تساعد هذه الطريقة على فهم الاختلافات المظهرية لخلايا RP عبر شبكية العين البشرية بأكملها. تقنية التشريح التي طورها دافيد أورتولان قابلة للتكرار بشكل كبير في توليد انفصال بين RP وشبكية العين. وبرنامج REShAPE ملموس حقا في تحليل الصور الكبيرة لحوامل RP المسطحة.
يمكن استخدام الطريقة التي طورها دافيد لدراسة الاختلافات الإقليمية في النمط الظاهري RP من المرضى الذين يعانون من أنواع مختلفة من الأمراض التنكسية في شبكية العين. للبدء ، قم بقطع الأنبوب المخروطي 50 ملليلتر أقل بقليل من علامة 5 ملليلتر. باستخدام الغراء الساخن ، قم بتوصيل طرف الأنبوب بقاع قارب الوزن.
ثم امزج مكونين من مجموعة المطاط الصناعي السيليكوني بنسبة 10 إلى 1 لتجنب حبس الهواء. صب المزيج في وعاء الوزن الذي يحتوي على هذه القطعة الكروية من الأنبوب السفلي المستدير. علاج السيليكون في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها.
قم بإزالة قارب الوزن والأنبوب السفلي المستدير من قالب السيليكون المعالج. أولا ، املأ حقنة سعة 1 ملليلتر ب 1700 ملليمول من محلول D-Mannitol وأرفقها بإبرة قياس 21. أدخل الإبرة من خلال pars plana لتجنب ثقب الغرفة الأمامية للعين وحقن 400 ميكرولتر من المحلول في الجسم الزجاجي.
اترك العين في درجة حرارة الغرفة لمدة 45 دقيقة. باستخدام زوج من المقصات الدقيقة والملقط ، قم بفتح الغرفة الأمامية على مستوى pars plana. املأ حجرة العين الخلفية ب DPBS التي تحتوي على الكالسيوم والمغنيسيوم.
تحت المجهر الاستريو ، قم بتوطين البقعة المرئية كبقعة صفراء على شبكية العين. قطع العين إلى أرباع ، وهي الأنف ، والزماني ، والأعلى ، والسفلي ، مع ضمان الحفاظ على المنطقة البقعية. قم بإزالة الإبر إذا كانت في الطريق.
انقل الفراشة إلى الغرفة الخلفية للعين إلى طبق بتري 100 ملم يحتوي على DPBS مع الكالسيوم والمغنيسيوم. قبل إزالة الشبكية ، ضع علامة على البتلة التي تحتوي على البقعة عن طريق إجراء قطع على شكل حرف V في الهامش الهدبي. رفع وقطع كل الجسم الزجاجي الذي يضع على شبكية العين.
قطع شبكية العين من الهوامش الهدبية في جميع بتلات لضمان عدم خدش RPE. ضع المنديل في 4٪ PFA واحتضنه لمدة ساعة واحدة. اغسل ثلاث مرات باستخدام DPBS التي تحتوي على الكالسيوم والمغنيسيوم.
انقل الأنسجة إلى وعاء مملوء بنفس المخزن المؤقت وقم بتخزينه عند 4 درجات مئوية. بعد ذلك ، انقل العينة إلى طبق بتري 100 ملم يحتوي على DPBS مع الكالسيوم والمغنيسيوم. لكمة رأس العصب البصري بكمة خزعة 1.5 ملم.
جمع شبكية العين وتخزينها في نفس المخزن المؤقت عند 4 درجات مئوية. لإزالة الصلبة من المشيمية RPE ، ارفع برفق طبقة المشيمية RPE من المحيط. ثم باستخدام زوج من مقص Vannas Spring ، قم بقطع الأوعية المشيمية والنسيج الضام الموجود بين الصلبة و RPE.
بعد الانفصال التام عن الصلبة ، اجمع طبقة المشيمية RPE. انقل المنديل إلى وعاء مملوء ب DPBS يحتوي على الكالسيوم والمغنيسيوم ، وقم بتخزينه عند 4 درجات مئوية. انقل المشيمية RPE إلى بئر واحد من لوحة من ستة آبار.
قم بحظر العينة واختراقها لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. احتضان العينة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة مع phalloidin مترافق مع 647 فلوروفور بتخفيف من 1 إلى 250 في مخزن النفاذية. يغسل ثلاث مرات في DPBS التي تحتوي على الكالسيوم والمغنيسيوم.
