Name: genotyping of staphylococcus aureus by ribosomal spacer pcr (rs-pcr)
Uploaded: 2016-11-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR RS-PCR at JoVE.com

The author thanks R. Boss, A. Cosandey, C. Fournier, I. Ivanovic, and J. Naskova for their excellent work.

1. Staphylococcus aureus מבודד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מורחים 10 μl של ס תרבות מניות aureus או מושבה אחד גדלה על מצע סלקטיבי על צלחות אגרו קולומביה המכילות דם כבשים 5% (BA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה אירובית על 37 מעלות צלזיוס למשך 18 שעות עד 24 שעות. </li></ol> 2. DNA הפקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן חיץ טל המכיל 10 mM Tris-HCl ו -10 מ&quot;מ Na 2 EDTA, pH 8.5. כן aliquots חיטוי ב 121 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף 1 מושבת מבני עקיבא באמצעות לולאת פלסטיק סטרילית או מכוש שן עץ סטרילית גלולה ב 100 TEL μl. השתמש 1.5 מ&quot;ל צינורות עם פקקי הברגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 95 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. לאחר מכן, מניח את הדגימות מייד על קרח רטוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את דגימות 1: 100 ב H 2 O מתאים PCR (= DNA תבנית עבור ה- PCR). הדגימות הלא מדולל למניה והרווח המדולל נשמרות ב -20 ° C עבור 1 חודש. </li></ol> 3. RS-PCR <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li&gt; עבור כל פיפטה מדגם לתוך צינור PCR 1.5 μl H 2 O, 12.5 μl תקי מיקס מאסטר, 2 μl פריימר G1 10 מיקרומטר, 2 μl פריימר L1 10 מיקרומטר, ו -7 μl של תבנית ה- DNA המתאים לכ -30 ננוגרם של טהור DNA 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את תכנית האופניים הבא בתוך Cycler PCR תקן: 15 דקות 95 מעלות צלזיוס, ואחריו 27 מחזורים המהווים 94 מעלות צלזיוס במשך 1 דקות, ואחריו רמפת חישול 2 דקות ב 55 מעלות צלזיוס למשך 7 דקות. לאחר רמפה 2 דקות נוספות, ישתרע על 72 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות. לסיים PCR על ידי רחבה סופית על 72 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ואחריו הרגעות עד 4 מעלות צלזיוס. הערה: מוצרי PCR יכולים להיות מאוחסנים ב -20 מעלות צלזיוס למשך 5 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל מחזור של RS-PCR לכלול שליטה חיובית, כלומר, מדגם עם גנוטיפ ידוע (בדרך כלל GTB), וכן שליטה שלילית (H 2 O). </li></ol> אלקטרופורזה 4. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש ערכת אלקטרופורזה מסחרי מיניאטורי עבור DNA (ערכת MED) יחדעם bioanalyzer מחובר למחשב ואת התוכנות המותקנות. ללמוד את החוברות המקבילות של היצרן בקפידה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את התחנה יחול שבב ולהתאים את קליפ המזרק פי הוראות היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכינים את תערובת ג&#39;ל צבע בהתאם למדריך של היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טעינת תערובת ג&#39;ל צבע (על פי הוראות היצרן). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאזן את תמהיל ג&#39;ל לצבוע RT למשך 30 דקות לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים שבב דנ&quot;א חדש בתחנת השבב יחול. פיפטה 9 μl של צבעי ג&#39;ל ג מסומן היטב </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא כי הבוכנה ממוקמת 1 מ&quot;ל ולאחר מכן לסגור את תחנת השבב יחול. בוכנה לחץ על עד הוא מוחזק על ידי קליפ המזרק. חכה בדיוק למשך 30 שניות ולאחר מכן שחררו את הקליפ המזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתן 5 שניות. לאט לאט למשוך בחזרה הבוכנה 1 מ&quot;ל עמדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחנה יחולו שבב פתח פיפטה 9 μl של ג&#39;ל צבע בשתי הבארות מסומנות &quot;G&quot;. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טעינת Marker <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 5 μl של הסמן בכל 12 בארות מדגם ב הסולם היטב. אין להשאיר לכל אחת מ -13 אלה בארות ריקות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טעינת הסולם ואת הדוגמות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 1 μl של סולם ה- DNA אל מסומן היטב עם סימן הסולם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> μl של מדגם 1 פיפטה (בארות בשימוש) או 1 μl של מים ללא יונים (בארות ללא שימוש). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את השבב אופקי מתאם מערבולת דקות 1 ב -2,400 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל שבב bioanalyzer תוך 5 דקות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרצת ניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את bioanalyzer והמחשב מחובר. פתח את התוכנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את המכסה של bioanalyzer ומניח השבב לתוך החזיק השבב (השבב מתאים רק כיוון אחד). סגור את המכסה בזהירות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהקשר Instrument של התוכנה לבחור &quot;אלקטרופורזה&quot;&gt; &quot;dsDNA&quot;&gt; &quot;DNA 7500&quot;. קבל את קידומת הקובץ הנוכחית של התוכנה או לשנות אותה.