Ce travail a été soutenu par l&#39;Université Paris VI et une subvention Pierre Fabre Innovation.

Toutes les procédures ont été effectuées conformément aux normes de la Communauté européenne pour les soins et l&#39;utilisation des animaux de laboratoire, avec l&#39;approbation du comité d&#39;éthique local pour l&#39;expérimentation animale (Ile de France-Paris-Comité, Autorisation 4270). 1. Anesthésie <ol><li> Perfuser une dose létale de pentobarbital (jusqu&#39;à 1 mg / 10 g de poids corporel) (aiguille de calibre 27 et une seringue de 1 ml) par voie intrapéritonéale à des souris adultes avant la chirurgie. </li></ol> Perfusion 2. Navire NOTE: Il n&#39;y a pas besoin d&#39;appliquer une pommade vétérinaire pour les yeux pendant navire perfusion. Cette procédure est rapide (5-10 minutes) et se termine à la mort de l&#39;animal. Confirmez l&#39;absence de réponse avec une pincée d&#39;orteil. <ol><li> Utilisation de l&#39;iris de ciseaux, faire une incision, d&#39;environ 4 cm de long, dans la paroi abdominale et du péritoine, juste au-dessous de la cage thoracique. </li><li> Faire une petite incision (quelques millimètres de long) dans le diaphragme et continue de l&#39;incision de la membrane sur toute la longueur de la cage thoracique afin d&#39;exposer la cavité pleurale. </li><li> Soulevez le sternum loin et serrer la pointe du sternum avec le hémostatique; placer le hémostatique sur le cou. couper délicatement le tissu adipeux reliant le sternum au cœur. </li><li> Passer l&#39;aiguille de perfusion de calibre 15 à travers le ventricule gauche dans l&#39;apex du cœur. </li><li> Enfin, utiliser des ciseaux pour couper l&#39;un des lobes du foie pour créer une prise. NOTE: Une sortie alternative peut être créée en utilisant l&#39;iris de ciseaux pour créer une incision à l&#39;oreillette droite. </li><li> Perfuser l&#39;animal avec 25 à 50 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) avec une pompe fonctionnant à un débit de 2,5 ml / min. Le foie doit blanch que le sang est remplacé par PBS. </li><li> Après environ cinq minutes, une fois que le fluide à partir du foie est tout à fait clair, arrêter la perfusion. </li><li> Si immunocoloration ou coloration régulière est prévue, perfuser l&#39;animal avec 50 ml de paraformaldehyde(PFA; 4% dans du PBS) pendant 15 min. NOTE: Attention, les fumées PFA sont toxiques. La perfusion de l&#39;animal avec le PFA doit être effectuée dans une hotte ventilée. </li></ol> 3. Isolement du cerveau et le Cercle de Willis <ol><li> L&#39; isolement du cerveau <ol><li> Retirez la tête avec une paire de ciseaux chirurgicaux. </li><li> Faire une incision médiane avec iris ciseaux, le long de la peau du cou pour le nez. </li><li> Coupez la peau pour exposer le crâne et supprimer tous les muscles résiduels et les tissus adipeux avec des ciseaux de l&#39;iris. </li><li> Placer l&#39;extrémité pointue de l&#39;iris ciseaux dans le trou occipital d&#39;un côté et les faire glisser soigneusement le long de la surface interne du crâne du conduit auditif externe (également connu sous le canal auditif). </li><li> Reproduire l&#39;incision décrite dans 3.1.4 sur le côté controlatéral et de faire une ligne médiane coupe le long de la surface interne de l&#39;os inter-pariétal