L'obiettivo generale di queste tecniche è quello di valutare la fisiopatologia retinica nel modello di ratto di retinopatia diabetica indotta da streptozotocina. La retinopatia diabetica è una delle principali cause di cecità. La continua ricerca è in corso per scoprire agenti farmacologici con migliore efficacia e azione più lunga per il trattamento della retinopatia diabetica.
Il processo di scoperta di agenti farmacologici in modelli animali pre-clinici svolge un ruolo vitale. Questi modelli animali aiutano a comprendere le alterazioni strutturali e funzionali dei tessuti del segmento posteriore dell'occhio. Pertanto, dimostreremo tre diverse tecniche per studiare queste alterazioni nei problemi del segmento posteriore.
Stiamo dimostrando l'istologia per studiare i cambiamenti morfologici delle cellule retiniche negli strati, il saggio di degradazione BRB per studiare il BRB compromesso quantificando la proteina fuoriuscita nel vitreo dal plasma e anche l'angiografia fluorescente per visualizzare la vascolarizzazione retinica utilizzando il colorante FITC-destrano. Eutanasia ratto con alte dosi di pentobarbital e confermare la sua morte senza battito cardiaco rilevabile. Enucleare l'occhio facendo incisioni usando una lama di bisturi sulle regioni nasali e temporali dell'occhio.
Quindi tagliare lungo i bordi per rimuovere l'occhio dalla cavità orbitale. Rimuovere il grasso in eccesso che circonda l'occhio e metterlo in 5 ml di soluzione fissativa. Incubare l'occhio in soluzione fissativa per 24-48 ore.
Dopo la fissazione, rimuovere l'occhio dalla soluzione fissativa e trasferire nella capsula di Petri riempita con 10 ml di PBS. Usando micro pinze, tieni l'occhio con il nervo ottico e fai un nick a pars plana con l'aiuto di micro forbici. Tagliare l'intero margine della cornea per separare la coppa anteriore e la coppa posteriore dell'occhio.
Rimuovere la lente e tagliare il nervo ottico. Tagliare la coppa posteriore in due metà, passando attraverso il nervo ottico. Trasferire ogni metà nelle cassette separate.
Disidratare il tessuto aumentando gradualmente la concentrazione di etanolo dal 50% al 100% di etanolo. E infine, eliminare l'etanolo con xilene. Impregnare il tessuto con paraffina preriscaldata a 60 gradi Celsius per sostituire lo xilene nel tessuto.
Preparare i blocchi di paraffina usando uno stampo in acciaio per tenere il tessuto e la cassetta come base. Durante la preparazione del blocco, la porzione del disco ottico dell'occhio dovrebbe essere rivolta verso il fondo dello stampo in acciaio. Riempire la cassetta con paraffina e trasferirla su una superficie fredda.
Montare la lama e la cassetta sui rispettivi supporti su microtomo. Usando un microtomo, tagliare la cera di paraffina in eccesso e tagliare un nastro da cinque a sei sezioni con uno spessore di 5 micrometri. Trasferire il nastro sulla superficie del bagno d'acqua preriscaldato per aprire il nastro.
Raccogli le sezioni su una diapositiva di vetro rivestita di albumina. Lasciare asciugare le diapositive durante la notte a 37 gradi Celsius. Per eseguire la colorazione di ematossilina ed eosina, preriscaldare i vetrini a 60 gradi Celsius per 1 ora per sciogliere la paraffina.
Seguire la procedura di colorazione come indicato nel manoscritto. Inizia con la reidratazione del tessuto e poi colora con ematossilina seguita da Eosina. Ora, disidratare il tessuto e aggiungere il mezzo di montaggio sulle sezioni.
Posizionare il coperchio sulle sezioni e visualizzare al microscopio ottico. Per eseguire il test di rottura della barriera emato-retinica, anestetizzare il ratto usando ketamina e xilazina e confermare lo stato anestetico con il pizzico della punta. Individuare il cuore e inserire 1 mL di siringa con ago calibro 24 per prelevare il sangue mediante puntura cardiaca.
Una volta raccolto il sangue sufficiente, trasferirlo nel tubo rivestito con EDTA. Mescolare delicatamente per prevenire l'emolisi. Enucleare l'occhio e trasferirlo immediatamente sul ghiaccio secco.
In condizioni congelate, iniziare la dissezione dell'occhio mediante rimozione della cornea e della lente. Tirare il vitreo dal segmento posteriore dell'occhio usando una pinza senza alcuna contaminazione dalla retina. Trasferirlo in tubo di omogeneizzazione con tre o quattro perline.