</li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על כפתור התחל הנוכחי בתוכנה. הזן את שמות מדגם בתוכנה. כאשר לרוץ השבב הוא סיים (לאחר כ -30 דקות) בסוף הודעת ההפעלה מופיע תוכנת bioanalyzer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את השבב ולנקות את האלקטרודות של bioanalyzer בהתאם להוראות היצרן. </li></ol></li></ol> 5. הסקת גנוטיפ מן בפרופיל אלקטרופורזה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את תוכנת המאהל (תוכנה זמינה באופן חופשי מן המחברים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתוני התייחסות יבוא לתוך התוכנה מהאל: &quot;קובץ&quot;&gt; &quot;נתוני הפנית יבוא&quot; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את אלקטרופורזה לפעול בהקשר הנתונים של תוכנת bioanalyzer. בחר פרופיל אלקטרופורזה של דגימה אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדקו הפסגות הרלוונטיות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתוכנת המאהל לבדוק פסגות הרלוונטיות: &quot;כלים&quot;&gt; &quot;Mean קרינה&quot;. הכנס לתוך תיבת &quot;הקרינה&quot;ערכי הקרינה הצביעו כיחידות קרינה (FU) כפי שהם יכולים להיות הקריא מתוך תוכנת bioanalyzer. הכנס את 4 (3) פסגות עם הקרינה הגבוהה ביותר בסדר עולה המופרדים בפסיק. דוגמה: 126,130,132,137. הערה: אם לא כל FU הפסגות האלה מסומנים על ידי תוכנת bioanalyzer, הם צריכים להיות מוערכים על ידי קריאה אותם החוצה מן העלילה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על כפתור &quot;חשב&quot;. פסגה רלוונטית אם הקרינה נצפתה עולה על הערך הנתון בתיבה &quot;גובה שיא מינימאלי&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיק הגנוטיפ. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס לתיבת טקסט מאהל &quot;פיקס הקלט (נ&quot;ב)&quot; שהגדלים נ&quot;ב של כל הפסגה הרלוונטית בסדר עולה המופרדים בפסיק. דוגמה: 440.462.519.579.637. הערה: אם לא כל בגדלי שיא אלה מסומנים על ידי תוכנת bioanalyzer, הם צריכים להיות מוערכים על ידי קריאה אותם החוצה מן העלילה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על כפתור &quot;חשב&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברשימהתיבה, לחפש את המרחק המינימאלי בריבוע Mahalanobis &quot;d2m&quot;. אם ערך P המקביל זכות הוא ≥0.05 אז ההסתברות היא ≥5% שההשערה H 0 null נדחה (H 0: והנצפה והפרופיל למספרים זהים) כלומר הפרופיל ציין מקובל להיות זהה פרופיל הפניה של גנוטיפ המצוין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם d2m הוא מינימלי אבל בתחום הערך P המקביל ריק, לדחות H 0 בהסתברות &lt;5%. הערה: משמעות הדבר היא כי פרופילים הם לא שווים אף d2m היא מינימלית. תוצאה כזו עשויה לנבוע תנאי אלקטרופורזה הלא ממוצע. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לתקן את חריגות אלו, הכנס לתוך תיבת הטקסט &quot;ציין שיא (נ&quot;ב)&quot; הערך 395 ולחץ על כפתור &quot;חשב&quot;. בדוק שוב עבור d2m מינימאלית וכן ≥0.05 ערך P מקביל. אם לא מצליח, נסה את הערכים 405, 415, ו -425. הערה: לפעמים צעדים קטנים הם אפילוהצביע. אם עדיין לא מוצלח, הפרופיל שנצפה הוא לא נוכח נתוני ההפניה, זה יכול להיות הגנוטיפ או גרסה חדשים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פרופילים שונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 5.6 כדי 5.9 עבור כל פרופיל אלקטרופורזה בנפרד. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Sears, P. M., McCarthy, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Management+and+treatment+of+staphylococcal+mastitis.">Management and treatment of staphylococcal mastitis.</a> Vet.Clin.North Am.Food Anim.Pract. 19 (1), 171-185 (2003).</li><li>Fournier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bovine+Staphylococcus+aureus:+association+of+virulence+genes,+genotypes+and+clinical+outcome.">Bovine Staphylococcus aureus: association of virulence genes, genotypes and clinical outcome.</a> Res.Vet.Sci. 85 (3), 439-448 (2008).</li><li>Cosandey, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcus+aureus+genotype+B+and+other+genotypes+isolated+from+cow+milk+in+European+countries.">Staphylococcus aureus genotype B and other genotypes isolated from cow milk in European countries.</a> J.Dairy Sci. 99 (1), 529-540 (2016).</li><li>Boss, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bovine+Staphylococcus+aureus:+Subtyping,+evolution,+and+zoonotic+transfer.">Bovine Staphylococcus aureus: Subtyping, evolution, and zoonotic transfer.