au début de la suture sagittale. </li><li> Plantez les irisciseaux dans l&#39;os frontal, entre les deux yeux, dans la suture sagittale, puis les ouvrir à diviser le crâne en deux. </li><li> Soulever le cerveau, en saisissant les bulbes olfactifs et en utilisant les iris ciseaux pour couper les connexions nerveuses sur sa surface ventrale. </li><li> Retirez le cerveau et le placer dans une boîte de Pétri de 60 mm contenant du PBS glacé pour l&#39;isolement de vache. Immerger complètement le cerveau dans le PBS. Si le cerveau a été fixé à 4% PFA (pour la coupe ultérieure et immunocoloration ou coloration régulière), gardez-le dans un bain de 4% PFA à 4 ° C pendant 24 heures. </li></ol></li><li> L&#39; isolement du cercle de Willis REMARQUE: Un microscope à dissection est nécessaire pour l&#39;isolement de vache. Le cerveau doit être conservé à 4 ° C pendant toute la procédure. <ol><li> Mettez le cerveau à l&#39; envers (ie, sur sa surface dorsale) pour visualiser la vache. </li><li> Utilisez une petite pince pour saisir les artères cérébrales antérieures (ACA) à la base des lobes olfactifs ( <strong&gt; a, Figure 1) et exercer une pression pour les dissocier du continuum des navires. Utilisez la même procédure pour couper les artères cérébrales moyennes (MCA) dans b (figure 1). </li><li> Utilisez les extrémités pointues de la pince pour soulever et retirer les artères principales qui forment le CoW du cortex. </li><li> Soulevez le début des postérieurs artères communicantes (PCA) afin de les déconnecter du cerveau, en saisissant les artères cérébrales moyennes (MCA) avec la pince. Ramassez les artères antérieures (ACA et MCA) et tirez-les doucement sur le chiasma optique dans une direction antéro-dorsale. Pour éviter la perturbation de la vache, interrompre le la procédure de traitement avec les autres artères. </li><li> Répéter les étapes 3.2.2 et 3.2.3 pour les artères cérébelleuses supérieure et postérieure (SCA) / (APC) (c, figure 1) et de l&#39;artère basilaire (BA) (d, figure 1), en les tirant dans une dorso direction antérieure. S&#39;arrêter à la fin de la procédure décrite in 3.2.4. </li><li> Retirer l&#39;ensemble CoW en tirant doucement avec la pince. Placez la vache dans un plat de 60 mm de Pétri remplie de PBS glacé et enlever tout tissu cérébral fixé restant avec deux pinces, tenant la vache en place avec de petites épingles. </li><li> Maintenir la CoW récoltées à -80 ° C pour un traitement ultérieur pour la purification de l&#39;ARN (des rendements d&#39;extraction de l&#39;ARN des grandes quantités d&#39;ARN - environ 500 ng) ou de l&#39;extraction des protéines. Remarque: La vache peut être maintenue ex vivo pendant 24 heures, en adaptant le système de bain d&#39;organe développé pour la souris isolée artère olfactive 7. </li></ol></li></ol><img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/54352/54352fig1.jpg" /> Figure 1: Diagramme schématique d&#39;une vue ventrale du cerveau de souris Soulignant la vache La vache est formée à partir des deux artères carotides internes (MCA), qui sont dérivés des deux artères cérébrales antérieures (ACA);. basilaireartère (BA) branches dans la partie postérieure (PCA) et supérieur (SCA) artères cérébrales, et deux artères vertébrales (VA).

