Este trabajo fue apoyado por la Universidad de París VI y una donación de Pierre Fabre Innovación.

Todos los procedimientos se realizaron de conformidad con las normas de la Comunidad Europea para el cuidado y uso de animales de laboratorio, con la aprobación del comité de ética local de la experimentación con animales (Ile de France-Paris-Comité, Autorización 4270). 1. anestesia <ol><li> Infundir una dosis letal de pentobarbital (hasta 1 mg / 10 g de peso corporal) (aguja de calibre 27 y una jeringa de 1 ml) por vía intraperitoneal en ratones adultos antes de la cirugía. </li></ol> La perfusión 2. Embarcación NOTA: No hay necesidad de aplicar el ungüento veterinario para los ojos durante la perfusión del vaso. Este procedimiento es rápido (5-10 minutos) y termina en la muerte del animal. Confirmar la falta de respuesta con una pizca dedo del pie. <ol><li> Usando tijeras iris, hacer una incisión, de aproximadamente 4 cm de longitud, en la pared abdominal y el peritoneo, justo debajo de la caja torácica. </li><li> Hacer una pequeña incisión (unos pocos milímetros de largo) en el diafragma y luego continue la incisión de la membrana a lo largo de toda la longitud de la caja torácica para exponer la cavidad pleural. </li><li> Levantar el esternón y la abrazadera de distancia de la punta del esternón con la pinza hemostática; colocar la pinza hemostática en el cuello. Con cuidado, recortar el tejido adiposo que conecta el esternón hasta el corazón. </li><li> Pasar la aguja de perfusión de calibre 15 a través del ventrículo izquierdo en el vértice del corazón. </li><li> Por último, utilizar tijeras para cortar uno de los lóbulos del hígado para crear una toma de corriente. NOTA: Una salida alternativa se puede crear mediante el uso de tijeras iris para crear una incisión en la aurícula derecha. </li><li> Perfundir el animal con 25 a 50 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) con una bomba que funciona a una velocidad de 2,5 ml / min. El hígado debe Blanch como la sangre se sustituye con PBS. </li><li> Después de aproximadamente cinco minutos, una vez que el fluido desde el hígado está completamente claro, detener la perfusión. </li><li> Si se planea inmunotinción o tinción regular, perfundir el animal con 50 ml de paraformaldehído(PFA; 4% en PBS) durante 15 min. NOTA: Precaución, humos PFA son tóxicos. La perfusión del animal con PFA debe llevarse a cabo en una campana de humos ventilada. </li></ol> 3. El aislamiento del cerebro y el Círculo de Willis <ol><li> Aislamiento del cerebro <ol><li> Retire la cabeza con un par de tijeras quirúrgicas. </li><li> Hacer una incisión en la línea media con tijeras iris, a lo largo de la piel desde el cuello hasta la nariz. </li><li> Se quita la piel para exponer el cráneo y eliminar los músculos y los tejidos adiposos residuales con unas tijeras iris. </li><li> Coloque el extremo agudo de la tijera iris en el foramen magnum en un lado y deslice con cuidado a lo largo de la superficie interna del cráneo al meato auditivo externo (también conocido como el canal auditivo). </li><li> Reproducir la incisión se describe en 3.1.4 en el lado contralateral y hacer un corte a lo largo de la línea media de la superficie