脈の拡張です。ここに記載された方法は、任意のマウス系統の牛を単離するために使用することができ、マウスの脳血管系の大きな血管のスクリーニング（ 例えば 、遺伝子発現、タンパク質産生、および翻訳後タンパク質修飾）すべてのタイプのために使用することができます。

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Phosphate Buffered Saline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #55 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>Hardened Fine Iris Scissors&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>14090-11</td><td></td></tr><tr><td>Scissors - Straight / Sharp / Sharp&amp;nbsp;&amp;nbsp; 16.5 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>14002-16</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #7b Forceps&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>11270-20</td><td></td></tr><tr><td>Stereoscopic Zoom Microscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ745T</td><td></td></tr><tr><td>CellBIND Surface 60mm Culture Dish</td><td>Corning</td><td>#3295</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltic Pump - MINIPULS 3</td><td>Gilson</td><td>M312</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital Sodique</td><td>Ceva Sant&amp;eacute; Animale</td><td>FR/V/2770465 3/1992</td><td></td></tr></tbody></table>

protocol for isolating the mouse circle of willis

ウィリス（のCoW）の大脳動脈輪（大脳動脈輪）または円は、脳や周囲の構造に血液を供給する光学キアズマと視床下部を取り囲む循環吻合術です。これは、脳アミロイド血管症（CAA）関連血管障害、頭蓋内アテローム性動脈硬化症と頭蓋内動脈瘤を含むいくつかの脳血管障害、に関与しています。その予防のための新規な薬物標的の同定のために、これらの疾患の根底にある分子メカニズムの研究は、動物モデルを必要とします。他のものは、ここで説明CoW.The方法は、任意のマウス系統でのCoW分離に適しており、（タンパク質産生の遺伝子の発現をスクリーニングするための大きな可能性を有しているなどの、脳血管系の単離を含むであろう一方、これらのモデルのいくつかは、トランスジェニックであってもよいです翻訳後タンパク質修飾など secretome分析、）マウスの脳の大型船舶に関する研究血管系。それはまた、単離されたマウスの嗅覚動脈のために開発された臓器槽システムを適合させることにより、ex vivoでの研究のために使用することができます。