</a> J.Dairy Sci. 99 (1), 515-528 (2016).</li><li>Graber, H. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mastitis-related+subtypes+of+bovine+Staphylococcus+aureus+are+characterized+by+different+clinical+properties.">Mastitis-related subtypes of bovine Staphylococcus aureus are characterized by different clinical properties.</a> J.Dairy Sci. 92 (4), 1442-1451 (2009).</li><li>Heiniger, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kosten-Nutzen-Analyse+einer+Intervention+zur+Verbesserung+der+Eutergesundheit+in+Schweizer+Milchviehbetrieben.">Kosten-Nutzen-Analyse einer Intervention zur Verbesserung der Eutergesundheit in Schweizer Milchviehbetrieben.</a> Schweiz.Arch.Tierheilkd. 156 (10), 473-481 (2014).</li><li>Hamann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Definition+of+the+physiological+cell+count+threshold+based+on+changes+in+milk+composition.">Definition of the physiological cell count threshold based on changes in milk composition.</a> IDF Mastitis Newsletter. 25, 9-12 (2003).</li><li>Hwang, S. Y., Park, Y. K., Koo, H. C., Park, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=spa+typing+and+enterotoxin+gene+profile+of+Staphylococcus+aureus+isolated+from+bovine+raw+milk+in+Korea.">spa typing and enterotoxin gene profile of Staphylococcus aureus isolated from bovine raw milk in Korea.</a> J.Vet.Sci. 11 (2), 125-131 (2010).</li><li>Sakwinska, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Link+between+genotype+and+antimicrobial+resistance+in+bovine+mastitis-related+Staphylococcus+aureus+strains,+determined+by+comparing+Swiss+and+French+isolates+from+the+Rhone+Valley.">Link between genotype and antimicrobial resistance in bovine mastitis-related Staphylococcus aureus strains, determined by comparing Swiss and French isolates from the Rhone Valley.</a> Appl.Environ.Microbiol. 77 (10), 3428-3432 (2011).</li><li>Rabello, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilocus+sequence+typing+of+Staphylococcus+aureus+isolates+recovered+from+cows+with+mastitis+in+Brazilian+dairy+herds.">Multilocus sequence typing of Staphylococcus aureus isolates recovered from cows with mastitis in Brazilian dairy herds.</a> J.Med.Microbiol. 56, 1505-1511 (2007).</li><li>Tavakol, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bovine-associated+MRSA+ST398+in+the+Netherlands.">Bovine-associated MRSA ST398 in the Netherlands.</a> Acta Vet.Scand. 54, 28 (2012).</li><li>Harmsen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Typing+of+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus+in+a+university+hospital+setting+by+using+novel+software+for+spa+repeat+determination+and+database+management.">Typing of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in a university hospital setting by using novel software for spa repeat determination and database management.</a> J.Clin.Microbiol. 41 (12), 5442-5448 (2003).</li><li>Zadoks, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+pulsed-field+gel+electrophoresis+and+binary+typing+as+tools+in+veterinary+clinical+microbiology+and+molecular+epidemiologic+analysis+of+bovine+and+human+Staphylococcus+aureus+isolates.">Application of pulsed-field gel electrophoresis and binary typing as tools in veterinary clinical microbiology and molecular epidemiologic analysis of bovine and human Staphylococcus aureus isolates.</a> J.Clin.Microbiol. 38 (5), 1931-1939 (2000).</li><li>Cremonesi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+characteristics+of+Staphylococcus+aureus+strains+associated+with+high+within-herd+prevalence+of+intramammary+infections+in+dairy+cows.">Genomic characteristics of Staphylococcus aureus strains associated with high within-herd prevalence of intramammary infections in dairy cows.</a> J.Dairy Sci. 98 (10), 6828-6838 (2015).</li><li>Enright, M. C., Day, N. P., Davies, C. E., Peacock, S. J., Spratt, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilocus+sequence+typing+for+characterization+of+methicillin-resistant+and+methicillin-susceptible+clones+of+Staphylococcus+aureus.">Multilocus sequence typing for characterization of methicillin-resistant and methicillin-susceptible clones of Staphylococcus aureus.</a> J.Clin.Microbiol. 38 (3), 1008-1015 (2000).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