interior del hueso inter-parietal del inicio de la sutura sagital. </li><li> Plantar el iristijeras en el hueso frontal, justo entre los ojos, en la sutura sagital y luego abrirlas para dividir el cráneo en dos. </li><li> Levante el cerebro, el acaparamiento de los bulbos olfatorios y el uso de las tijeras iris para cortar las conexiones nerviosas en su superficie ventral. </li><li> Retire el cerebro y lo coloca en una placa de Petri de 60 mm que contenía PBS helado para el aislamiento de vaca. Sumerja por completo el cerebro en el PBS. Si el cerebro se fijó con PFA al 4% (para la sección posterior y la inmunotinción o manchas regular), guardarlo en un baño de PFA al 4% a 4 ° C durante 24 horas. </li></ol></li><li> El aislamiento del polígono de Willis NOTA: Se requiere un microscopio de disección para el aislamiento de vaca. El cerebro debe mantenerse a 4 ° C durante todo el procedimiento. <ol><li> Ponga el cerebro al revés (es decir, en su superficie dorsal) para visualizar la vaca. </li><li> Utilizar unas pequeñas pinzas para agarrar las arterias cerebrales anteriores (ACA) en la base de los lóbulos olfativos ( <strong&gt; a, Figura 1) y ejercer presión para disociarlos del continuo buque. Utilice el mismo procedimiento para cortar las arterias cerebral media (MCA) en B (figura 1). </li><li> Usa los extremos afilados de las pinzas para levantar y quitar las arterias principales que forman la vaca de la corteza. </li><li> Levantar el inicio de las arterias comunicante posterior (PCA) para desconectarlos de cerebro, sujetando las arterias cerebrales medias (MCA) con los fórceps. Recoger las arterias anterior (ACA y MCA) y tirar de ellos suavemente sobre el quiasma óptico en una dirección anterior-dorsal. Para evitar la interrupción de la vaca, interrumpir el procedimiento para hacer frente a las otras arterias. </li><li> Repetir los pasos 3.2.2 y 3.2.3 de las arterias cerebelosas superior y posterior (SCA) / (PCA) (C, figura 1) y para la arteria basilar (BA) (d, Figura 1), tirando de ellos en un dorsal- dirección anterior. Detener al final del procedimiento descrito in 3.2.4. </li><li> Retire toda la vaca por tirando suavemente con las pinzas. Coloque la vaca en un plato de 60 mm de Petri llena de helado de PBS y remover el tejido cerebral unida restante con dos pinzas, la celebración de la vaca en su lugar con pequeños alfileres. </li><li> Mantenga el CoW cosechado a -80 ° C para su posterior procesamiento para la purificación de ARN (rendimientos de extracción de ARN de grandes cantidades de ARN - aproximadamente 500 ng) o la extracción de proteínas. Nota: La vaca se puede mantener ex vivo durante 24 horas, adaptando el sistema de baño de órganos desarrollado por la arteria olfativa aislada del ratón 7. </li></ol></li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54352/54352fig1.jpg" /> Figura 1: Diagrama esquemático de una vista ventral del cerebro de ratón Destacando Comité de lo que la vaca se forma a partir de las dos arterias carótidas internas (MCA), que se derivan de las dos arterias cerebrales anteriores (ACA);. la basilararteriales (BA) se ramifica en el posterior (ACP) y superior (SCA) arterias cerebrales, y dos arterias vertebrales (VA).