<html> PBS-灌流マウスが殺され、プロトコルのセクション3.2で説明したようにCoWが単離されます。解剖が正しく実行されると、牛は一枚で出てくるべきであるとによる血管系の残留血液の不在にわずかに透明であるべきです。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54352/54352fig2.jpg" /> 図2： 分離後のマウスのCoW。 10-cmのペトリ皿中のCoWの（A）の概要。（B）のCoWの様々な枝の詳細。中大脳動脈のためのMCA、前大脳動脈、脳底動脈のためのBAのためのACA、PCA優れた脳動脈のための後大脳動脈とSCAのために。 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54352/54352fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 10トン。 &quot;FO：キープtogether.withinページ=&quot; 1 &quot;&gt;のCoW調製物の純度は、ニューロンの遺伝子の発現が検出不可能であるのに対し、特定の血管の遺伝子が強く発現していることを確実にすることによって確認することができます具体的には、洗浄牛はすべき具体的には、平滑筋アクチン（SMA）、平滑筋ミオシン重鎖（SM-MHC）およびsmoothelinなどの血管平滑筋細胞マーカーを発現する。これらのマーカーはほとんど脳の他の部分で発現される。発現の反対側のパターンがあるべきCoWでのみわずかに検出ニューロンマーカー（モグ、マップMap2）で、神経細胞の遺伝子を得ました。 mRNAのレベルは、基準遺伝子転写物（ここで、GAPDHのそれ）に正規化相対してRT-qPCRにより評価することができます。典型的な結果を図3AおよびBに示されています。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54352/54352fig3.jpg" /&gt; 図 3： ウィリスと脳のマウスサークルにおける神経および収縮遺伝子の発現のRT-qPCRの結果は、参照遺伝子（GAPDH）のものに対して正規化しました。それらは、6〜12の独立した実験の平均±SDとして表されます。脳とのCoWの比較：NS、有意ではない、*、P &lt;0.05、**、P &lt;0.005、及び***、P &lt;0.001収縮遺伝子の（A）式：SMA（平滑筋アクチン）、 smoothelin、SM-MHC（平滑筋ミオシン重鎖11）とE-セレクチン神経遺伝子の（B）式：モグ（ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質）とMap2の（微小管関連タンパク質2）。 牛を欠く脳における内皮マーカーE-セレクチンの発現パターンは、おそらく脳の毛細血管網の存在を反映して、ウシのサンプルについて得られたものと非常に類似しています。 <stronグラム&gt;表1は、各転写物の平均Cpの番号を示します。 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> A. </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td rowspan="2"> 平均のCp </td><td colspan="3"> GAPDH </td><td colspan="3"> SMA </td><td colspan="3"> Smoothelin </td><td colspan="3"> SM-MHC </td><td colspan="3"> E-SEL </td></tr><tr><td> 平均 </td><td> SD </td><td> N </td><td> 平均 </td><td> SD </td><td> N </td><td> 平均 </td><td> SD </td><td> N </強いです&gt; </td><td> 平均 </td><td> SD </td><td> N </td><td> 平均 </td><td> SD </td><td> N </td></tr><tr><td> 牛 </td><td> 20.86 </td><td> 0.93 </td><td> 12 </td><td> 22.02 </td><td> 0.67 </td><td> 12 </td><td> 25.29 </td><td> 1.89 </td><td> 12 </td><td> 23.37 </td><td> 0.80 </td><td> 12 </td><td> 30.56 </td><td> 1.66 </td><td> 12 </td></tr><tr><td> 脳 </td><td> 18.71 </td><td> 0.72 </td><td> 6 </td><td> 33.91 </td><td> 2.06 </td><td> 6 </td><td> 31.08 </td><td> 3.17 </td><td> 6 </td><td> 26.05 </td><td> 0.73 </td><td> 6 </td><td> 28.45 </td><td> 0.63 </td><td> 6 </td></tr><tr><td> B. </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td> &lt;TD&gt; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td rowspan="2"> 平均のCp </td><td colspan="3"> GAPDH </td><td colspan="3"> モグ </td><td colspan="3"> マップ2 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 平均 </td><td> SD </td><td> N </td><td> 平均 </td><td> SD </td><td> N </td><td> 平均 </td><td> SD </td><td> N </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 牛 </td><td> 21.04 </td><td> 0.41 </td><td> 6 </td><td> 32.13 </td><td> 1.63 </td><td> 6 </td><td> 30.21 </td><td> 0.85 </td><td> 6 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 脳 </td><td> 19.09 </td><td> 0.49 </td><td> 6 </td><td> 26.43 </td><td> 0.88 </td><td> 6 </td><td> 23.30 </td><td> 150 </td><td> 6 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> 表1： 平均クロッシングポイントウィリスと脳のマウスサークルにおける神経および収縮遺伝子の発現のための計算は、蛍光の一定のレベルにポイント（CP）を交配することによって決定され、正確なサイクルの比較に基づいています。交差点は、増幅曲線の最大二次導関数に対応するサイクル数です。より高いCp値は、発現の低いレベルと関連しています。 Cpは参照遺伝子の35（A）のCp超えた場合、所定の遺伝子については、発現が検出不能であると考えられている：GAPDHを、そして、収縮遺伝子の：SMA、smoothelin、SM-MHCおよびE-セレクチン参照遺伝子の（B）のCp：GAPDH;およびニューロンの遺伝子：モグとマップ2。

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Protocol for Isolating the Mouse Circle of Willis

We describe here a reproducible protocol for isolating the mouse circle of Willis.

ウィリスのマウスサークルを単離するためのプロトコル

The cerebral arterial circle (circulus arteriosus cerebri) or circle of Willis (CoW) is a circulatory anastomosis surrounding the optic chiasma and ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.0K ビュー.  Sorbonne Universités. We describe here a reproducible protocol for isolating the mouse circle of Willis.

ビデオ: Protocol for Isolating the Mouse Circle of Willis

A Murine Model of Myocardial Ischemia-reperfusion Injury through Ligation of the Left Anterior Descending Artery

Acute or chronic myocardial infarction (MI) are cardiovascular events resulting in high morbidity and mortality. Establishing the pathological mechanisms at work during MI and developing effective therapeutic approaches requires methodology to reproducibly simulate the clinical incidence and reflect the pathophysiological changes associated with MI. Here, we describe a surgical method to induce MI in mouse models that can be used for short-term ischemia-reperfusion (I/R) injury as well as permanent ligation. The major advantage of this method is to facilitate location of the left anterior descending artery (LAD) to allow for accurate ligation of this artery to induce ischemia in the left ventricle of the mouse heart. Accurate positioning of the ligature on the LAD increases reproducibility of infarct size and thus produces more reliable results. Greater precision in placement of the ligature will improve the standard surgical approaches to simulate MI in mice, thus reducing the number of experimental animals necessary for statistically relevant studies and improving our understanding of the mechanisms producing cardiac dysfunction following MI. This mouse model of MI is also useful for the preclinical testing of treatments targeting myocardial damage following MI.