השלב הקריטי ביותר של ההליך כולו הוא כאשר יש עודף של דנ&quot;א RS-PCR (&gt; 30 ng DNA / assay טהור) 2. באופן כללי, ברזולוציה של פרופיל היא אופטימלית אם כל הפסגות שלה התחלה וסיום על קו הבסיס. אם שתי פסגות הם קרובים מדי זה לזה, ברזולוציה אינה שלמה. בתנאים אלה, תוכנת bioanalyzer עלולה להוביל לזיהוי שיא הולם כך זיהוי ידני נדרש. כל הפסגות המופרדות בעליל ורלוונטיות המבוטאות נ&quot;ב או FU כלולים עבור ניתוחים נוספים. תבנית ה- DNA יותר מדי עבור RS-PCR תוצאות פסגות רחבות ולכן לשיא ברזולוציה חופפת ולקויה של הפסגות. בנוסף, גירה היא מובילה איטית לשיא גדל כי הם הגדילו באופן כוזב כך גנוטיפ כבר לא יכול להיות מוסק. לבסוף, מספר פסגה הרלוונטית הוא גדול. עבור פרופילים עם יותר מ -3 פסגות, הפסגה עם קרינה מרבית צריכה בדרך כלל לא תעלה על 150 FU. Genotyping ידי RS-PCR כמתואר מוגבל על ידי העובדה כי ההשקעה במכונות הכרח תוכנת המאהל פנויה. למעשה, מכונת PCR תקנה ואת bioanalyzer נדרשים. הראשון הוא די זול בימים ואילו האחרון הוא יקר יותר. הרזולוציה של אלקטרופורזה מבוסס agarose אינה מספיק אפילו אם agarose ברזולוציה גבוהה משמש. בתנאים אלה זה רק ניתן להבחין בין GTB, GTC, וכל גנוטיפים אחרים. העלויות אלקטרופורזה באמצעות ערכת MED או אלקטרופורזה agarose, לעומת זאת, הם דומים. הערכת MED יחד עם bioanalyzer נוספת בביצועיו אלקטרופורזה agarose הסטנדרטי בצורה כי השיטה השנייה היא בהישג יד, ישר קדימה, ועל נתונים מתקבלים נוכחים בצורה אלקטרונית המפשטת אחסון וניתוח נוסף משמעותית. בעיקר כל bioanalyzers הזמין מסחרי מתאים לסוג זה של ניתוח ובלבד electrophoretic הרזולוציה היא נאותה ואת הגודל מתקבל הלהקות מדויק ובלתי משוחד. הרזולוציה של RS-PCR עבור זני שור של ס aureus הוא גבוה. זה טוב כמו הקלדת ספא, וטוב יותר מאשר MLST ו PFGE 4,14. בנוסף, בהשוואה לכל שיטות ההקלדה האחרות נפוצה עבור ס תת-סוגים (הקלדת ספא, MLST, PFGE) aureus, התפוקה המדגמת שלה היא גבוהה: מיצוי DNA הוא קל ומהיר, 96 דגימות ניתן לעבד בטווח אחד RCR (בדרך כלל O / N) ו אלקטרופורזה ו הסקת מסקנות העובדתית גנוטיפ היא ישר קדימה. הניתוח המלא של 96 דגימות דורש לילה אחד עבור PCR ויום אחד אלקטרופורזה והערכה. יתרונות נוספים של RS-PCR ידי פורנייה et al. 2 הם העלויות הנמוכות, במיוחד כשמשווים MLST הדורש שבעה גנים להיות רצף בשני הכיוונים 15. יתר על כן, RS-PCR הוא contagiosity ו פתוגניות לניבוי השיטה היחידה של זניAureus S. מעורב שור דלקת בשד 2,5, מנבאים מפתח ברפואה וטרינרית קלינית. לבסוף, RS-PCR בלבד מספיק כדי לחקור את האפידמיולוגיה של שור ס aureus 3,4,5,14. פרשנות של הנתונים היא ישר קדימה אפילו בהקשר בינלאומי כמו שרק כמה גנוטיפים עיקריים הם נצפו 2,3. להשוואות אפידמיולוגיים בין שור זני אדם, RS-PCR והקלדת ספא יחד עדיפים כשיטה האחרונה נעשתה שימוש נרחב לתת-סוגים של זני אדם כך הרבה נתונים נגישים. MLST, לעומת זאת, היא מתאימה להערכת clonality של זנים 15 ו עבור פילוגנטי מנתח 4. עבור פתרון בעיות בנוגע Cycler PCR, ערכת MED, ואת bioanalyzer, הספרים המקבילים יש להתייעץ. במקרה של שיטת RS-PCR, תקלות הן פשוטות מסיבית אם שולט PCR חיובית ושלילי מתאימים הם included בכל ריצה. במידה והשלט החיובי הוא שלילי, תמהיל PCR לא הורכב כראוי ו / או ה- DNA השליטה הייתה מושפלת. אם השליטה השלילית (H 2 O) שנוצר אחד או יותר להקות, תמהיל PCR היה מזוהם עם כמה DNA. בשני המקרים, את הפרופילים אין לפרש ו- RS-PCR יש צורך לחזור. אם פרשנות בלתי אפשרית בגלל בעית electrophoretic, אלקטרופורזה צריך להיות חוזר ונשנה באמצעות שבב חדש. בעיות Electrophoretic מאופיינות בדרך כלל על ידי הגירה לקוית ויישור של אחד או שני להקות הסמן הנובע טעינה הולם מניפולציה של השבב. אם פרופיל אלקטרופורזה שהושג לא יכול להתפרש על ידי תוכנת המאהל, קובץ הפרופיל שנוצר על ידי תוכנת bioanalyzer נשלח המחבר לצורך הערכה נוספת. בדרך כלל, יותר מדי DNA תבנית נעשה שימוש עבור RS-PCR או פרופיל מייצג גנוטיפ חדש או גרסה גנוטיפ.