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The authors have nothing to disclose.

Se describe aquí un protocolo reproducible para el aislamiento del círculo de Willis. Los trastornos cerebrovasculares más comunes que implican el CdT son vasculopatías CAA-asociado, aterosclerosis intracraneal y aneurisma intracraneal, todos los cuales afectan a las paredes de los vasos arteriales. Los factores de riesgo son bien conocidos, pero la patogénesis molecular de estos trastornos cerebrales sigue siendo poco conocida y los marcadores biológicos específicos para predecir su ocurrencia son insuficientes. Existe un considerable interés en los métodos para el aislamiento de la vaca de ratones transgénicos para enlazar observaciones macroscópicas con cambios moleculares. Por ejemplo, mediante la inducción de los aneurismas consistente en un modelo de ratón en el que un gen particular es eliminado (como se describe por Hosaka et al., 8) y el análisis de la vaca, que debería ser posible determinar si los tratamientos de orientación de la proteína codificada por este gen podría prevenir los aneurismas intracraneales y / o hemorragia subaracnoidea. Obviouastuto, este método también se podría usar para analizar el efecto de un medicamento en particular en la progresión de vasculopatías CAA-asociado en los diversos modelos de ratones transgénicos de la EA. Es más fácil de aislar las arterias de ratón que para purificar enteras microvasos de ratón, pero tal muestreo es sin embargo más difícil en ratones que en ratas. De hecho, la vaca rata está incrustado en meninges mucho más rígido, por lo que es posible aislar toda la estructura de una sola vez. Además del problema del pequeño tamaño de los vasos en ratones, este procedimiento también es complicado debido a la transparencia de los vasos después de su perfusión con PBS antes de la eliminación del cerebro. Por lo tanto, se recomienda la práctica sin la infusión, a partir del paso 3 después de la anestesia para que sea más fácil distinguir los vasos sanguíneos. Finalmente, como los vasos cerebrales de ratón son muy finas y se rompen con facilidad, la disección debe realizarse con mucho cuidado, sin prisas, para asegurar que toda la estructuraestá aislado en una sola pieza, por primera acaparamiento de la ACA. La pureza de la preparación vaca puede ser evaluada mediante la comparación de los niveles de expresión de los genes neuronales y de los vasos. Con la práctica, una sola vaca sólo proporciona suficiente ARN para el estudio de 5 - 10 expresiones de genes. Para el cribado a gran escala, varias vacas ratón, se mezclarán. Gauthier et al. 9 describe un método para aislar pequeñas piezas de microvasos (basado en el uso de la colagenasa / dispasa de digerir los fragmentos de cerebro y de perlas de vidrio para atrapar ellos) que produce el músculo liso o células endoteliales que puede ser mantenida en cultivo cuando colocado en un medio apropiado. La ventaja de nuestro método es que aísla los vasos grandes, sin alterar la estructura del vaso. La disección de las ramas específicas de la vaca también puede ser de interés, para determinar la correlación entre el perfil de expresión génica de una rama particular y la posible susceptibilidad a diseas cerebrovasculareses, como aneurismas intracraneales. Tales enfoques pueden proporcionar una explicación de por qué algunas variaciones anatómicas y genéticas ACA se correlacionan con una mayor prevalencia de los aneurismas de la ACA. Esta disección requiere presión para ser ejercida con pinzas en la base de cada rama específica, para disociar de las otras ramas, en el inicio del procedimiento de aislamiento vaca. Por lo tanto, además de lo que es posible obtener células de la vaca 10 o a la pantalla para la expresión 11 y la producción de proteínas de genes 12 o modificaciones de las proteínas posteriores a la traducción, este método se puede utilizar para los estudios ex vivo, por simple adaptación del sistema de baño de órganos desarrollado para aislados de ratón. arterias olfativas 7 Después de la incubación de toda la vaca en antibióticos que contienen medio de cultivo, secretoma dado a conocer por esta estructura específica pueden ser obtenidos y analizados. Un análisis de este secretoma en modelos de ratón de CAA haría possible, por ejemplo, para determinar el estado inflamatorio relacionado CAA-de estas arterias cerebrales. El medio condicionado resultante también podría ser utilizado para determinar los efectos de la secretoma en cada pared del vaso tipo de célula fenotipo. Preparaciones vaca patológicos también se podrían utilizar para identificar las posibles diferencias en las señales bioquímicas, tales como monofosfato cíclico de guanosina (cGMP), monofosfato de adenosina cíclico (cAMP), o Ca 2 + concentraciones, detectables con transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET) biosensores basados. Biosensores virus entregados se han utilizado en el tramo preparativos cerebro que contienen las neuronas maduras de vida experimentalmente accesibles con una morfología conservada, lo que lleva a la detección de profundas diferencias en la respuesta D1 entre las neuronas corticales piramidales y las neuronas espinosas medias del cuerpo estriado. 13 El modelado de las enfermedades cerebrovasculares en los ratones transgénicos que expresan proteínas sensor de segundo mensajero basado en FRET 14para la obtención de imágenes de señales bioquímicas en el aislado de la vaca debe proporcionar más una mayor comprensión de la bioquímica, la fisiopatología y el tratamiento farmacológico de estas enfermedades.