We introduce a surgical method to induce experimental ischemia/reperfusion (I/R) injury to simulate myocardial infarction (MI) in mouse models that allows for more clarity in positioning of the ligation on the left anterior descending artery (LAD) to increase the reproducibility of MI experiments in mice.

左前下の動脈の結紮を通して心筋虚血再灌流傷害のマウスモデル

Acute or chronic myocardial infarction (MI) are cardiovascular events resulting in high morbidity and mortality. Establishing the pathological mechanisms ...

医学

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident cells. A key mechanism of this inflammatory response is the migration of circulating immune cells to the ischemic brain facilitated by chemokine release and increased endothelial adhesion molecule expression. Brain-invading leukocytes are well-known contributing to early-stage secondary ischemic injury, but their significance for the termination of inflammation and later brain repair has only recently been noticed.
Here, a simple protocol for the efficient isolation of immune cells from the ischemic mouse brain is provided. After transcardial perfusion, brain hemispheres are dissected and mechanically dissociated. Enzymatic digestion with Liberase&#160;is followed by density gradient (such as Percoll) centrifugation to remove myelin and cell debris. One major advantage of this protocol is the single-layer density gradient procedure which does not require time-consuming preparation of gradients and can be reliably performed. The approach yields highly reproducible cell counts per brain hemisphere and allows for measuring several flow cytometry panels in one biological replicate. Phenotypic characterization and quantification of brain-invading leukocytes after experimental stroke may contribute to a better understanding of their multifaceted roles in ischemic injury and repair.

Inflammation plays a central role in the pathogenesis of ischemic stroke. Increasing evidence suggests that it acts as a double-edged sword which exacerbates early brain injury, but also contributes to later repair. This protocol describes the isolation of immune cells from the ischemic brain and their subsequent flow cytometric phenotyping.

虚血性マウス脳からの免疫細胞の単離およびフローサイトメトリー分析

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

免疫・感染学

Conjunctival Commensal Isolation and Identification in Mice

The ocular surface was once considered immune privileged and abiotic, but recently it appears that there is a small, but persistent commensal presence. Identification and monitoring of bacterial species at the ocular mucosa have been challenging due to their low abundance and limited availability of appropriate methodology for commensal growth and identification. There are two standard approaches: culture based or DNA sequencing methods. The first method is problematic due to the limited recoverable bacteria and the second approach identifies both live and dead bacteria leading to an aberrant representation of the ocular space. We developed a robust and sensitive method for bacterial isolation by building upon standard microbiological culturing techniques. This is a swab-based technique, utilizing an &#8220;in-lab&#8221; made thin swab that targets the lower conjunctiva, followed by an amplification step for aerobic and facultative anaerobic genera. This protocol has allowed us to isolate and identify conjunctival species such as Corynebacterium spp., Coagulase Negative Staphylococcus spp., Streptococcus spp., etc. The approach is suitable to define commensal diversity in mice under different disease conditions.

Presented here is a protocol for the isolation and amplification of aerobic and facultative anaerobic mouse conjunctival commensal bacteria using a unique eye swab and culture-based enrichment step with subsequent identification by microbiological based methods and MALDI-TOF mass spectrometry.

マウスにおける結膜経月の分離と同定

The ocular surface was once considered immune privileged and abiotic, but recently it appears that there is a small, but persistent commensal presence. ...