סטפילוקוקוס (S. aureus) ידוע בתור הפתוגן החשוב ביותר בעולם האחראי לזיהום intramammary (תעש) בבקר 1. מחקרם של פורנייה et al. 2 הפגינו פרות השוויצרי לבין מחקרים על ידי Cosandey et al. 3 ו בוס et al. 4 בפרות של 12 מדינות אירופה כי ס aureus מבודד שור תעש היא קבוצה הטרוגנית גנטית. על ידי PCR הגברה של אזור spacer 16S-23S rRNA גניים (RS-PCR), סך של 17 גנוטיפים בתחילה התגלו 101 אפידמיולוגיה עצמאית מבודדים 2. גנוטיפ B ו- C גנוטיפ (GTC) היו הנפוצים ביותר (80%), לעומת 15 גנוטיפים אחרים (GTS) התרחשו לעתים רחוקות, כל מה שהופך 1 עד 4% מכלל הבידודים. ברמה 3 האירופי, GTB, GTC, GTF, GTI, ו GTR היו גנוטיפים החשובים ביותר המהווים 76% מכלל זני ניתח (n = 456). GTB היה ממוקם במרכז אירופה whereas גנוטיפים אחרים הופצו באופן נרחב. 24% הנותרים של הזנים כללו 41 גנוטיפים, רבים מהם, עם זאת, נצפו רק פעם אחת. המחקרים ידי פורנייה et al. 2, Cosandey et al. 3, ו גרבר et al. 5 הפגינו עוד כי גנוטיפים היו קשורים מאוד עם דפוס הגנים הארסיים שלהם, כמו גם על שוויצרי ברמה האירופית. המחקרים נוספים חשף הבדלים מסיביים בשכיחות תעש בין ס aureus GTB, GTC ואת גנוטיפים אחרים 2,5: בהתחשב GTB, עד 87% של פרות בעדר נדבקו גנוטיפ זה. במקרה של GTC ושל גנוטיפים אחרים, לעומת זאת, תעש נמצא רק 1 עד 2 פרות של עדר. תעש הנגרם על ידי S. aureus, בדרך כלל תוצאות דלקת של בלוטות החלב המקבילות וגידול של תאים דלקתיים בחלב. כתוצאה מכך, שיתוף תא סומטיunts בחלב (SCC), מחוון המפתח של איכות חלב ברוב מדינות העולם, הוא גדל מוביל מחיר חלב ירד או להפסיק בלידה אפילו. מלבד RS-PCR של פורנייה et al. 2, שיטות הקלדה אחרות תוארו עבור תת-סוגי זני שור של ס aureus 8-11. שני נפוצים כוללים הקלדת ספא 12 ו Multi לוקוס רצף הקלדה (MLST) 13. האחד לשעבר מבוסס על DNA רצף באזור spacer משתנה של הגן המקודד ספא staphylococcal לחלבון A, ואילו אחד הדרישות המאוחרות רצף של 7 גנים משק. משמעות הדבר היא כי אחד 12 ושבעה PCRs 13, בהתאמה, צריכה להתבצע, ואחריו טיהור amplicon, תגובת סידור וניתוח באמצעות ציוד ספציפי. לעומת RS-PCR, השיטות האלה דורשות מאמץ נוסף ניכר במעבדה וכתוצאה מכך תפוקת מדגם נמוכה ומחירים גבוהים. ההתפוקה נמוכה במיוחד עבור PFGE. בהתחשב ברזולוציה של שיטות אלה זני שור של ס aureus, RS-PCR הוא טוב לפחות כמו ספא הקלדת 4 וטוב יותר מאשר MLST 4 או PFGE 15. כל השיטות הללו כוללים הקלדה בינארי 13 הפגינו יעילותם בהשגת תובנה נוספת לתוך בפתוגנזה של שור תעש הנגרמת על ידי S. aureus, אבל בגלל המגבלות שהוזכרו הם פחות מתאימים חקירות קליניות גדולות. בנוסף, גנוטיפ ידי RS-PCR כפי שתואר על ידי פורנייה et al. 2 מאפשר חיזוי אמין של אפידמיולוגיים והפוטנציאל פתוגניים של ס aureus מעורב שור תעש, שני ערכים מרכזיים ברפואת וטרינרית קלינית.