El círculo arterial cerebral (circulus arterioso cerebri), también conocido como el polígono de Willis (vaca), el lazo de Willisor Willis polígono) fue descrito por primera vez por Thomas Willis en 1664. Es una anastomosis circulatorio situado alrededor del quiasma óptico y el hipotálamo que pueden ser considerado como un eje central el suministro de sangre al cerebro y las estructuras circundantes. La sangre entra en esta estructura a través de la carótida interna y las arterias vertebrales y fluye fuera del círculo a través de la mitad interior y las arterias cerebrales posteriores. Cada una de estas arterias ha ramas izquierda y derecha de cada lado del círculo. El basilar, puesto comunicación, y la comunicación de las arterias completa el círculo anterior (Figura 1 y Figura 2). El riesgo de alteración del flujo sanguíneo en cualquiera de las arterias de salida de flujo se reduce al mínimo por la fusión de sangre que entra en el círculo de la carótida y las arterias cerebrales, garantizando de este modo que la sangre suficiente se suministra a la blluvia. Esta estructura también sirve como la principal vía de flujo sanguíneo colateral en enfermedades oclusivas graves de la arteria carótida interna. Existen varios tipos de trastornos cerebrovasculares tienen su origen en la vaca. Los más comunes son la angiopatía amiloide cerebral (CAA) -asociado vasculopatías, la aterosclerosis intracraneal y los aneurismas intracraneales. 1, 2, 3 Estos trastornos pueden conducir a la hipoperfusión debido a la vasodilatación, e intracerebral y / o hemorragias subaracnoideas en última instancia se traduce en accidentes cerebrovasculares hemorrágicos o isquémicos o , a lo sumo, un ataque isquémico transitorio. Los recientes avances en los procedimientos de diagnóstico, incluyendo neuroimagen, posiblemente combinado con la angiografía, han hecho posible diagnosticar estas enfermedades cerebrovasculares importantes clínicamente, sin la necesidad de una biopsia cerebral. Sin embargo, los tratamientos eficaces y específicos (farmacológicos o endovasculares) la actualidad se carece y por lo tanto hay una necesidad de definir nuevosdianas moleculares. La identificación de nuevos objetivos de medicamentos para la prevención de estas enfermedades en los seres humanos requerirá modelos animales y formas de aislar el cerebro-vascular incluyendo la vaca. Estos modelos deben proporcionar evidencia de pistas y de los cambios específicos, incluyendo los cambios inflamatorios, que se producen en las paredes de los grandes vasos en modelos animales de aneurisma de la arteria intracraneal, AAC o aterosclerosis intracraneal. 4, 5, 6 Hemos establecido un método para el aislamiento CdT ratón para facilitar los estudios de inflamación de los vasos en la enfermedad de Alzheimer (AD) y enfermedades relacionadas, tales como la CAA. Este método para el aislamiento de la CoW ratón fue desarrollado para la evaluación de la expresión génica inflamatoria cerebrovascular durante la progresión de la enfermedad. Junto con la detección de la deposición de amiloide beta dentro de las paredes de las arterias y leptomeníngeo pial, este método podría hacer más fácil para disuadirmina de la posible relación entre la expresión de genes inflamatorios en la pared cerebro-vascular y acumulación de Aß-péptido. La red vascular del cerebro, incluyendo el leptomeníngeo y pial en el espacio subaracnoideo, es una extensión de las grandes arterias que forman el círculo de Willis. El método descrito aquí podría ser utilizado para aislar el CoW de cualquier linaje de ratón y podría ser utilizado para todo tipo de detección (por ejemplo, la expresión génica, la producción de proteínas y las modificaciones postraduccionales de proteínas) en los grandes vasos del ratón cerebro-vascular.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Phosphate Buffered Saline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #55 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>Hardened Fine Iris Scissors&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>14090-11</td><td></td></tr><tr><td>Scissors - Straight / Sharp / Sharp&amp;nbsp;&amp;nbsp; 16.5 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>14002-16</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #7b Forceps&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>11270-20</td><td></td></tr><tr><td>Stereoscopic Zoom Microscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ745T</td><td></td></tr><tr><td>CellBIND Surface 60mm Culture Dish</td><td>Corning</td><td>#3295</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltic Pump - MINIPULS 3</td><td>Gilson</td><td>M312</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital Sodique</td><td>Ceva Sant&amp;eacute; Animale</td><td>FR/V/2770465 3/1992</td><td></td></tr></tbody></table>

protocol for isolating the mouse circle of willis

El círculo arterial cerebral (circulus arterioso cerebral) o círculo de Willis (vaca) es una anastomosis circulatorio que rodea el quiasma óptico y el hipotálamo que suministra sangre al cerebro y las estructuras circundantes. Se ha implicado en varios trastornos cerebrovasculares, incluyendo angiopatía cerebral amiloide (CAA) vasculopatías -asociado, aterosclerosis intracraneal y aneurismas intracraneales. Los estudios de los mecanismos moleculares que subyacen a estas enfermedades para la identificación de nuevas dianas farmacológicas para su prevención requieren modelos animales. Algunos de estos modelos puede ser transgénico, mientras que otros implican el aislamiento del cerebro-vascular, incluyendo el método CoW.The descrito aquí es adecuado para el aislamiento de vaca en cualquier linaje de ratón y tiene un potencial considerable para el cribado (expresión de genes, la producción de proteínas, proteínas modificaciones posteriores a la traducción, análisis secretoma, etc.) los estudios sobre los grandes vasos del cerebro-ratónvasculatura. También se puede utilizar para estudios ex vivo, mediante la adaptación del sistema de baño de órganos aislados desarrollado para arterias olfativas ratón.