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The authors have nothing to disclose.

Nous décrivons ici un protocole reproductible pour l&#39;isolement du cercle de Willis. Les troubles cérébro-vasculaires les plus courantes impliquant la vache sont vasculopathies CAA-associée, l&#39;athérosclérose intracrânienne et anévrisme intracrânien, tous qui affectent les parois des vaisseaux artériels. Les facteurs de risque sont bien connus, mais la pathogenèse moléculaire de ces troubles cérébraux reste mal comprise et des marqueurs biologiques spécifiques pour prédire leur occurrence font défaut. Il y a un intérêt considérable dans les méthodes pour isoler la vache de souris transgéniques pour relier les observations macroscopiques avec des changements moléculaires. Par exemple, en induisant anévrismes cohérentes dans un modèle de souris dans lequel un gène particulier est éliminé (comme décrit par Hosaka et al. , 8) et l&#39; analyse de la vache, il devrait être possible de déterminer si des traitements ciblant la protéine codée par ce gène pourrait prévenir anévrismes intracrâniens et / ou des hémorragies sous-arachnoïdiennes. Obviously, cette méthode pourrait également être utilisé pour analyser l&#39;effet d&#39;un médicament particulier sur la progression de vasculopathies CAA-associé dans les différents modèles de souris transgéniques de la MA. Il est plus facile d&#39;isoler les artères de la souris que pour purifier les microvaisseaux de souris entières, mais un tel échantillonnage est cependant plus difficile chez les souris que chez les rats. En effet, la vache de rat est intégré dans meninges beaucoup plus rigide, ce qui permet d&#39;isoler la structure entière en une seule fois. En plus du problème de la petite taille des vaisseaux chez les souris, cette procédure est également délicate en raison de la transparence des récipients après leur perfusion avec du PBS avant l&#39;enlèvement du cerveau. Nous recommandons donc la pratique sans la perfusion, à partir de l&#39;étape 3 après l&#39;anesthésie pour le rendre plus facile de distinguer les vaisseaux sanguins. Enfin, comme les vaisseaux cérébraux de souris sont très fines et se cassent facilement, la dissection doit être effectué très soigneusement, sans se précipiter, faire en sorte que toute la structureest isolé dans une seule pièce, d&#39;abord saisir l&#39;ACA. La pureté de la préparation de la vache peut être évaluée en comparant les niveaux d&#39;expression des gènes des neurones et des vaisseaux. Avec la pratique, une seule vache ne fournit que l&#39;ARN est suffisante pour l&#39;étude de 5 - 10 expressions de gènes. Pour le criblage à grande échelle, plusieurs vaches de souris devraient être mises en commun. Gauthier et al. 9 décrit un procédé pour isoler des petits morceaux de microvaisseaux (basé sur l&#39;utilisation de la collagénase / dispase à digérer les fragments de cerveau et de perles de verre à piéger) qui produit des muscles lisses ou de cellules endotheliales qui peuvent être maintenues en culture lorsque placé dans un milieu approprié. L&#39;avantage de notre procédé est qu&#39;il isole les gros vaisseaux, sans altérer la structure du navire. La dissection des branches spécifiques de la vache peut aussi être d&#39;intérêt, afin de déterminer la corrélation entre le profil d&#39;expression génique d&#39;une branche particulière et possible la sensibilité à diseas cérébrovasculaireses, comme anévrisme intracrânien. Ces approches peuvent fournir une explication des raisons pour lesquelles certaines variations anatomiques et génétiques ACA sont en corrélation avec une plus forte prévalence des anévrismes de l&#39;ACA. Cette dissection nécessite une pression à exercer avec une pince à la base de chaque branche spécifique, de le dissocier des autres branches, au début de la procédure d&#39;isolement de vache. Ainsi, en plus de rendre possible de dériver des cellules de la vache 10 ou à l&#39; écran pour l&#39; expression des gènes 11 et la production de protéines 12 ou des modifications de protéines post - traductionnelles, cette méthode peut être utilisée pour ex vivo des études, en adaptant simplement le système de bain d&#39;organe développé pour artères olfactives de souris isolées. 7 Suite à l&#39; incubation de l&#39;ensemble de vache contenant des antibiotiques du milieu de culture, la sécrétome dégagée par cette structure spécifique peuvent être obtenues et analysées. Une analyse de cette sécrétome dans les modèles de souris de CAA rendrait possible, par exemple, pour déterminer l&#39;état inflammatoire liée CAA-de ces artères cérébrales. Le milieu conditionné résultant peut également être utilisé pour déterminer les effets de la sécrétome sur chaque paroi du vaisseau type cellulaire phénotype. Préparations VACHE pathologiques pourraient également être utilisés pour identifier d&#39; éventuelles différences de signaux biochimiques, tels que le monophosphate cyclique de guanosine (cGMP), l&#39;adénosine monophosphate cyclique (AMPc) ou de concentrations de Ca2 +, détectables par transfert d&#39;énergie de résonance de fluorescence (FRET) biocapteurs à base. Biocapteurs de type viral délivré ont été utilisées dans des préparations de tranches de cerveau contenant les neurones vivants matures expérimentalement accessibles avec une morphologie préservée, ce qui conduit à la détection des différences profondes en réponse D1 entre les neurones corticaux et des neurones pyramidaux épineux moyens du striatum. 13 La modélisation des maladies cérébro - vasculaires chez des souris transgéniques exprimant second messager des protéines de capteurs à base de FRET-14pour l&#39;imagerie de signaux biochimiques dans le CoW isolé devrait encore donner un meilleur aperçu de la biochimie, de la physiopathologie et la pharmacothérapie de ces maladies.