Omogeneizzare i campioni utilizzando l'omogeneizzatore di perline a velocità media per 10 secondi. Trasferire campioni di sangue e umore vitreo in tubi di microcentrifuga per elaborare ulteriormente. Centrifugare entrambi i campioni a 5.200 g per 10 minuti a 4 gradi Celsius.
Utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere 250 microlitri di reagente Bradford nei pozzetti. Diluire i campioni vitrei 10 volte e i campioni di plasma 20 volte utilizzando PBS. Aggiungere 5 microlitri di campioni diluiti al reagente Bradford e mescolare bene.
Incubare i campioni per 20-30 minuti, quindi misurare l'assorbanza a 590 nanometri utilizzando un lettore di piastre a 96 pozzetti. L'intensità del campione è direttamente proporzionale alla concentrazione di proteine. Per eseguire l'angiografia a fluorescenza, anestetizzare il ratto usando il 3% di isoflurano e confermare lo stato anestetico con il punzone della punta.
Immergere la coda in acqua tiepida prima di iniettare il colorante. Iniettare 1 mL di 50 mg per mL di soluzione di FITC-destrano nella vena laterale della coda. Lasciare circolare il colorante per 5-10 minuti.
Eutanasia del ratto usando pentobarbital e confermare la sua morte senza battito cardiaco rilevabile. Enucleare l'occhio e procedere per la preparazione del montaggio piatto. Per preparare la montatura piatta retinica, posizionare l'occhio su un Kimwipe privo di fibre e tagliare la parte anteriore dell'occhio.
Tirare lentamente la lente, insieme all'umore vitreo, dal segmento posteriore dell'occhio. Trasferire il segmento posteriore nella capsula di Petri riempita con PBS e tagliare il nervo ottico. Ora, posiziona la punta del forcipite appuntito tra la sclera e la retina.
Spostalo delicatamente lungo tutto il bordo della tazza per assicurarti che la retina non sia attaccata alla sclera in nessun punto. Tagliare vicino al disco ottico, in modo tale che la retina si stacchi completamente dalla sclera. Una volta confermato che la retina non è attaccata alla sclera su nessun lato, spingerla lentamente nella soluzione PBS.
Con l'aiuto di un forcep, trasferire la retina su un vetrino pulito senza causare alcun danno ad esso. Usando la micro forbice o la lama del bisturi, fai quattro tagli sulla retina, come mostrato, per dividerla in quattro quadranti. Rimuovere l'eccesso di PBS dall'ambiente retinico e aggiungere un mezzo di montaggio anti-sbiadimento sul supporto piatto retinico.
Coprilo con un coverslip e visualizza il supporto piatto al microscopio confocale. È importante notare qui che l'intero processo di angiografia a fluorescenza viene eseguito sotto la minima luce per evitare la tempra della fluorescenza dal colorante FITC-destrano. Nel ratto diabetico, le cellule retiniche subiscono una degenerazione, che porta a ulteriori complicazioni.
Queste alterazioni strutturali possono essere visualizzate con la tecnica istologica per determinare il numero di cellule e lo spessore della retina. In caso di ratti diabetici, lo spessore degli strati retinici aumenta a causa dell'edema. Quindi, questa tecnica aiuta a selezionare vari potenziali agenti farmacologici per il trattamento della retinopatia diabetica.
I cambiamenti metabolici nella retina dovuti al diabete causano la perdita di periciti e la rottura della barriera emato-retinica. Poiché vi è una fuoriuscita di proteine e altre biomolecole nella retina e nel vitreo, i livelli di proteine totali aumentano nel vitreo dei ratti diabetici. Prevenire la rottura della barriera emato-retinica potrebbe ostacolare significativamente il progresso della retinopatia diabetica.
Nella retinopatia diabetica, l'espressione del fattore di crescita endoteliale vascolare aumenta che porta alla formazione di nuovi vasi. Questi vasi disturbano la normale struttura retinica, e quindi la sua innervazione è di primaria importanza per il trattamento della retinopatia diabetica. La tecnica di angiografia a fluorescenza viene utilizzata per visualizzare nuovi vasi sanguigni e anche perdite di vasi sanguigni, come evidenziato qui.
Tuttavia, l'angiogenesi è prominente solo dopo sei-12 mesi di induzione del diabete. Questa tecnica ci aiuta a quantificare l'effetto del trattamento farmacologico sull'innervazione dell'angiogenesi e della perdita vascolare. Il futuro trattamento della retinopatia diabetica ha bisogno di agenti farmacologici più efficienti, ma i trattamenti futuri possono essere raggiunti solo attraverso una migliore comprensione della patogenesi della malattia.
Padroneggiare queste tecniche potrebbe aiutare i ricercatori ad avere una migliore comprensione della patogenesi della retinopatia diabetica, che potrebbe portare alla scoperta di migliori interventi farmacologici.
