Cette méthode aide à comprendre les différences phénotypiques des cellules RP sur l’ensemble de la rétine humaine. La technique de dissection développée par Davide Ortolan est hautement reproductible en générant un décollement entre la RP et la rétine. Et le logiciel REShAPE est vraiment appréciable dans l’analyse de grandes images de supports plats RP.
La méthode développée par Davide peut être utilisée pour étudier les différences régionales dans le phénotype RP chez les patients atteints de différents types de maladies dégénératives rétiniennes. Pour commencer, coupez le tube conique de 50 millilitres légèrement en dessous de la marque des 5 millilitres. À l’aide de colle chaude, fixez l’extrémité du tube au fond du bateau de pesée.
Ensuite, mélangez les deux composants du kit en élastomère de silicone dans un rapport de 10 pour 1 en évitant d’emprisonner l’air. Versez le mélange dans le bateau de pesée contenant ce morceau sphérique du tube à fond rond. Durcir le silicone à température ambiante pendant la nuit.
Retirez le bateau de pesage et le tube à fond rond du moule en silicone durci. Tout d’abord, remplissez une seringue de 1 millilitre avec 1700 millimoles de solution de D-Mannitol et fixez-la à une aiguille de calibre 21. Insérez l’aiguille à travers la pars plana pour éviter de percer la chambre antérieure de l’œil et injectez 400 microlitres de la solution dans le vitré.
Laissez l’œil à température ambiante pendant 45 minutes. À l’aide d’une paire de ciseaux fins et de pinces, ouvrez la chambre antérieure au niveau de la pars plana. Remplissez la cavité postérieure des yeux avec du DPBS contenant du calcium et du magnésium.
Sous le stéréomicroscope, localisez la macula visualisée comme une tache jaune sur la rétine. Couper l’œil en quadrants, à savoir nasal, temporel, supérieur et inférieur, tout en veillant à préserver la région maculaire. Retirez les aiguilles si elles sont sur le chemin.
Transférer le papillon dans la chambre postérieure de l’œil dans une boîte de Petri de 100 millimètres contenant du DPBS avec du calcium et du magnésium. Avant de retirer la rétine, marquez le pétale qui contient la macula en faisant une coupe en forme de V dans la marge ciliaire. Soulevez et coupez tout le vitré qui repose sur la rétine.
Couper la rétine des marges ciliaires dans tous les pétales en veillant à ne pas rayer l’EPR. Placez le tissu dans 4% PFA et incuber pendant une heure. Laver trois fois avec du DPBS contenant du calcium et du magnésium.
Transférez le tissu dans un récipient rempli du même tampon et conservez-le à 4 degrés Celsius. Ensuite, transférez l’échantillon dans une boîte de Petri de 100 millimètres contenant du DPBS avec du calcium et du magnésium. Percez la tête du nerf optique avec un poinçon de biopsie de 1,5 millimètre.
Recueillez la rétine et stockez-la dans le même tampon à 4 degrés Celsius. Pour retirer la sclérotique de la choroïde RPE, soulevez doucement la couche choroïde RPE de la périphérie. Ensuite, avec une paire de ciseaux Vannas Spring, coupez les vaisseaux choroïdiens et le tissu conjonctif qui se trouvent entre la sclérotique et l’EPR.
Après une séparation complète de la sclérotique, prélever la couche choroïde RPE. Transférez le tissu dans un récipient rempli de DPBS contenant du calcium et du magnésium et conservez-le à 4 degrés Celsius. Transférer la choroïde RPE dans un puits d’une plaque de six puits.
Bloquer et perméabiliser l’échantillon pendant une heure à température ambiante. Incuber l’échantillon pendant une heure à température ambiante avec de la phalloïdine conjuguée à du fluorophore 647 à une dilution de 1 à 250 dans le tampon de perméabilisation. Laver trois fois dans du DPBS contenant du calcium et du magnésium.
Transférez l’échantillon choroïde RPE sur une lame de verre de 50 x 75 millimètres et aplatissez-le. Coupez chaque pétale en deux pour rendre l’échantillon plus plat. Dessinez un contour du support plat avec un stylo hydrophobe.
Pour éteindre l’autofluorescence de la lipofuscine, ajoutez 500 microlitres de la solution d’autofluorescence et incuber à température ambiante pendant deux minutes. Laver soigneusement dans du DPBS contenant du calcium et du magnésium. Retirez le DPBS et ajoutez le support de montage.
Placez un verre de couverture sur le support plat et scellez avec du vernis à ongles. Ouvrez le logiciel. Dans l’onglet répertoires, sélectionnez les dossiers d’entrée et de sortie.
Dans le répertoire de sortie, laissez le logiciel modifier automatiquement le chemin d’accès au répertoire ou au processus d’entrée. Vous pouvez également modifier le répertoire de sortie manuellement. Pour générer des cartes thermiques, sélectionnez tout dans le menu déroulant de l’onglet Créer des images en couleur.
Cochez la case non dans la fonction Utiliser les limites manuelles pour permettre au logiciel d’utiliser les valeurs minimales et maximales détectées dans chaque image. Cochez la case oui pour ajuster manuellement la plage de valeurs pour chaque carte thermique métrique de forme. Cliquez ensuite sur le bouton Définir les limites et insérez des valeurs dans les zones de texte pour choisir des plages pour les paramètres individuels.
Après avoir modifié les valeurs d’intérêt, cliquez sur enregistrer. Cliquez sur les valeurs par défaut faibles pour réinitialiser toutes les limites. Pour sélectionner un seuil de taille de cellule dans une taille de cellule inférieure, insérez la taille de la plus petite cellule à inclure dans l’analyse.
Dans Taille de cellule supérieure, insérez la taille de la plus grande cellule à inclure. Dans convertir les pixels en unités réelles, cochez non pour exécuter l’analyse en unités de pixels, cochez oui pour exécuter l’analyse en micromètres. Dans Longueur des pixels de la barre d’échelle, entrez la valeur des pixels dans la zone de texte.
Dans la longueur de la barre d’échelle microns, entrez la distance correspondante en micromètres. Pour lancer l’analyse, appuyez sur Go for it. Ce protocole permet d’obtenir une image à plan unique d’un montage plat où l’emplacement de la cellule est identifié par la segmentation des bordures de cellule RPE générée par REShAPE.
En outre, 30 mesures de forme, y compris la surface cellulaire des cellules RPE individuelles, sont mesurées pour chaque cellule RPE correctement identifiée. Les tuiles noires résultant de morceaux résiduels de rétine ou d’autres objets lumineux peuvent être supprimées en choisissant l’une des options de filtrage disponibles dans le menu déroulant du filtre RT. L’utilisation d’images RBG pour l’analyse de remodelage produira des images binaires entièrement noires.
Si cela se produit, la conversion des images RVB en niveaux de gris produira des images binaires correctement segmentées. Si la coloration n’est pas optimale ou si l’échantillon est endommagé par une égratignure, de grands amas de cellules peuvent être identifiés comme une seule très grande cellule. Dans ce cas, les objets volumineux peuvent être exclus de l’analyse en modifiant le seuil de taille de cellule.
Pour obtenir un tissu plat, le RP et la choroïde doivent être séparés de la sclérotique même si ces étapes peuvent prendre beaucoup de temps. Suite à la génération du support plat RP, il est possible de colorer des marqueurs RPE supplémentaires afin que vous puissiez étudier différentes régions de la monocouche RP. En utilisant cette méthode, nous avons découvert cinq populations différentes de RP qui sont différemment sensibles à différentes maladies dégénératives de la rétine.