Le cercle cérébral artériel (circulus artériel cérébral), également connu sous le cercle de Willis (GC), boucle de Willisor Willis polygone) a été décrite par Thomas Willis en 1664. Il est une anastomose circulatoire située autour du chiasma optique et de l&#39;hypothalamus qui peut être considéré comme un moyeu central d&#39;alimentation sanguine vers le cerveau et les structures environnantes. Le sang entre dans la structure par l&#39;intermédiaire de la carotide interne et des artères vertébrales et il sort du cercle par le milieu intérieur et les artères cérébrales postérieures. Chacune de ces artères branches a gauche et à droite de chaque côté du cercle. Le basilaire, après communication, et communicante antérieure artères complète le cercle (figure 1 et figure 2). Le risque d&#39;une altération de la circulation sanguine dans l&#39;une des artères d&#39;écoulement est minimisée par la fusion du sang entrant dans le cercle de la carotide et des artères cérébrales, garantissant ainsi que suffisamment de sang est fourni au bpluie. Cette structure est aussi la principale voie pour la circulation sanguine collatérale dans les maladies occlusives sévères de l&#39;artère carotide interne. Plusieurs types de troubles cérébro-vasculaires ont leur origine dans la vache. Les plus courants sont l&#39; angiopathie cérébrale amyloïde (CAA) de vasculopathies -Associated, l&#39; athérosclérose intracrânienne et des anévrismes intracrâniens. 1, 2, 3 Ces troubles peuvent conduire à une hypoperfusion due à la vasodilatation, et intracérébrales et / ou subarachnoïdiens hémorragies finalement traduire en accidents vasculaires cérébraux ischémiques ou hémorragiques ou , au mieux, une attaque ischémique transitoire. Des progrès récents dans les procédures de diagnostic, y compris la neuro-imagerie, éventuellement associée à une angiographie, ont permis de diagnostiquer cliniquement ces grandes maladies vasculaires cérébrales, sans la nécessité d&#39;une biopsie du cerveau. Néanmoins, des traitements efficaces et spécifiques (pharmacologiques ou endovasculaires) font actuellement défaut et il est donc nécessaire de définir de nouvellesles cibles moléculaires. L&#39;identification de nouvelles cibles thérapeutiques pour la prévention de ces maladies chez les humains, il faudra des modèles animaux et les moyens de l&#39;isolement de la cérébro-vasculaire, y compris la vache. Ces modèles devraient fournir des preuves et des indices de changements aux particuliers, y compris les changements inflammatoires, se produisant dans les parois des gros vaisseaux dans des modèles animaux de l&#39; anévrisme de l&#39; artère intracrânienne, CAA ou l&#39; athérosclérose intracrânienne. 4, 5, 6 Nous avons établi une méthode d&#39;isolement de CoW de la souris pour faciliter les études de l&#39;inflammation des vaisseaux dans la maladie d&#39;Alzheimer (AD) et les maladies connexes, tels que CAA. Cette méthode d&#39;isolement de la vache souris a été mis au point pour l&#39;évaluation de l&#39;expression du gène vasculaire cérébral inflammatoire lors de la progression de la maladie. Avec la détection des dépôts bêta-amyloïde dans les parois des artères leptoméningés et piales, cette méthode pourrait rendre plus facile à découragermine de la relation possible entre l&#39;expression des gènes inflammatoires dans la paroi cérébro-vasculaire et de l&#39;accumulation peptide Aß. Le réseau vasculaire du cerveau, y compris le leptoméningée et la pie-mère dans l&#39;espace sous-arachnoïdien est une extension des grosses artères formant le cercle de Willis. La méthode décrite ici pourrait être utilisé pour isoler la vache d&#39;une lignée de souris et pourrait être utilisé pour tous les types de dépistage (par exemple, l&#39; expression des gènes, la production de protéines et de modifications de protéines post - traductionnelles) sur les grands navires de la souris cérébro-vasculaire.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Phosphate Buffered Saline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #55 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>Hardened Fine Iris Scissors&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>14090-11</td><td></td></tr><tr><td>Scissors - Straight / Sharp / Sharp&amp;nbsp;&amp;nbsp; 16.5 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>14002-16</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #7b Forceps&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>11270-20</td><td></td></tr><tr><td>Stereoscopic Zoom Microscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ745T</td><td></td></tr><tr><td>CellBIND Surface 60mm Culture Dish</td><td>Corning</td><td>#3295</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltic Pump - MINIPULS 3</td><td>Gilson</td><td>M312</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital Sodique</td><td>Ceva Sant&amp;eacute; Animale</td><td>FR/V/2770465 3/1992</td><td></td></tr></tbody></table>

protocol for isolating the mouse circle of willis

Le cercle cérébral artériel (circulus artériel cérébral) ou d&#39;un cercle de Willis (GC) est une anastomose circulatoire entourant le chiasma optique et de l&#39;hypothalamus qui fournit le sang vers le cerveau et les structures environnantes. Il a été impliqué dans plusieurs troubles cérébro-vasculaires, y compris l&#39;angiopathie cérébrale amyloïde (CAA) vasculopathies -Associated, l&#39;athérosclérose et intracrânienne anévrismes intracrâniens. Les études sur les mécanismes moléculaires qui sous-tendent ces maladies pour l&#39;identification de nouvelles cibles thérapeutiques pour leur prévention nécessitent des modèles animaux. Certains de ces modèles peuvent être transgéniques, alors que d&#39;autres nécessiteront l&#39;isolement du cérébro-vasculaire, y compris la méthode de CoW.The décrit ici est approprié pour l&#39;isolement de vache dans toute lignée de souris et a un potentiel considérable pour le criblage (expression des gènes, la production de protéines, modifications des protéines post - traductionnelles, analyse sécrétome, etc.) des études sur les grands navires de la cérébro de la sourisvasculature. Il peut également être utilisé pour des études ex vivo, en adaptant le système de bain d&#39;organe isolé développé pour les artères olfactives de la souris.

