Questo metodo aiuta a superare i limiti nello studio dello sviluppo ematopoietico umano fornendo una piattaforma in vitro semplice e trattabile basata sulla riprogrammazione diretta delle cellule. La dimostrazione visiva di questo metodo fornirà una guida ideale nelle fasi fondamentali per generare cellule emogeniche umane, vale a dire durante la produzione lentivirale, la trasduzione di fibroblasti e la coltura cellulare. Convertendo i fibroblasti cutanei in precursori emogenici, speriamo di generare cellule staminali ematopoietiche specifiche del paziente e cellule progenitrici in numero sufficiente per il trapianto di cellule staminali.
Inizia coltivando cellule HEK293T in un piatto trattato con coltura tissutale di 100 millimetri con 10 millilitri di DMEM completo a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica fino alla confluenza. Il giorno prima della trasfezione, dopo aver aspirato il mezzo, lavare accuratamente il piatto con cinque millilitri di PBS e staccare le cellule con 1,5 millilitri di soluzione di dissociazione. Dopo aver incubato per cinque o 10 minuti a 37 gradi Celsius, inattivare la soluzione con tre millilitri di DMEM completo e trasferire la sospensione cellulare in un tubo conico da 15 millilitri.
Lavare il piatto con 5 millilitri di DMEM completo per rimuovere eventuali celle attaccate rimanenti e tirare il lavaggio con la soluzione cellulare. Raccogliere le cellule per centrifugazione, aspirare il supernatante e rimescolare il pellet in sei millilitri di DMEM completo. Quindi, dividere uniformemente la sospensione tra sei piatti trattati con coltura tissutale da 100 millimetri in un volume finale di 10 millilitri di DMEM completo per piatto.
Il giorno dopo, aggiungere 10 microgrammi di massa totale dei tre plasmidi di trasferimento insieme a un nuovo tubo conico da 15 millilitri. Successivamente, aggiungere 10 microgrammi della seconda generazione di vettori di imballaggio psPAX2 che codificano i geni gag, pol, tat e rev seguito dall'aggiunta di cinque microgrammi di pMD2. Vettore di inviluppo G che codifica il gene VSV-G per il tubo.
Infine, aggiungere acqua per portare il volume finale a 500 microlitri. In due nuovi tubi conici da 15 millilitri aggiungere 10 microgrammi di plasmide FUW-M2rtTA, 10 microgrammi del vettore di imballaggio e cinque microgrammi del vettore dell'inviluppo a ciascun tubo. Quindi, aggiungere acqua fino a un volume finale di 500 microlitri a ciascun tubo.
Successivamente, aggiungere 62,5 microlitri di due cloruri di calcio molare a ciascuno dei tre tubi e utilizzare un controller di pipetta dotato di una pipetta Pasteur per rilasciare bolle in ogni miscela. Mentre le bolle si stanno formando, aggiungere 500 microlitri di BES tamponato a goccia soluzione salina contro la pipetta Pasteur e sulla miscela. Incubare i tubi a temperatura ambiente per almeno 15 minuti fino a quando le miscele appaiono leggermente torbosi.
Durante l'incubazione, sostituire con cura il supernatante delle colture cellulari HEK293T con 10 millilitri di DMEM completo senza antibiotici. Distribuire i complessi di DNA dropwise sui singoli piatti di coltura cellulare HEK293T e incubare per 24 ore. Il giorno successivo, sostituire i supernaganti con quattro millilitri di DMEM completo per coltura e riportare i piatti a un incubatore di coltura cellulare di anidride carbonica di 37 gradi Celsius 5% durante la notte.
La mattina dopo, raccogliere i supernatanti in un tubo da 50 millilitri per piatto e aggiungere quattro millilitri di mezzo fresco per ogni piatto. Dopo altre otto ore di coltura, mettere in comune il supernatante in ogni piatto con il supernatante precedentemente raccolto e aggiungere quattro millilitri di mezzo fresco. Riportare i piatti all'incubatore di coltura cellulare durante la notte e raccogliere i supernaganti un'ultima volta.
Una volta raccolto tutto il virus, filtrare ogni supernatante lentivirale attraverso un filtro legante a basso contenuto proteico di 0,45 micrometri in singoli tubi e aggiungere un massimo di 15 millilitri di supernatante filtrato alle singole unità filtranti centrifughe per la centrifugazione. Scartare il flusso. Un lentivirus viscoso contenente liquido rimarrà nell'unità filtrante.
Quando tutto il supernatante lentivirale è stato filtrato aliquota da 50 a 200 microlitri dei lentivirus concentrati per la conservazione a freddo. Prima di iniziare la procedura di riprogrammazione, codificare una piastra trattata con sei tessuti ben trattati con 500 microlitri di gelatina allo 0,1% per pozzo e incubare la piastra per 20 minuti a 37 gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, aspirare la soluzione di gelatina rimanente.