<html> El ratón perfundidos con PBS se mata y se aísla la vaca como se describe en la sección 3.2 del protocolo. Cuando la disección se realiza correctamente, la vaca debe salir en una sola pieza y debe ser ligeramente transparente debido a la ausencia de sangre residual en la vasculatura. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54352/54352fig2.jpg" /> Figura 2: La vaca del ratón después del aislamiento. (A) Descripción general de la vaca en una placa de Petri de 10 cm. (B) Los detalles de las diversas ramas de la vaca. MCA las arterias cerebrales medias, ACA para las arterias cerebrales anteriores, BA de arteria basilar, PCA de arterias cerebrales posteriores y SCA para las arterias cerebrales superiores. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54352/54352fig2large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> tienda de campaña. &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; La pureza de la preparación vaca puede ser comprobado por asegurar que los genes vasculares específicos se expresan fuertemente mientras que la expresión de genes neuronales es indetectable Más específicamente, la vaca limpiados deben específicamente expresar marcadores de células del músculo liso vascular, tales como actina de músculo liso (SMA), músculo liso-miosina de cadena pesada (SM-MHC) y smoothelin. Estos marcadores se apenas expresan en otras partes del cerebro. Un patrón opuesto de expresión debe ser obtenida de los genes neuronales, con marcadores neuronales (Mog, Map2) sólo apenas detectables en la vaca. Los niveles de mRNA pueden ser evaluados por RT-qPCR con normalización con respecto a un transcrito de gen de referencia (aquí, la de GAPDH). Los resultados típicos se muestran en la Figura 3A y B. <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/54352/54352fig3.jpg" /&gt; Figura 3:. La expresión de genes neuronales y contráctil en el Círculo de Willis ratón y el cerebro Los resultados de RT-qPCR se normalizaron contra los de un gen de referencia (GAPDH). Se expresan como la media ± desviación estándar de 6 a 12 experimentos independientes; La comparación de la vaca con el cerebro: ns: no significativo, *, P &lt;0,05, ** p &lt;0,005, y ***, P &lt;0,001 (A) La expresión de los genes contráctiles:. SMA (actina de músculo liso), smoothelin, SM-MHC (músculo liso-miosina de cadena pesada 11) y e-selectina (B) Expresión de genes neuronales:. Mog (mielina de oligodendrocitos glicoproteína) y Map2 (asociada a microtúbulos proteína 2). El patrón de expresión del marcador endotelial E-selectina en el cerebro que carecen de la vaca es muy similar a la obtenida para las muestras de la vaca, lo que posiblemente refleja la existencia de una red de capilares del cerebro. <strong&gt; Tabla 1 se enumeran los números medios de Cp para cada transcripción. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> A. </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td rowspan="2"> Cp media </td><td colspan="3"> GAPDH </td><td colspan="3"> SMA </td><td colspan="3"> smoothelin </td><td colspan="3"> SM-MHC </td><td colspan="3"> E-Sel </td></tr><tr><td> Media </td><td> Dakota del Sur </td><td> norte </td><td> Media </td><td> Dakota del Sur </td><td> norte </td><td> Media </td><td> Dakota del Sur </td><td> norte </strong&gt; </td><td> Media </td><td> Dakota del Sur </td><td> norte </td><td> Media </td><td> Dakota del Sur </td><td> norte </td></tr><tr><td> Vaca </td><td> 20.86 </td><td> 0.93 </td><td> 12 </td><td> 22.02 </td><td> 0.67 </td><td> 12 </td><td> 25.29 </td><td> 1.89 </td><td> 12 </td><td> 23.37 </td><td> 0.80 </td><td> 12 </td><td> 30.56 </td><td> 1.66 </td><td> 12 </td></tr><tr><td> Cerebro </td><td> 18.71 </td><td> 0,72 </td><td> 6 </td><td> 33.91 </td><td> 2.06 </td><td> 6 </td><td> 31.08 </td><td> 3.17 </td><td> 6 </td><td> 26.05 </td><td> 0,73 </td><td> 6 </td><td> 28.45 </td><td> 0.63 </td><td> 6 </td></tr><tr><td> SEGUNDO. </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td> &lt;td&gt; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td rowspan="2"> Cp media </td><td colspan="3"> GAPDH </td><td colspan="3"> Gatito </td><td colspan="3"> map2 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Media </td><td> Dakota del Sur </td><td> norte </td><td> Media </td><td> Dakota del Sur </td><td> norte </td><td> Media </td><td> Dakota del Sur </td><td> norte </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Vaca </td><td> 21.04 </td><td> 0.41 </td><td> 6 </td><td> 32.13 </td><td> 1.63 </td><td> 6 </td><td> 30.21 </td><td> 0.85 </td><td> 6 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cerebro </td><td> 19.09 </td><td> 0.49 </td><td> 6 </td><td> 26.43 </td><td> 0.88 </td><td> 6 </td><td> 23.30 </td><td> 0.99 </td><td> 6 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabla 1:. Entenderá el paso de punto para la expresión de genes neuronales y contráctiles en el Círculo de Willis y ratón Cerebro Los cálculos se basan en la comparación del ciclo precisa determinada por los puntos de cruce (PC) a un nivel constante de la fluorescencia. El punto de cruce es el número de ciclo que corresponde a la segunda derivada máxima de la curva de amplificación. Los valores de Cp más altos se asocian con niveles más bajos de expresión. Para un gen dado, la expresión se considera que es indetectable si el Cp excede 35. (A) Cp del gen de referencia: GAPDH; y de los genes contráctiles: SMA, smoothelin, SM-MHC y E-selectina (B) Cp del gen de referencia:. GAPDH; y los genes neuronales: Mog y Mapa2.