<html> La souris PBS-perfusé est tué et la vache est isolé comme décrit dans la section 3.2 du protocole. Lorsque la dissection est effectuée correctement, la vache doit sortir en un seul morceau et devrait être légèrement transparent en raison de l&#39;absence de sang résiduel dans le système vasculaire. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/54352/54352fig2.jpg" /> Figure 2: La vache souris après isolement. (A) Vue d&#39; ensemble de la vache dans un plat de 10 cm de Pétri. (B) Détails des différentes branches de la vache. MCA pour les artères cérébrales moyennes, ACA pour les artères cérébrales antérieures, BA pour l&#39; artère basilaire, PCA pour postérieure des artères cérébrales et SCA pour les artères cérébrales supérieures. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54352/54352fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> tente. &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; La pureté de la préparation de vache peut être vérifié en faisant en sorte que les gènes vasculaires spécifiques sont fortement exprimés alors que l&#39;expression de gènes neuronaux est indétectable Plus précisément, la vache nettoyé devrait exprimer spécifiquement des marqueurs de cellules musculaires lisses vasculaires, comme l&#39;actine musculaire lisse (SMA), le muscle lisse-myosine chaîne lourde (SM-MHC) et smoothelin. Ces marqueurs sont à peine exprimés dans d&#39;autres parties du cerveau. Une tendance inverse d&#39;expression devrait être obtenus pour les gènes neuronaux, avec des marqueurs neuronaux (Mog, carte2) à peine détectables chez la vache. Les niveaux d&#39;ARNm peut être évaluée par RT-PCR quantitative avec normalisation par rapport à une transcription du gène de référence (en l&#39;occurrence celle de la GAPDH). Des résultats typiques sont présentés dans la Figure 3A et B. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/54352/54352fig3.jpg" /&gt; Figure 3:. Expression des neuronales et contractiles gènes dans le cercle de la souris de Willis et cerveau Les résultats de RT-qPCR ont été normalisés contre ceux d&#39;un gène de référence (GAPDH). Ils sont exprimés par la moyenne ± écart-type de 6 à 12 expériences indépendantes; Comparaison de la vache avec le cerveau: ns, non significatif, *, P &lt;0,05, **, P &lt;0,005, et ***, P &lt;0,001 (A) L&#39; expression des gènes contractiles. SMA (lisse de l&#39; actine musculaire), smoothelin, SM-MHC (muscle lisse-chaîne lourde de myosine 11) et E-sélectine (B) expression des gènes neuronaux:. Mog (myéline oligodendrocyte glycoprotéine) et la carte2 (protéine associée aux microtubules 2). Le profil d&#39;expression du marqueur E-sélectine endothéliale dans le cerveau manque la vache est très similaire à celle obtenue pour les échantillons de vache, reflétant peut-être l&#39;existence d&#39;un réseau cerveau capillaire. <strong&gt; Tableau 1 répertorie les nombres moyens Cp pour chaque transcription. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> UNE. </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td rowspan="2"> Cp Mean </td><td colspan="3"> GAPDH </td><td colspan="3"> SMA </td><td colspan="3"> Smoothelin </td><td colspan="3"> SM-MHC </td><td colspan="3"> E-Sel </td></tr><tr><td> Signifier </td><td> Dakota du Sud </td><td> N </td><td> Signifier </td><td> Dakota du Sud </td><td> N </td><td> Signifier </td><td> Dakota du Sud </td><td> N </strong&gt; </td><td> Signifier </td><td> Dakota du Sud </td><td> N </td><td> Signifier </td><td> Dakota du Sud </td><td> N </td></tr><tr><td> Vache </td><td> 20.86 </td><td> 0,93 </td><td> 12 </td><td> 22.02 </td><td> 0,67 </td><td> 12 </td><td> 25.29 </td><td> 1,89 </td><td> 12 </td><td> 23.37 </td><td> 0,80 </td><td> 12 </td><td> 30.56 </td><td> 1.66 </td><td> 12 </td></tr><tr><td> Cerveau </td><td> 18,71 </td><td> 0,72 </td><td> 6 </td><td> 33.91 </td><td> 2.06 </td><td> 6 </td><td> 31.08 </td><td> 3.17 </td><td> 6 </td><td> 26.05 </td><td> 0,73 </td><td> 6 </td><td> 28.45 </td><td> 0,63 </td><td> 6 </td></tr><tr><td> B. </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td> &lt;td&gt; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td rowspan="2"> Cp Mean </td><td colspan="3"> GAPDH </td><td colspan="3"> Minou </td><td colspan="3"> carte2 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Signifier </td><td> Dakota du Sud </td><td> N </td><td> Signifier </td><td> Dakota du Sud </td><td> N </td><td> Signifier </td><td> Dakota du Sud </td><td> N </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Vache </td><td> 21.04 </td><td> 0,41 </td><td> 6 </td><td> 32.13 </td><td> 1,63 </td><td> 6 </td><td> 30.21 </td><td> 0,85 </td><td> 6 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cerveau </td><td> 19.09 </td><td> 0,49 </td><td> 6 </td><td> 26.43 </td><td> 0,88 </td><td> 6 </td><td> 23.30 </td><td> 0,99 </td><td> 6 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tableau 1:. Moyenne point de passage pour l&#39;expression des gènes neuronaux et contractiles dans le cercle de la souris de Willis et du cerveau Les calculs sont basés sur la comparaison du cycle précis déterminé par les points de passage (Cp) à un niveau constant de la fluorescence. Le point de passage est le numéro de cycle correspondant à la dérivée seconde maximale de la courbe d&#39;amplification. Des valeurs plus élevées Cp sont associés à des niveaux inférieurs d&#39;expression. Pour un gène donné, l&#39; expression est considéré comme étant indétectable si le Cp est supérieur à 35. (A) Cp du gène de référence: GAPDH; et des gènes contractiles: SMA, smoothelin, SM-CMH et E-sélectine (B) Cp du gène de référence. GAPDH; et les gènes neuronaux: Mog et carte2.