<table><tbody><tr><td>Tris(hydroxymethyl)-aminomethan</td><td>Merck</td><td>1.08382.0500</td><td>Mw = 121.14 g/mol</td></tr><tr><td>Titriplex III</td><td>Merck</td><td>1.08418.0250</td><td>Mw = 372.24 g/mol; Substance is equivalent to Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;EDTA&amp;middot;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>Hydrochloric acid 5 mol/L</td><td>Merck</td><td>1.09911.0001</td><td></td></tr><tr><td>Columbia agar+5% sheep blood</td><td>bioM&amp;eacute;rieux</td><td>43049</td><td></td></tr><tr><td>Agilent DNA7500 Kit</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1504</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2940CA</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 2100 expert sofware</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HotStarTaq master mix&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>203445</td><td></td></tr><tr><td>Primer L1</td><td>Mycrosinth</td><td></td><td>5&#039;CAA GGC ATC CAC CGT3&#039;</td></tr><tr><td>Primer G1</td><td>Mycrosinth</td><td></td><td>5&#039;GAA GTC GTA ACA AGG3&#039;</td></tr></tbody></table>

genotyping of staphylococcus aureus by ribosomal spacer pcr (rs-pcr)

The ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is a highly resolving and robust genotyping method for S. aureus that allows a high throughput at moderate costs and is, therefore, suitable to be used for routine purposes. For best resolution, data evaluation and data management, a miniaturized electrophoresis system is required. Together with such an electrophoresis system and the in-house developed software (freely available here) assignment of the pattern of bands to a genotype is standardized and straight forward. DNA extraction is simple (boiling prep), setting-up of the reactions is easy and they can be run on any standard PCR machine. PCR cycling is common except prolonged ramping and elongation times. Compared to spa typing and Multi Locus Sequence Typing (MLST), RS-PCR does not require DNA sequencing what simplifies the analysis considerably and allows a high throughput. Furthermore, the resolution for bovine strains of S. aureus is at least as good as spa typing and better than MLST or pulsed-field gel electrophoresis (PFGE). The RS-PCR data base includes presently a total of 141 genotypes and variants. The method is highly associated with the virulence gene pattern, contagiosity and pathogenicity of S. aureus strains involved in bovine mastitis. S. aureus genotype B (GTB) is contagious and causes herds problems causing large costs in the Switzerland and other European countries. All the other genotypes observed in Switzerland infect individual cows and quarters. Genotyping by RS-PCR allows the reliable prediction of the epidemiological and the pathogenic potential of S. aureus involved in bovine intramammary infection (IMI), two key factors for clinical veterinary medicine. Because of these beneficial properties together with moderate costs and a high sample throughput the goal of this publication is to give a detailed, step-by-step protocol for easily establishing and running RS-PCR for genotyping S. aureus in other laboratories.