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Protocol for Isolating the Mouse Circle of Willis

We describe here a reproducible protocol for isolating the mouse circle of Willis.

Protocolo para el aislamiento del Círculo de Willis Ratón

The cerebral arterial circle (circulus arteriosus cerebri) or circle of Willis (CoW) is a circulatory anastomosis surrounding the optic chiasma and ...

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Universidad San Sebastian

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13.0K vistas.  Sorbonne Universités. We describe here a reproducible protocol for isolating the mouse circle of Willis.

Video: Protocol for Isolating the Mouse Circle of Willis

A Murine Model of Myocardial Ischemia-reperfusion Injury through Ligation of the Left Anterior Descending Artery

Acute or chronic myocardial infarction (MI) are cardiovascular events resulting in high morbidity and mortality. Establishing the pathological mechanisms at work during MI and developing effective therapeutic approaches requires methodology to reproducibly simulate the clinical incidence and reflect the pathophysiological changes associated with MI. Here, we describe a surgical method to induce MI in mouse models that can be used for short-term ischemia-reperfusion (I/R) injury as well as permanent ligation. The major advantage of this method is to facilitate location of the left anterior descending artery (LAD) to allow for accurate ligation of this artery to induce ischemia in the left ventricle of the mouse heart. Accurate positioning of the ligature on the LAD increases reproducibility of infarct size and thus produces more reliable results. Greater precision in placement of the ligature will improve the standard surgical approaches to simulate MI in mice, thus reducing the number of experimental animals necessary for statistically relevant studies and improving our understanding of the mechanisms producing cardiac dysfunction following MI. This mouse model of MI is also useful for the preclinical testing of treatments targeting myocardial damage following MI.

We introduce a surgical method to induce experimental ischemia/reperfusion (I/R) injury to simulate myocardial infarction (MI) in mouse models that allows for more clarity in positioning of the ligation on the left anterior descending artery (LAD) to increase the reproducibility of MI experiments in mice.

Un modelo murino de isquemia-reperfusión miocárdica lesión a través de la ligadura de la arteria descendente anterior

Acute or chronic myocardial infarction (MI) are cardiovascular events resulting in high morbidity and mortality. Establishing the pathological mechanisms ...

Investigación

Medicina

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident cells. A key mechanism of this inflammatory response is the migration of circulating immune cells to the ischemic brain facilitated by chemokine release and increased endothelial adhesion molecule expression. Brain-invading leukocytes are well-known contributing to early-stage secondary ischemic injury, but their significance for the termination of inflammation and later brain repair has only recently been noticed.
Here, a simple protocol for the efficient isolation of immune cells from the ischemic mouse brain is provided. After transcardial perfusion, brain hemispheres are dissected and mechanically dissociated. Enzymatic digestion with Liberase&#160;is followed by density gradient (such as Percoll) centrifugation to remove myelin and cell debris. One major advantage of this protocol is the single-layer density gradient procedure which does not require time-consuming preparation of gradients and can be reliably performed. The approach yields highly reproducible cell counts per brain hemisphere and allows for measuring several flow cytometry panels in one biological replicate. Phenotypic characterization and quantification of brain-invading leukocytes after experimental stroke may contribute to a better understanding of their multifaceted roles in ischemic injury and repair.

Inflammation plays a central role in the pathogenesis of ischemic stroke. Increasing evidence suggests that it acts as a double-edged sword which exacerbates early brain injury, but also contributes to later repair. This protocol describes the isolation of immune cells from the ischemic brain and their subsequent flow cytometric phenotyping.

Aislamiento y análisis de citometría de flujo de células inmunes del cerebro isquémico Ratón

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Inmunología e Infección

Conjunctival Commensal Isolation and Identification in Mice

The ocular surface was once considered immune privileged and abiotic, but recently it appears that there is a small, but persistent commensal presence. Identification and monitoring of bacterial species at the ocular mucosa have been challenging due to their low abundance and limited availability of appropriate methodology for commensal growth and identification. There are two standard approaches: culture based or DNA sequencing methods. The first method is problematic due to the limited recoverable bacteria and the second approach identifies both live and dead bacteria leading to an aberrant representation of the ocular space. We developed a robust and sensitive method for bacterial isolation by building upon standard microbiological culturing techniques. This is a swab-based technique, utilizing an &#8220;in-lab&#8221; made thin swab that targets the lower conjunctiva, followed by an amplification step for aerobic and facultative anaerobic genera. This protocol has allowed us to isolate and identify conjunctival species such as Corynebacterium spp., Coagulase Negative Staphylococcus spp., Streptococcus spp., etc. The approach is suitable to define commensal diversity in mice under different disease conditions.