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Protocol for Isolating the Mouse Circle of Willis

We describe here a reproducible protocol for isolating the mouse circle of Willis.

Protocole pour Isoler le Cercle de souris de Willis

The cerebral arterial circle (circulus arteriosus cerebri) or circle of Willis (CoW) is a circulatory anastomosis surrounding the optic chiasma and ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.0K vues.  Sorbonne Universités. We describe here a reproducible protocol for isolating the mouse circle of Willis.

Vidéo: Protocol for Isolating the Mouse Circle of Willis

A Murine Model of Myocardial Ischemia-reperfusion Injury through Ligation of the Left Anterior Descending Artery

Acute or chronic myocardial infarction (MI) are cardiovascular events resulting in high morbidity and mortality. Establishing the pathological mechanisms at work during MI and developing effective therapeutic approaches requires methodology to reproducibly simulate the clinical incidence and reflect the pathophysiological changes associated with MI. Here, we describe a surgical method to induce MI in mouse models that can be used for short-term ischemia-reperfusion (I/R) injury as well as permanent ligation. The major advantage of this method is to facilitate location of the left anterior descending artery (LAD) to allow for accurate ligation of this artery to induce ischemia in the left ventricle of the mouse heart. Accurate positioning of the ligature on the LAD increases reproducibility of infarct size and thus produces more reliable results. Greater precision in placement of the ligature will improve the standard surgical approaches to simulate MI in mice, thus reducing the number of experimental animals necessary for statistically relevant studies and improving our understanding of the mechanisms producing cardiac dysfunction following MI. This mouse model of MI is also useful for the preclinical testing of treatments targeting myocardial damage following MI.

We introduce a surgical method to induce experimental ischemia/reperfusion (I/R) injury to simulate myocardial infarction (MI) in mouse models that allows for more clarity in positioning of the ligation on the left anterior descending artery (LAD) to increase the reproducibility of MI experiments in mice.

Un modèle murin d&#39;ischémie myocardique-reperfusion par ligature de l&#39;artère interventriculaire antérieure

Acute or chronic myocardial infarction (MI) are cardiovascular events resulting in high morbidity and mortality. Establishing the pathological mechanisms ...

Recherche

Médecine

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident cells. A key mechanism of this inflammatory response is the migration of circulating immune cells to the ischemic brain facilitated by chemokine release and increased endothelial adhesion molecule expression. Brain-invading leukocytes are well-known contributing to early-stage secondary ischemic injury, but their significance for the termination of inflammation and later brain repair has only recently been noticed.
Here, a simple protocol for the efficient isolation of immune cells from the ischemic mouse brain is provided. After transcardial perfusion, brain hemispheres are dissected and mechanically dissociated. Enzymatic digestion with Liberase&#160;is followed by density gradient (such as Percoll) centrifugation to remove myelin and cell debris. One major advantage of this protocol is the single-layer density gradient procedure which does not require time-consuming preparation of gradients and can be reliably performed. The approach yields highly reproducible cell counts per brain hemisphere and allows for measuring several flow cytometry panels in one biological replicate. Phenotypic characterization and quantification of brain-invading leukocytes after experimental stroke may contribute to a better understanding of their multifaceted roles in ischemic injury and repair.

Inflammation plays a central role in the pathogenesis of ischemic stroke. Increasing evidence suggests that it acts as a double-edged sword which exacerbates early brain injury, but also contributes to later repair. This protocol describes the isolation of immune cells from the ischemic brain and their subsequent flow cytometric phenotyping.

Isolement et analyse par cytométrie en flux des cellules immunitaires du cerveau ischémique souris

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Immunologie et infection

Conjunctival Commensal Isolation and Identification in Mice

The ocular surface was once considered immune privileged and abiotic, but recently it appears that there is a small, but persistent commensal presence. Identification and monitoring of bacterial species at the ocular mucosa have been challenging due to their low abundance and limited availability of appropriate methodology for commensal growth and identification. There are two standard approaches: culture based or DNA sequencing methods. The first method is problematic due to the limited recoverable bacteria and the second approach identifies both live and dead bacteria leading to an aberrant representation of the ocular space. We developed a robust and sensitive method for bacterial isolation by building upon standard microbiological culturing techniques. This is a swab-based technique, utilizing an &#8220;in-lab&#8221; made thin swab that targets the lower conjunctiva, followed by an amplification step for aerobic and facultative anaerobic genera. This protocol has allowed us to isolate and identify conjunctival species such as Corynebacterium spp., Coagulase Negative Staphylococcus spp., Streptococcus spp., etc. The approach is suitable to define commensal diversity in mice under different disease conditions.