הגדרה של גנוטיפ גירסאותיה פרופיל electrophoretic הנבדלים יותר להקה אחת מכל גנוטיפים המזוהה נחשב גנוטיפ חדש. גנוטיפים חדשים בשם והאריך פי פורנייה et al. 5 המוביל גנוטיפים GTA כדי GTZ, ואחריו גנוטיפים GTAA כדי GTAZ, ו GTBA כדי GTBZ, ו GTCA כדי GTCC כיום. וריאציה רק ​​להקה אחת נחשבת כווריאציה גנוטיפ. יצוין עם ספרות רומית העילית אחרי השם של הגנוטיפ (למשל, GTRI, GTRII). בסך הכל, ישנם כיום 141 גנוטיפים וגירסאות בבסיס הנתונים התייחסות. בתנאים שתוארו לעיל, RS-PCR ידי פורנייה et al. 5 הוא מאוד לשחזור כדי גנוטיפ זנים של S. aureus. זיהוי סופי שלגנוטיפ או גרסה ידוע הוא תמיד אפשרי אם ניתן לשלול בעיות טכניות. אחת תוצאות טיפוסיות מוצגות באיור 1 הוכחת אלקטרופורזה של 12 RS-PCR מוצרים המוצגות במצב ג&#39;ל פסאודו ידי תוכנת bioanalyzer. שביל כל מאופיין דפוס של שתיים או יותר להקות PCR ולהקה סמן מלפנים להקה סמן בסוף. לחיצה כפולה לתוך סמטה פותחת את פרופיל electrophoretic המקביל, הנמדד בפועל בחלון נפרד. Bioanalyzer התוכנה מאפשרת, בין אפשרויות אחרות, הפסגות הנצפות להיות לקרוא כמו גודל כמו FU יחידות ניאון (איור 2) או ב BP (איור 3) לפיה שיא אחד מתאים בדיוק להקה אחת במצב פסאודו-ג&#39;ל. קריאת שיא FU נדרשה להערכת הפסגות הרלוונטיות של פרופיל בתוכנת המאהל (איור 4), קריאה נ&quot;ב כדי להסיק מסקנה הגנוטיפ. פסגות לא רלוונטיות מוגדרות בתוכנת המאהל כמו אפונה קטנהks שאת FU קרינה נצפית הוא מתחת ל -40% של הממוצע הגיאומטרי של 4 (3) פסגות עם הקרינה הגבוהה ביותר. הם הם נצפו בדרך כלל כאשר יש עודף של דנ&quot;א RS-PCR (&gt; 30 ng DNA / assay טהור) 2. כדוגמה, הגנוטיפ של ההווה מדגם 211 באיור 1 הוא להסיק. ניתוח חזותי של הפרופיל electrophoretic ב 2 איור (תוכנת bioanalyzer) וניתוח עם תוכנת מאהל שימוש באפשרות לבדוק פסגות רלוונטיות חשף 6 פסגות רלוונטיות בגדלי שיא של 395 נ&quot;ב, 432 נ&quot;ב, 453 נ&quot;ב, 505 נ&quot;ב, 567 נ&quot;ב, ו 622 נ&quot;ב (איור 3). ערכים אלה מולאו והופרדו פסיק &quot;פיקס הקלט (נ&quot;ב)&quot; הטקסט של תוכנת המאהל (איור 4). כדי לתקן את החריגות ספציפיות לרוץ, הערך 415 הוכנס לתוך תיבת הטקסט &quot;ציינה שיא (נ&quot;ב)&quot; (איור 4). לאחר הלחיצה &quot;Calculate &quot;כפתור, רשימה מוצגת מסודרת על פי גנוטיפ יחד עם d2m מרחק Mahalanobis בריבוע בין השאילתה והצביע פרופיל גנוטיפ. גלול ברשימה מחפשת d2m המינימאלי. במקרה הנוכחי, d2m המינימאלי שווה 4.499 (איור 4) עם ערך של P ≥0.05, כלומר פרופיל השאילתה אינו שונה באופן משמעותי מזו של GTB. נוסחים שונים של גנוטיפים מסומנים ככאלה _I כדי _XV בתוכנת המאהל. במקרה של גנוטיפ B, יש שלוש גרסאות GBT לי, GBT II ו- III GBT הצביעו כפי B_I, B_II, ו B_III בתוכנה (איור 4). שבב של ערכת MED מאפשר מוצרי ניתוח של 12 RS-PCR בכל פעם. אם מוצרים פחות זמינים, הבארות הנותרות צריכות להיות טעונות עם מים ללא יונים. התוצאות עשויות להתפרש רק אם בקרות included ב RS-PCR מתאים. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54623/54623fig1.jpg" /> באיור 1. ג&#39;ל פסאודו מייצגים 12 RS-PCR מוצרים גנוטיפים המשוערת שלהם. שנתי עשרה זנים שונים של ס aureus נותח על ידי RS-PCR באמצעות ערכת MED יחד עם bioanalyzer ואת התוכנה הכלולה. השביל בצד שמאל ניתן לראות את הסמן או &quot;סולם&quot; לכיול גודל של המערכת נ&quot;ב. בחלק העליון של הגרפיקה, שמות המדגם ואת גנוטיפים המקבילים הם לדין כי התקבלו על ידי תוכנת המאהל. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54623/54623fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54623/54623fig2.jpg" /> איור 2. פרופיל Electrophoretic של sample 161 נוכחי באיור 1. על גבי פסגות הקרינה הנמדדת מצוינת FU. ראיית פסגות להבחין כי לא אותרו על ידי צורך תוכנת bioanalyzer כדי להיות מוערכות על ידי קריאה אותם מן העלילה כפי שבוצע על השיא עם ערך קרינה משוערת של 113 FU (בכחול). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54623/54623fig2large.jpg" target="_blank">נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של זה דמות.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/54623/54623fig3.jpg" /> איור 3. Electrophoretic פרופיל של מדגם 211 נוכחי באיור 1. על גבי פסגות גודלם מצוינים נ&quot;ב. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54623/54623fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" sRC = &quot;/ files / ftp_upload / 54,623 / 54623fig4.jpg&quot; /&gt; איור 4. צילום מסך של תוכנת המאהל. בתיבת הטקסט &quot;פיקס קלט (נ&quot;ב)&quot; בגדלי השיא של מדגם 211 מהתרשים 3 מולאו. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54623/54623fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR RS-PCR at JoVE.com