Isolation of Primary Mouse Hepatocytes for Nascent Protein Synthesis Analysis by Non-radioactive L-azidohomoalanine Labeling Method

Hepatocytes are parenchymal cells of the liver and engage multiple metabolic functions, including synthesis and secretion of proteins essential for systemic energy homeostasis. Primary hepatocytes isolated from the murine liver constitute a valuable biological tool to understand the functional properties or alterations occurring in the liver. Herein we describe a method for the isolation and culture of primary mouse hepatocytes by performing a two-step collagenase perfusion technique and discuss their utilization for investigating protein metabolism. The liver of an adult mouse is sequentially perfused with ethylene glycol-bis tetraacetic acid (EGTA) and collagenase, followed by the isolation of hepatocytes with the density gradient buffer. These isolated hepatocytes are viable on culture plates and maintain the majority of endowed characteristics of hepatocytes. These hepatocytes can be used for assessments of protein metabolism including nascent protein synthesis with non-radioactive reagents. We show that the isolated hepatocytes are readily controlled and comprise a higher quality and volume stability of protein synthesis linked to energy metabolism by utilizing the chemo-selective ligation reaction with a Tetramethylrhodamine (TAMRA) protein detection method and western blotting analyses. Therefore, this method is valuable for investigating hepatic nascent protein synthesis linked to energy homeostasis. The following protocol outlines the materials and methods for the isolation of high-quality primary mouse hepatocytes and detection of nascent protein synthesis.

Here, we present a protocol for the isolation of healthy and functional primary mouse hepatocytes. Instructions for detecting hepatic nascent protein synthesis by non-radioactive labeling substrate were provided to help understand the mechanisms underlying protein synthesis in the context of energy-metabolism homeostasis in the liver.

非放射性 L azidohomoalanine ラベル法による新生タンパク質合成解析用プライマリ マウス肝細胞の分離

Hepatocytes are parenchymal cells of the liver and engage multiple metabolic functions, including synthesis and secretion of proteins essential for ...

孤立した視床下部ニューロンのホルモン、代謝、および電気調節

Isolation of Targeted Hypothalamic Neurons for Studies of Hormonal, Metabolic, and Electrical Regulation

The hypothalamus regulates fundamental metabolic processes by controlling functions as varied as food intake, body temperature, and hormone release. As the functions of the hypothalamus are controlled by specific subsets of neuronal populations, the ability to isolate them provides a major tool for studying metabolic mechanisms. In this regard, the neuronal complexity of the hypothalamus poses exceptional challenges. 
For these reasons, new techniques, such as Magnetic-Activated Cell Sorting (MACS), have been explored. This paper describes a new application of magnetic-activated cell sorting (MACS) using microbead technology to isolate a targeted neuronal population from prenatal mice brains. The technique is simple and guarantees a highly pure and viable primary hypothalamic neuron culture with high reproducibility. The hypothalamus is gently dissociated, neurons are selectively isolated and separated from glial cells, and finally, using a specific antibody for a cell surface marker, the population of interest is selected. 
Once isolated, targeted neurons can be used to investigate their morphological, electrical, and endocrine characteristics and their responses in normal or pathological conditions. Furthermore, given the variegated roles of the hypothalamus in regulating feeding, metabolism, stress, sleep, and motivation, a closer look at targeted and region-specific neurons may provide insight into their tasks in this complex environment.

著者スポットライト:視床下部神経メカニズムの洞察 

Here we present a protocol to grow specific hypothalamic cell subtypes in culture. The cells can be selected based on opportune/unique membrane markers and used in many applications, including immunofluorescence, electrophysiological, and biochemical assays.

ホルモン、代謝、および電気的制御の研究のための標的視床下部ニューロンの分離

The hypothalamus regulates fundamental metabolic processes by controlling functions as varied as food intake, body temperature, and hormone release. As ...

神経科学

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs from the coronary circulation. Hearts with intact aortic arches were removed and perfused via retrograde Langendorff with digestion solution containing 300 Units/ml of collagenase type II, 0.1 mg/ml soybean trypsin inhibitor and 1 M CaCl2. The perfusates were collected at 15 min intervals for 90 min, pelleted by centrifugation, resuspended in plating media, and plated on tissue culture dishes. VSMCs were characterized by presence of SM22&#945;, &#945;-SMA, and vimentin. One of the main advantages of using this technique is the ability to isolate VSMCs from the coronary circulation of mice. Although the small number of cells obtained can limit some of the applications for which the cells can be utilized, isolated coronary VSMCs can be used in a variety of well-established cell culture techniques and assays. Studies investigating VSMCs from genetically modified mice can provide further information about structure-function and signaling processes associated with vascular pathologies.

The purpose of this protocol is to demonstrate the isolation and culture techniques of murine primary vascular smooth muscle cells (VSMCs) from the coronary circulation. Once VSMCs have been isolated, they can be used for many standard culture techniques.