Presented here is a protocol for the isolation and amplification of aerobic and facultative anaerobic mouse conjunctival commensal bacteria using a unique eye swab and culture-based enrichment step with subsequent identification by microbiological based methods and MALDI-TOF mass spectrometry.

Isolement et identification commensaux conjonctivaux chez la souris

The ocular surface was once considered immune privileged and abiotic, but recently it appears that there is a small, but persistent commensal presence. ...

Isolation of Primary Mouse Hepatocytes for Nascent Protein Synthesis Analysis by Non-radioactive L-azidohomoalanine Labeling Method

Hepatocytes are parenchymal cells of the liver and engage multiple metabolic functions, including synthesis and secretion of proteins essential for systemic energy homeostasis. Primary hepatocytes isolated from the murine liver constitute a valuable biological tool to understand the functional properties or alterations occurring in the liver. Herein we describe a method for the isolation and culture of primary mouse hepatocytes by performing a two-step collagenase perfusion technique and discuss their utilization for investigating protein metabolism. The liver of an adult mouse is sequentially perfused with ethylene glycol-bis tetraacetic acid (EGTA) and collagenase, followed by the isolation of hepatocytes with the density gradient buffer. These isolated hepatocytes are viable on culture plates and maintain the majority of endowed characteristics of hepatocytes. These hepatocytes can be used for assessments of protein metabolism including nascent protein synthesis with non-radioactive reagents. We show that the isolated hepatocytes are readily controlled and comprise a higher quality and volume stability of protein synthesis linked to energy metabolism by utilizing the chemo-selective ligation reaction with a Tetramethylrhodamine (TAMRA) protein detection method and western blotting analyses. Therefore, this method is valuable for investigating hepatic nascent protein synthesis linked to energy homeostasis. The following protocol outlines the materials and methods for the isolation of high-quality primary mouse hepatocytes and detection of nascent protein synthesis.

Here, we present a protocol for the isolation of healthy and functional primary mouse hepatocytes. Instructions for detecting hepatic nascent protein synthesis by non-radioactive labeling substrate were provided to help understand the mechanisms underlying protein synthesis in the context of energy-metabolism homeostasis in the liver.

Isolation des hépatocytes de souris primaire pour analyse-synthèse protéine naissante par méthode d’étiquetage non-radioactifs L-azidohomoalanine

Hepatocytes are parenchymal cells of the liver and engage multiple metabolic functions, including synthesis and secretion of proteins essential for ...

Régulation hormonale, métabolique et électrique des neurones hypothalamiques isolés

Isolation of Targeted Hypothalamic Neurons for Studies of Hormonal, Metabolic, and Electrical Regulation

The hypothalamus regulates fundamental metabolic processes by controlling functions as varied as food intake, body temperature, and hormone release. As the functions of the hypothalamus are controlled by specific subsets of neuronal populations, the ability to isolate them provides a major tool for studying metabolic mechanisms. In this regard, the neuronal complexity of the hypothalamus poses exceptional challenges. 
For these reasons, new techniques, such as Magnetic-Activated Cell Sorting (MACS), have been explored. This paper describes a new application of magnetic-activated cell sorting (MACS) using microbead technology to isolate a targeted neuronal population from prenatal mice brains. The technique is simple and guarantees a highly pure and viable primary hypothalamic neuron culture with high reproducibility. The hypothalamus is gently dissociated, neurons are selectively isolated and separated from glial cells, and finally, using a specific antibody for a cell surface marker, the population of interest is selected. 
Once isolated, targeted neurons can be used to investigate their morphological, electrical, and endocrine characteristics and their responses in normal or pathological conditions. Furthermore, given the variegated roles of the hypothalamus in regulating feeding, metabolism, stress, sleep, and motivation, a closer look at targeted and region-specific neurons may provide insight into their tasks in this complex environment.

Pleins feux sur l’auteur : Aperçu du mécanisme neuronal hypothalamique 

Here we present a protocol to grow specific hypothalamic cell subtypes in culture. The cells can be selected based on opportune/unique membrane markers and used in many applications, including immunofluorescence, electrophysiological, and biochemical assays.

Isolement de neurones hypothalamiques ciblés pour l’étude de la régulation hormonale, métabolique et électrique

The hypothalamus regulates fundamental metabolic processes by controlling functions as varied as food intake, body temperature, and hormone release. As ...

