Este método ajuda a entender as diferenças fenotípicas das células RP em toda a retina humana. A técnica de dissecção que Davide Ortolan desenvolveu é altamente reprodutível na geração de um descolamento entre o FR e a retina. E o software REShAPE é realmente apreciável na análise de imagens grandes de montagens planas RP.
O método que Davide desenvolveu pode ser usado para estudar diferenças regionais no fenótipo RP de pacientes com diferentes tipos de doenças degenerativas da retina. Para começar, corte o tubo cônico de 50 mililitros ligeiramente abaixo da marca de 5 mililitros. Usando cola quente, prenda a ponta do tubo ao fundo do barco de pesagem.
Em seguida, misture os dois componentes do kit de elastômero de silicone em uma proporção de 10 para 1, evitando aprisionar o ar. Despeje a mistura no barco de pesagem contendo este pedaço esférico do tubo de fundo redondo. Cure o silicone à temperatura ambiente durante a noite.
Remova o barco de pesagem e o tubo de fundo redondo do molde de silicone curado. Primeiro, encha uma seringa de 1 mililitro com 1700 milimoles de solução de D-manitol e prenda-a a uma agulha de calibre 21. Insira a agulha através da pars plana para evitar perfurar a câmara anterior do olho e injete 400 microlitros da solução no vítreo.
Deixe o olho à temperatura ambiente por 45 minutos. Usando um par de tesouras finas e pinças, abra a câmara anterior ao nível da pars plana. Encha a câmara ocular posterior com DPBS contendo cálcio e magnésio.
Sob o microscópio estéreo, localize a mácula visualizada como uma mancha amarela na retina. Corte o olho em quadrantes, ou seja, nasal, temporal, superior e inferior, garantindo a preservação da região macular. Remova as agulhas se elas estiverem no caminho.
Transfira a borboleta para a câmara posterior do olho para uma placa de Petri de 100 milímetros contendo DPBS com cálcio e magnésio. Antes de remover a retina, marque a pétala que contém a mácula fazendo um corte em forma de V na margem ciliar. Levante e corte todo o vítreo que se deposita na retina.
Corte a retina das margens ciliares em todas as pétalas garantindo não arranhar o PSE. Coloque o tecido em 4%PFA e incube por uma hora. Lave três vezes com DPBS contendo cálcio e magnésio.
Transfira o tecido para um recipiente cheio do mesmo tampão e armazene-o a 4 graus Celsius. Em seguida, transfira a amostra para uma placa de Petri de 100 milímetros contendo DPBS com cálcio e magnésio. Soque a cabeça do nervo óptico com um soco de biópsia de 1,5 milímetro.
Colete a retina e armazene-a no mesmo tampão a 4 graus Celsius. Para remover a esclera da coroide RPE, levante suavemente a camada coroide RPE da periferia. Em seguida, com um par de Tesouras Vannas Spring, corte os vasos coroidais e o tecido conjuntivo que estão entre a esclera e o PSE.
Após a separação completa da esclera, colete a camada coroide do EPR. Transfira o tecido para um recipiente cheio de DPBS contendo cálcio e magnésio e armazene-o a 4 graus Celsius. Transfira a coroide RPE para um poço de uma placa de seis poços.
Bloquear e permeabilizar a amostra por uma hora à temperatura ambiente. Incubar a amostra por uma hora à temperatura ambiente com faloidina conjugada com fluoróforo 647 a uma diluição de 1 a 250 no tampão de permeabilização. Lave três vezes em DPBS contendo cálcio e magnésio.
Transfira a amostra de coroide RPE para uma lâmina de vidro de 50 x 75 milímetros e achate-a. Corte cada pétala em duas para tornar a amostra mais plana. Desenhe um contorno do suporte plano com uma caneta hidrofóbica.
Para extinguir a autofluorescência da lipofuscina, adicione 500 microlitros da solução de quencher de autofluorescência e incube à temperatura ambiente por dois minutos. Lave bem em DPBS contendo cálcio e magnésio. Remova o DPBS e adicione o meio de montagem.
Coloque um vidro de cobertura no suporte plano e sele com esmalte. Abra o software. Na guia diretórios, selecione as pastas de entrada e saída.
No diretório de saída, permita que o software altere automaticamente o caminho para o diretório ou processo de entrada. Como alternativa, altere o diretório de saída manualmente. Para gerar mapas de calor, selecione tudo no menu suspenso na guia Criar imagens coloridas.
Marque a caixa não no recurso de limites manuais de uso para permitir que o software use os valores mínimo e máximo detectados em cada imagem. Marque a caixa sim para ajustar manualmente o intervalo de valores para cada mapa de calor métrico de forma. Em seguida, clique no botão definir limites e insira valores nas caixas de texto para escolher intervalos para os parâmetros individuais.
Depois de alterar os valores de interesse, clique em salvar. Clique em padrões baixos para redefinir todos os limites. Para selecionar um limite de tamanho de célula em tamanho de célula inferior, insira o tamanho da menor célula a ser incluída na análise.
No tamanho da célula superior, insira o tamanho da maior célula a ser incluída. Ao converter pixels em unidades reais, marque não para executar a análise em unidades de pixels, marque sim para executar a análise em micrômetros. No comprimento dos pixels da barra de escala, insira o valor do pixel na caixa de texto.
No comprimento dos mícrons da barra de escala, insira a distância correspondente em micrômetros. Para iniciar a análise, pressione ir em frente. Esse protocolo resulta em uma imagem de plano único de uma montagem plana em que a localização da célula é identificada pela segmentação gerada pelo REShAPE das bordas da célula RPE.
Além disso, 30 métricas de forma, incluindo a área celular das células RPE individuais, são medidas para cada célula RPE corretamente identificada. Os blocos pretos resultantes de pedaços residuais de retina ou outros objetos brilhantes podem ser removidos escolhendo uma das opções de filtragem disponíveis no menu suspenso do filtro RT. O uso de imagens RBG para a análise de remodelação produzirá imagens binárias inteiramente pretas.
Se isso ocorrer, a conversão das imagens RGB em escala de cinza produzirá imagens binárias segmentadas corretamente. Se a coloração não for ideal ou se a amostra for danificada por um arranhão, grandes aglomerados de células podem ser identificados como uma única célula muito grande. Nesse caso, objetos grandes podem ser excluídos da análise alterando o limite de tamanho da célula.
Para obter um tecido plano, o FR e a coroide precisam ser separados da esclera, mesmo que essas etapas possam levar muito tempo. Após a geração da montagem plana RP, é possível manchar marcadores RPE adicionais para que você possa estudar diferentes regiões da monocamada RP. Usando este método, descobrimos cinco populações diferentes de FR que são diferencialmente sensíveis a diferentes doenças degenerativas da retina.