マウス冠動脈血管平滑筋細胞の単離

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

生物学

En Face Preparation of Mouse Blood Vessels

Sections of paraffin embedded tissues are routinely used for studying tissue histology and histopathology. However, it is difficult to determine what the three-dimensional tissue morphology is from such sections. In addition, the sections of tissues examined may not contain the region within the tissue that is necessary for the purpose of the ongoing study. This latter limitation hinders histopathological studies of blood vessels since vascular lesions develop in a focalized manner. This requires a method that enables us to survey a wide area of the blood vessel wall, from its surface to deeper regions. A whole mount en face preparation of blood vessels fulfills this requirement. In this article, we will demonstrate how to make en face preparations of the mouse aorta and carotid artery and to immunofluorescently stain them for confocal microscopy and other types of fluorescence-based imaging.

En Face Preparation of Mouse Blood Vessels

A procedure for making en face preparations of the mouse carotid artery and aorta is described. Such preparations, when immunofluorescently stained with specific antibodies, enable us to study localization of proteins and identification of cell types within the entire vascular wall by confocal microscopy.

マウスの血管の顔面準備

Sections of paraffin embedded tissues are routinely used for studying tissue histology and histopathology. However, it is difficult to determine what the ...

A Simple and Effective Method to Consistently Isolate Mouse Cardiomyocytes

The need for reproducible yet technically simple methods yielding high-quality cardiomyocytes is essential for research in cardiac biology. Cellular and molecular functional experiments (e.g., contraction, electrophysiology, calcium cycling, etc.) on cardiomyocytes are the gold standard for establishing mechanism(s) of disease. The mouse is the species of choice for functional experiments and the described technique is specifically for the isolation of mouse cardiomyocytes. Previous methods requiring a Langendorff apparatus require high levels of training and precision for aortic cannulation, often resulting in ischemia. The field is shifting toward Langendorff-free isolation methods that are simple, are reproducible, and yield viable myocytes for physiological data acquisition and culture. These methods greatly diminish ischemia time compared to aortic cannulation and result in reliably obtained cardiomyocytes. Our adaptation to the Langendorff-free method includes an initial perfusion with ice-cold clearing solution, use of a stabilizing platform that ensures a steady needle during perfusion, and additional digestion steps to ensure reliably obtained cardiomyocytes for use in functional measurements and culture. This method is simple and quick to perform and requires little technical skill.

The gold standard in cardiology for cellular and molecular functional experiments are cardiomyocytes. This article describes adaptations to the non-Langendorff technique to isolate mouse cardiomyocytes.

マウス心筋細胞を一貫して単離するための簡単で効果的な方法

The need for reproducible yet technically simple methods yielding high-quality cardiomyocytes is essential for research in cardiac biology. Cellular and ...

ウィリスのマウスサークルを単離するためのプロトコル

要約

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左前下の動脈の結紮を通して心筋虚血再灌流傷害のマウスモデル

虚血性マウス脳からの免疫細胞の単離およびフローサイトメトリー分析

マウスにおける結膜経月の分離と同定

非放射性 L azidohomoalanine ラベル法による新生タンパク質合成解析用プライマリマウス肝細胞の分離

ホルモン、代謝、および電気的制御の研究のための標的視床下部ニューロンの分離

ホルモン、代謝、および電気的制御の研究のための標的視床下部ニューロンの分離

ホルモン、代謝、および電気的制御の研究のための標的視床下部ニューロンの分離

マウス冠動脈血管平滑筋細胞の単離

マウスの血管の顔面準備

マウス心筋細胞を一貫して単離するための簡単で効果的な方法

ウィリスのマウスサークルを単離するためのプロトコル

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左前下の動脈の結紮を通して心筋虚血再灌流傷害のマウスモデル

虚血性マウス脳からの免疫細胞の単離およびフローサイトメトリー分析

マウスにおける結膜経月の分離と同定

非放射性 L azidohomoalanine ラベル法による新生タンパク質合成解析用プライマリ マウス肝細胞の分離

ホルモン、代謝、および電気的制御の研究のための標的視床下部ニューロンの分離

ホルモン、代謝、および電気的制御の研究のための標的視床下部ニューロンの分離

ホルモン、代謝、および電気的制御の研究のための標的視床下部ニューロンの分離

マウス冠動脈血管平滑筋細胞の単離

マウスの血管の顔面準備

マウス心筋細胞を一貫して単離するための簡単で効果的な方法

非放射性 L azidohomoalanine ラベル法による新生タンパク質合成解析用プライマリマウス肝細胞の分離