Placcare i fibroblasti dermici umani ad una densità di 1,5 volte dieci alla quinta cella per piastra in due millilitri di DMEM completo per pozzo e incubare durante la notte. La mattina seguente, sostituire il mezzo in ogni pozzo con due millilitri di DMEM completo integrato con otto microgrammi per millilitro di polibrene e aggiungere una miscela uno a uno di lentivirus a fattore di trascrizione prodotti in piscina e M2rtTA in un nuovo tubo di microcentrifugo. Quindi, trasdurre il fibroblasto con un volume ottimale della miscela lentivirale, tra 10 e 100 microlitri per pozzo.
Dopo 16 ore di incubazione, sostituire i supernaganti con DMEM completo e riportare le cellule nell'incubatore di coltura cellulare per sei-otto ore. Dopo il recupero, sostituire i supernaganti con due millilitri di DMEM completo integrato con polibrene ed eseguire una seconda trasduzione come appena dimostrato. Al termine della seconda incubazione di trasduzione, sostituire i supernaganti con DMEM completo integrato con un microgrammo per millilitro di doxiciclina e riportare la piastra all'incubatore di coltura cellulare per 48 ore.
Al termine dell'incubazione, dividere ciascuno bene con un rapporto uno a due e ricollare le cellule in due millilitri per pozzo di mezzo ematopoietico integrato con doxiciclina in una nuova piastra di gelatina rivestita con sei pozza. Per ottenere un numero sufficiente di cellule per l'analisi del sequenziamento dell'immunoprecipitazione della cromatina, placcare tre volte 10 al quinto fibroblasto in una gelatina rivestita con sei piastre di pozzo e incubare durante la notte. Al termine dell'incubazione, trasdurre le cellule due volte in due giorni consecutivi con da 10 a 20 microlitri di lentivirus contenenti i singoli fattori di interesse o un pool dei tre fattori più FUW-M2rtTA ad un rapporto uno a uno.
16 ore dopo la seconda trasduzione, rimuovere il virus contenente supernatante e incubare le cellule in DMEM completo per 24 ore. Al termine dell'incubazione, ritrarre il contenuto di ogni pozzo in singoli piatti trattati con coltura tissutale da 100 millimetri con DMEM completo a un volume finale di 10 millilitri di mezzo per piatto e riportare le cellule all'incubatore di coltura cellulare. Dopo sei giorni, sostituire il supernatante con DMEM completo integrato con doxiciclina.
Riportare le colture nell'incubatore per altri due giorni. Come dimostrano questi appezzamenti rappresentativi di citometria, circa il 17% delle cellule riprogrammate esprime sia CD49f che CD9 dopo 25 giorni di riprogrammazione. La maggior parte delle cellule doppie positive esprimono CD143 e una piccola popolazione esprime CD34, suggerendo un'induzione dinamica del destino emogenico.
Questi marcatori non vengono attivati nei fibroblasti dermici umani trasdotti M2rtTA coltivati per 25 giorni. L'imaging ad immunofluorescenza conferma l'espressione di CD9 e CD143 in cellule aderenti e rotonde che sono morfologicamente distinte dai fibroblasti, che sono negative per questi marcatori. L'imaging Brightfeild viene eseguito per visualizzare la confluenza cellulare, la morfologia e la formazione della colonia durante tutto il processo di riprogrammazione.
L'analisi del sequenziamento dell'RNA a cella singola delle cellule riprogrammate rivela un aumento graduale dell'espressione CD49f, CD9 e CD143 dai giorni due ai 25. Dopo il sequenziamento dell'immunoprecipitazione della cromatina, i profili del browser del genoma mostrano GATA2 vincolante per le regioni regolatorie genomiche di ITGA6 e ACE quando i fibroblasti vengono cotradotti con i tre fattori o GATA2 individualmente. Il volume di particelle antivirali aggiunto alla coltura dovrebbe essere ottimizzato per una riprogrammazione riuscita senza compromettere la vitalità cellulare.
Questa piattaforma può essere accoppiata con tecnologie di inibizione farmacologica e screening su scala genomica, come CRISPR-Cas9, per definire nuovi regolatori dell'ematopoiesi definitiva umana. Questo approccio di riprogrammazione diretta consentirà ai ricercatori di esplorare nuove questioni nel campo dell'ematopoiesi dello sviluppo umano e di decifrare i meccanismi alla base della specifica delle cellule staminali ematopoietiche umane. È importante eseguire raccolte antivirali e trasduzioni in una cappa a flusso laminare dedicata al lavoro lentivirale e scartare i rifiuti virali contaminati in un contenitore appropriato.