انقل عينة RPE المشيمية إلى شريحة زجاجية مقاس 50 × 75 ملم وقم بتسطيحها. قطع كل بتلة إلى قسمين لجعل العينة أكثر تسطحا. ارسم محيطا للحامل المسطح بقلم كاره للماء.
لإخماد التألق الذاتي للليبوفوسين ، أضف 500 ميكرولتر من محلول إخماد التألق الذاتي ، واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين. تغسل جيدا في DPBS التي تحتوي على الكالسيوم والمغنيسيوم. قم بإزالة DPBS وأضف وسيط التركيب.
ضع غطاء زجاجي على الحامل المسطح وأغلقه بطلاء الأظافر. افتح البرنامج. في علامة التبويب الدلائل ، حدد مجلدات الإدخال والإخراج.
في دليل الإخراج ، دع البرنامج يغير المسار تلقائيا إلى دليل الإدخال أو العملية. بدلا من ذلك ، قم بتغيير دليل الإخراج يدويا. لإنشاء خرائط حرارية ، حدد الكل من القائمة المنسدلة في علامة التبويب إنشاء صور ملونة.
حدد المربع لا في ميزة استخدام الحدود اليدوية للسماح للبرنامج باستخدام الحد الأدنى والحد الأقصى للقيم المكتشفة في كل صورة. حدد المربع نعم لضبط نطاق القيم يدويا لكل خريطة حرارية مترية للشكل. ثم انقر فوق الزر "تعيين الحدود" وأدخل القيم في مربعات النص لاختيار نطاقات للمعلمات الفردية.
بعد تغيير قيم الاهتمام ، انقر فوق حفظ. انقر فوق الإعدادات الافتراضية المنخفضة لإعادة تعيين جميع الحدود. لتحديد عتبة حجم الخلية في حجم الخلية الأقل، أدخل حجم أصغر خلية ليتم تضمينها في التحليل.
في حجم الخلية العلوي، أدخل حجم أكبر خلية ليتم تضمينها. في تحويل وحدات البكسل إلى وحدات حقيقية ، حدد لا لتشغيل التحليل بوحدات البكسل ، حدد نعم لتشغيل التحليل بالميكرومتر. في طول بيكسلات شريط المقياس، أدخل قيمة البيكسل في مربع النص.
في طول ميكرون شريط المقياس ، أدخل المسافة المقابلة بالميكرومتر. لبدء التحليل ، اضغط على go for it. ينتج عن هذا البروتوكول صورة أحادية المستوى لحامل مسطح حيث يتم تحديد موقع الخلية من خلال التجزئة التي تم إنشاؤها بواسطة REShAPE لحدود خلية RPE.
أيضا ، يتم قياس 30 مقياسا للشكل ، بما في ذلك مساحة الخلية لخلايا RPE الفردية ، لكل خلية RPE محددة بشكل صحيح. يمكن إزالة البلاط الأسود الناتج عن القطع المتبقية من شبكية العين أو الأجسام الساطعة الأخرى عن طريق اختيار أحد خيارات التصفية المتاحة في القائمة المنسدلة مرشح RT. سيؤدي استخدام صور RBG لتحليل إعادة التشكيل إلى إنتاج صور ثنائية سوداء بالكامل.
في حالة حدوث ذلك، سيؤدي تحويل صور RGB إلى مقياس رمادي إلى إنتاج صور ثنائية مجزأة بشكل صحيح. إذا لم يكن التلوين مثاليا أو إذا تضررت العينة بسبب خدش ، فيمكن تحديد كتل كبيرة من الخلايا كخلية واحدة كبيرة جدا. في هذه الحالة ، يمكن استبعاد الكائنات الكبيرة من التحليل عن طريق تغيير عتبة حجم الخلية.
للحصول على نسيج مسطح ، يجب فصل RP والمشيمية عن الصلبة حتى لو كانت هذه الخطوات قد تستغرق وقتا طويلا. بعد إنشاء حامل RP المسطح ، من الممكن تلطيخ علامات RPE إضافية بحيث يمكنك دراسة مناطق مختلفة من الطبقة الأحادية RP. باستخدام هذه الطريقة ، اكتشفنا خمس مجموعات مختلفة من RP حساسة بشكل تفاضلي للأمراض التنكسية المختلفة في شبكية العين.