Presented here is a protocol for the isolation and amplification of aerobic and facultative anaerobic mouse conjunctival commensal bacteria using a unique eye swab and culture-based enrichment step with subsequent identification by microbiological based methods and MALDI-TOF mass spectrometry.

Aislamiento e identificación comensal conjuntival en ratones

The ocular surface was once considered immune privileged and abiotic, but recently it appears that there is a small, but persistent commensal presence. ...

Isolation of Primary Mouse Hepatocytes for Nascent Protein Synthesis Analysis by Non-radioactive L-azidohomoalanine Labeling Method

Hepatocytes are parenchymal cells of the liver and engage multiple metabolic functions, including synthesis and secretion of proteins essential for systemic energy homeostasis. Primary hepatocytes isolated from the murine liver constitute a valuable biological tool to understand the functional properties or alterations occurring in the liver. Herein we describe a method for the isolation and culture of primary mouse hepatocytes by performing a two-step collagenase perfusion technique and discuss their utilization for investigating protein metabolism. The liver of an adult mouse is sequentially perfused with ethylene glycol-bis tetraacetic acid (EGTA) and collagenase, followed by the isolation of hepatocytes with the density gradient buffer. These isolated hepatocytes are viable on culture plates and maintain the majority of endowed characteristics of hepatocytes. These hepatocytes can be used for assessments of protein metabolism including nascent protein synthesis with non-radioactive reagents. We show that the isolated hepatocytes are readily controlled and comprise a higher quality and volume stability of protein synthesis linked to energy metabolism by utilizing the chemo-selective ligation reaction with a Tetramethylrhodamine (TAMRA) protein detection method and western blotting analyses. Therefore, this method is valuable for investigating hepatic nascent protein synthesis linked to energy homeostasis. The following protocol outlines the materials and methods for the isolation of high-quality primary mouse hepatocytes and detection of nascent protein synthesis.

Here, we present a protocol for the isolation of healthy and functional primary mouse hepatocytes. Instructions for detecting hepatic nascent protein synthesis by non-radioactive labeling substrate were provided to help understand the mechanisms underlying protein synthesis in the context of energy-metabolism homeostasis in the liver.

Aislamiento de hepatocitos primario de ratón para proteína naciente síntesis análisis por el método de etiquetado no radiactivo L-azidohomoalanine

Hepatocytes are parenchymal cells of the liver and engage multiple metabolic functions, including synthesis and secretion of proteins essential for ...

Regulación hormonal, metabólica y eléctrica de neuronas hipotalámicas aisladas

Isolation of Targeted Hypothalamic Neurons for Studies of Hormonal, Metabolic, and Electrical Regulation

The hypothalamus regulates fundamental metabolic processes by controlling functions as varied as food intake, body temperature, and hormone release. As the functions of the hypothalamus are controlled by specific subsets of neuronal populations, the ability to isolate them provides a major tool for studying metabolic mechanisms. In this regard, the neuronal complexity of the hypothalamus poses exceptional challenges. 
For these reasons, new techniques, such as Magnetic-Activated Cell Sorting (MACS), have been explored. This paper describes a new application of magnetic-activated cell sorting (MACS) using microbead technology to isolate a targeted neuronal population from prenatal mice brains. The technique is simple and guarantees a highly pure and viable primary hypothalamic neuron culture with high reproducibility. The hypothalamus is gently dissociated, neurons are selectively isolated and separated from glial cells, and finally, using a specific antibody for a cell surface marker, the population of interest is selected. 
Once isolated, targeted neurons can be used to investigate their morphological, electrical, and endocrine characteristics and their responses in normal or pathological conditions. Furthermore, given the variegated roles of the hypothalamus in regulating feeding, metabolism, stress, sleep, and motivation, a closer look at targeted and region-specific neurons may provide insight into their tasks in this complex environment.

Autor destacado: Perspectivas del mecanismo neural hipotalámico 

Here we present a protocol to grow specific hypothalamic cell subtypes in culture. The cells can be selected based on opportune/unique membrane markers and used in many applications, including immunofluorescence, electrophysiological, and biochemical assays.

Aislamiento de neuronas hipotalámicas diana para estudios de regulación hormonal, metabólica y eléctrica

The hypothalamus regulates fundamental metabolic processes by controlling functions as varied as food intake, body temperature, and hormone release. As ...

