Questo metodo aiuta a comprendere le differenze fenotipiche delle cellule RP in tutta la retina umana. La tecnica di dissezione che Davide Ortolan ha sviluppato è altamente riproducibile nel generare un distacco tra RP e retina. E il software REShAPE è davvero apprezzabile nell'analisi di immagini di grandi dimensioni di supporti piatti RP.
Il metodo che Davide ha sviluppato può essere utilizzato per studiare le differenze regionali nel fenotipo RP da pazienti con diversi tipi di malattie degenerative retiniche. Per iniziare, tagliare il tubo conico da 50 millilitri leggermente al di sotto del segno di 5 millilitri. Usando la colla a caldo, attaccare la punta del tubo sul fondo della barca di pesatura.
Quindi mescolare i due componenti del kit di elastomero siliconico con un rapporto di 10 a 1 evitando di intrappolare l'aria. Versare la miscela nel recipiente di pesatura contenente questo pezzo sferico del tubo inferiore rotondo. Polimerizzare il silicone a temperatura ambiente durante la notte.
Rimuovere la barca di pesatura e il tubo inferiore rotondo dallo stampo in silicone polimerizzato. In primo luogo, riempire una siringa da 1 millilitro con 1700 millimoli di soluzione di D-mannitolo e collegarla a un ago da 21 gauge. Inserire l'ago attraverso la pars plana per evitare di perforare la camera anteriore dell'occhio e iniettare 400 microlitri della soluzione nel vitreo.
Lasciare l'occhio a temperatura ambiente per 45 minuti. Usando un paio di forbici e pinze sottili, tagliare la camera anteriore a livello della pars plana. Riempire la camera oculare posteriore con DPBS contenente calcio e magnesio.
Sotto il microscopio stereo, localizzare la macula visualizzata come una macchia gialla sulla retina. Tagliare l'occhio in quadranti, vale a dire nasale, temporale, superiore e inferiore, assicurandosi di preservare la regione maculare. Rimuovere gli aghi se sono di intralcio.
Trasferire la farfalla nella camera posteriore dell'occhio in una capsula di Petri da 100 millimetri contenente DPBS con calcio e magnesio. Prima di rimuovere la retina, segnare il petalo che contiene la macula facendo un taglio a forma di V nel margine ciliare. Sollevare e tagliare tutto il vitreo che si trova sulla retina.
Tagliare la retina dai margini ciliari in tutti i petali assicurandosi di non graffiare l'RPE. Posizionare il tessuto in 4% PFA e incubare per un'ora. Lavare tre volte con DPBS contenente calcio e magnesio.
Trasferire il tessuto in un contenitore riempito con lo stesso tampone e conservarlo a 4 gradi Celsius. Quindi, trasferire il campione in una capsula di Petri da 100 millimetri contenente DPBS con calcio e magnesio. Perforare la testa del nervo ottico con un pugno bioptico da 1,5 millimetri.
Raccogliere la retina e conservarla nello stesso tampone a 4 gradi Celsius. Per rimuovere la sclera dalla coroide RPE, sollevare delicatamente lo strato di coroide RPE dalla periferia. Quindi con un paio di Vannas Spring Scissors, tagliare i vasi coroideali e il tessuto connettivo che si trovano tra la sclera e l'RPE.
Dopo la completa separazione dalla sclera, raccogliere lo strato di coroide RPE. Trasferire il tessuto in un contenitore pieno di DPBS contenente calcio e magnesio e conservarlo a 4 gradi Celsius. Trasferire la coroide RPE in un pozzetto di una piastra a sei pozzetti.
Bloccare e permeabilizzare il campione per un'ora a temperatura ambiente. Incubare il campione per un'ora a temperatura ambiente con falloidina coniugata con 647 fluorofori ad una diluizione da 1 a 250 nel tampone di permeabilizzazione. Lavare tre volte in DPBS contenente calcio e magnesio.
Trasferire il campione di coroide RPE su un vetrino da 50 x 75 millimetri e appiattirlo. Tagliare ogni petalo in due per rendere il campione più piatto. Disegna un contorno del supporto piatto con una penna idrofoba.
Per estinguere l'autofluorescenza della lipofuscina, aggiungere 500 microlitri della soluzione di quencher di autofluorescenza e incubare a temperatura ambiente per due minuti. Lavare accuratamente in DPBS contenente calcio e magnesio. Rimuovere il DPBS e aggiungere il supporto di montaggio.
Posizionare un vetro di copertura sul supporto piatto e sigillare con lo smalto. Aprire il software. Nella scheda directory, selezionare le cartelle di input e output.
Nella directory di output, lasciare che il software cambi automaticamente il percorso della directory o del processo di input. In alternativa, modificare manualmente la directory di output. Per generare mappe di calore, seleziona tutto dal menu a discesa nella scheda Crea immagini a colori.
Seleziona la casella no nella funzione Usa limiti manuali per consentire al software di utilizzare i valori minimi e massimi rilevati in ogni immagine. Seleziona la casella Sì per regolare manualmente l'intervallo di valori per ogni mappa termica metrica della forma. Clicca quindi sul pulsante imposta limiti e inserisci i valori nelle caselle di testo per scegliere gli intervalli per i singoli parametri.
Dopo aver modificato i valori di interesse, fare clic su Salva. Fare clic su impostazioni predefinite basse per ripristinare tutti i limiti. Per selezionare una soglia di dimensione cella in dimensioni inferiori, inserire la dimensione della cella più piccola da includere nell'analisi.
In Dimensioni cella superiore, inserire la dimensione della cella più grande da includere. In Converti pixel in unità reali, selezionare no per eseguire l'analisi in unità di pixel, selezionare sì per eseguire l'analisi in micrometri. In Lunghezza dei pixel della barra di scala, immettete il valore in pixel nella casella di testo.
In lunghezza dei micron della barra della scala, immettere la distanza corrispondente in micrometri. Per avviare l'analisi, premere Vai per esso. Questo protocollo si traduce in un'immagine single-plane di un montaggio piatto in cui la posizione della cella viene identificata dalla segmentazione generata da REShAPE dei bordi delle celle RPE.
Inoltre, vengono misurate 30 metriche di forma, inclusa l'area della cella delle singole celle RPE, per ogni cella RPE correttamente identificata. Le tessere nere risultanti da pezzi residui di retina o altri oggetti luminosi possono essere rimosse scegliendo una delle opzioni di filtraggio disponibili nel menu a discesa del filtro RT. L'utilizzo di immagini RBG per l'analisi di rimodellamento produrrà immagini binarie interamente nere.
In questo caso, la conversione delle immagini RGB in scala di grigi produrrà immagini binarie segmentate correttamente. Se la colorazione non è ottimale o se il campione è danneggiato da un graffio, è possibile identificare grandi grumi di cellule come una singola cellula molto grande. In questo caso, gli oggetti di grandi dimensioni possono essere esclusi dall'analisi modificando la soglia delle dimensioni della cella.
Per ottenere un tessuto piatto, la RP e la coroide devono essere separate dalla sclera anche se questi passaggi possono richiedere molto tempo. Dopo la generazione del montaggio piatto RP, è possibile colorare per ulteriori marcatori RPE in modo da poter studiare diverse regioni del monostrato RP. Utilizzando questo metodo, abbiamo scoperto cinque diverse popolazioni di RP che sono differenzialmente sensibili a diverse malattie degenerative della retina.