Neurosciences

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs from the coronary circulation. Hearts with intact aortic arches were removed and perfused via retrograde Langendorff with digestion solution containing 300 Units/ml of collagenase type II, 0.1 mg/ml soybean trypsin inhibitor and 1 M CaCl2. The perfusates were collected at 15 min intervals for 90 min, pelleted by centrifugation, resuspended in plating media, and plated on tissue culture dishes. VSMCs were characterized by presence of SM22&#945;, &#945;-SMA, and vimentin. One of the main advantages of using this technique is the ability to isolate VSMCs from the coronary circulation of mice. Although the small number of cells obtained can limit some of the applications for which the cells can be utilized, isolated coronary VSMCs can be used in a variety of well-established cell culture techniques and assays. Studies investigating VSMCs from genetically modified mice can provide further information about structure-function and signaling processes associated with vascular pathologies.

The purpose of this protocol is to demonstrate the isolation and culture techniques of murine primary vascular smooth muscle cells (VSMCs) from the coronary circulation. Once VSMCs have been isolated, they can be used for many standard culture techniques.

Isolement de murin coronaire vasculaires cellules de muscle lisse

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

Biologie

En Face Preparation of Mouse Blood Vessels

Sections of paraffin embedded tissues are routinely used for studying tissue histology and histopathology. However, it is difficult to determine what the three-dimensional tissue morphology is from such sections. In addition, the sections of tissues examined may not contain the region within the tissue that is necessary for the purpose of the ongoing study. This latter limitation hinders histopathological studies of blood vessels since vascular lesions develop in a focalized manner. This requires a method that enables us to survey a wide area of the blood vessel wall, from its surface to deeper regions. A whole mount en face preparation of blood vessels fulfills this requirement. In this article, we will demonstrate how to make en face preparations of the mouse aorta and carotid artery and to immunofluorescently stain them for confocal microscopy and other types of fluorescence-based imaging.

En Face Preparation of Mouse Blood Vessels

A procedure for making en face preparations of the mouse carotid artery and aorta is described. Such preparations, when immunofluorescently stained with specific antibodies, enable us to study localization of proteins and identification of cell types within the entire vascular wall by confocal microscopy.

Préparation du visage à la souris

Sections of paraffin embedded tissues are routinely used for studying tissue histology and histopathology. However, it is difficult to determine what the ...

A Simple and Effective Method to Consistently Isolate Mouse Cardiomyocytes

The need for reproducible yet technically simple methods yielding high-quality cardiomyocytes is essential for research in cardiac biology. Cellular and molecular functional experiments (e.g., contraction, electrophysiology, calcium cycling, etc.) on cardiomyocytes are the gold standard for establishing mechanism(s) of disease. The mouse is the species of choice for functional experiments and the described technique is specifically for the isolation of mouse cardiomyocytes. Previous methods requiring a Langendorff apparatus require high levels of training and precision for aortic cannulation, often resulting in ischemia. The field is shifting toward Langendorff-free isolation methods that are simple, are reproducible, and yield viable myocytes for physiological data acquisition and culture. These methods greatly diminish ischemia time compared to aortic cannulation and result in reliably obtained cardiomyocytes. Our adaptation to the Langendorff-free method includes an initial perfusion with ice-cold clearing solution, use of a stabilizing platform that ensures a steady needle during perfusion, and additional digestion steps to ensure reliably obtained cardiomyocytes for use in functional measurements and culture. This method is simple and quick to perform and requires little technical skill.

The gold standard in cardiology for cellular and molecular functional experiments are cardiomyocytes. This article describes adaptations to the non-Langendorff technique to isolate mouse cardiomyocytes.

Une méthode simple et efficace pour isoler systématiquement les cardiomyocytes de souris

The need for reproducible yet technically simple methods yielding high-quality cardiomyocytes is essential for research in cardiac biology. Cellular and ...

Protocole pour Isoler le Cercle de souris de Willis

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Un modèle murin d'ischémie myocardique-reperfusion par ligature de l'artère interventriculaire antérieure

Isolement et analyse par cytométrie en flux des cellules immunitaires du cerveau ischémique souris

Isolement et identification commensaux conjonctivaux chez la souris

Isolation des hépatocytes de souris primaire pour analyse-synthèse protéine naissante par méthode d’étiquetage non-radioactifs L-azidohomoalanine

Isolement de neurones hypothalamiques ciblés pour l’étude de la régulation hormonale, métabolique et électrique

Isolement de neurones hypothalamiques ciblés pour l’étude de la régulation hormonale, métabolique et électrique

Isolement de neurones hypothalamiques ciblés pour l’étude de la régulation hormonale, métabolique et électrique

Isolement de murin coronaire vasculaires cellules de muscle lisse

Préparation du visage à la souris

Une méthode simple et efficace pour isoler systématiquement les cardiomyocytes de souris