Neurociencias

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs from the coronary circulation. Hearts with intact aortic arches were removed and perfused via retrograde Langendorff with digestion solution containing 300 Units/ml of collagenase type II, 0.1 mg/ml soybean trypsin inhibitor and 1 M CaCl2. The perfusates were collected at 15 min intervals for 90 min, pelleted by centrifugation, resuspended in plating media, and plated on tissue culture dishes. VSMCs were characterized by presence of SM22&#945;, &#945;-SMA, and vimentin. One of the main advantages of using this technique is the ability to isolate VSMCs from the coronary circulation of mice. Although the small number of cells obtained can limit some of the applications for which the cells can be utilized, isolated coronary VSMCs can be used in a variety of well-established cell culture techniques and assays. Studies investigating VSMCs from genetically modified mice can provide further information about structure-function and signaling processes associated with vascular pathologies.

The purpose of this protocol is to demonstrate the isolation and culture techniques of murine primary vascular smooth muscle cells (VSMCs) from the coronary circulation. Once VSMCs have been isolated, they can be used for many standard culture techniques.

Aislamiento de murino coronaria células musculares lisas vasculares

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

Biología

En Face Preparation of Mouse Blood Vessels

Sections of paraffin embedded tissues are routinely used for studying tissue histology and histopathology. However, it is difficult to determine what the three-dimensional tissue morphology is from such sections. In addition, the sections of tissues examined may not contain the region within the tissue that is necessary for the purpose of the ongoing study. This latter limitation hinders histopathological studies of blood vessels since vascular lesions develop in a focalized manner. This requires a method that enables us to survey a wide area of the blood vessel wall, from its surface to deeper regions. A whole mount en face preparation of blood vessels fulfills this requirement. In this article, we will demonstrate how to make en face preparations of the mouse aorta and carotid artery and to immunofluorescently stain them for confocal microscopy and other types of fluorescence-based imaging.

En Face Preparation of Mouse Blood Vessels

A procedure for making en face preparations of the mouse carotid artery and aorta is described. Such preparations, when immunofluorescently stained with specific antibodies, enable us to study localization of proteins and identification of cell types within the entire vascular wall by confocal microscopy.

En Face Preparación de los vasos sanguíneos del ratón

Sections of paraffin embedded tissues are routinely used for studying tissue histology and histopathology. However, it is difficult to determine what the ...

A Simple and Effective Method to Consistently Isolate Mouse Cardiomyocytes

The need for reproducible yet technically simple methods yielding high-quality cardiomyocytes is essential for research in cardiac biology. Cellular and molecular functional experiments (e.g., contraction, electrophysiology, calcium cycling, etc.) on cardiomyocytes are the gold standard for establishing mechanism(s) of disease. The mouse is the species of choice for functional experiments and the described technique is specifically for the isolation of mouse cardiomyocytes. Previous methods requiring a Langendorff apparatus require high levels of training and precision for aortic cannulation, often resulting in ischemia. The field is shifting toward Langendorff-free isolation methods that are simple, are reproducible, and yield viable myocytes for physiological data acquisition and culture. These methods greatly diminish ischemia time compared to aortic cannulation and result in reliably obtained cardiomyocytes. Our adaptation to the Langendorff-free method includes an initial perfusion with ice-cold clearing solution, use of a stabilizing platform that ensures a steady needle during perfusion, and additional digestion steps to ensure reliably obtained cardiomyocytes for use in functional measurements and culture. This method is simple and quick to perform and requires little technical skill.

The gold standard in cardiology for cellular and molecular functional experiments are cardiomyocytes. This article describes adaptations to the non-Langendorff technique to isolate mouse cardiomyocytes.

Un método simple y efectivo para aislar consistentemente cardiomiocitos de ratón

The need for reproducible yet technically simple methods yielding high-quality cardiomyocytes is essential for research in cardiac biology. Cellular and ...

Protocolo para el aislamiento del Círculo de Willis Ratón

Resumen

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Un modelo murino de isquemia-reperfusión miocárdica lesión a través de la ligadura de la arteria descendente anterior

Aislamiento y análisis de citometría de flujo de células inmunes del cerebro isquémico Ratón

Aislamiento e identificación comensal conjuntival en ratones

Aislamiento de hepatocitos primario de ratón para proteína naciente síntesis análisis por el método de etiquetado no radiactivo L-azidohomoalanine

Aislamiento de neuronas hipotalámicas diana para estudios de regulación hormonal, metabólica y eléctrica

Aislamiento de neuronas hipotalámicas diana para estudios de regulación hormonal, metabólica y eléctrica

Aislamiento de neuronas hipotalámicas diana para estudios de regulación hormonal, metabólica y eléctrica

Aislamiento de murino coronaria células musculares lisas vasculares

En Face Preparación de los vasos sanguíneos del ratón

Un método simple y efectivo para aislar consistentemente cardiomiocitos de ratón