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR RS-PCR

Here, ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is used together with a miniaturized electrophoresis system as a fast and high resolution method for genotyping S. aureus at moderate costs allowing a high throughput.

genotyping של<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; על ידי ריבוזומלי Spacer PCR (RS-PCR)

The ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is a highly resolving and robust genotyping method for S. aureus that allows a high throughput at moderate costs and is, ...

genotyping-of-staphylococcus-aureus-by-ribosomal-spacer-pcr-rs-pcr

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR (RS-PCR)

9.6K Views.  Agroscope. Here, ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is used together with a miniaturized electrophoresis system as a fast and high resolution method for genotyping S. aureus at moderate costs allowing a high throughput.

Video: Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR RS-PCR

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in which the gene of interest has been disrupted. A gene-disruption DNA construct containing a suitable antibiotic resistance marker gene is useful for the generation of gene-disrupted strains in bacteria. However, conventional construction methods, which require gene cloning steps, involve complex and time-consuming protocols. Here, a relatively facile, rapid, and cost-effective method for targeted gene disruption in Streptococcus mutans is described. The method utilizes a 2-step fusion polymerase chain reaction (PCR) to generate the disruption construct and electroporation for genetic transformation. This method does not require an enzymatic reaction, other than PCR, and additionally offers greater flexibility in terms of the design of the disruption construct. Employment of electroporation facilitates the preparation of competent cells and improves the transformation efficiency. The present method may be adapted for the generation of gene-disrupted strains of various species.

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

We describe a facile, rapid, and relatively inexpensive method for the generation of gene-disrupted Streptococcus mutans strains; this technique may be adapted for the generation of gene-disrupted strains of various species.

מהדור ג'ין-שיבשו סטרפטוקוקוס mutans זן בלי ג'ין שיבוט

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in ...

Genetics

One-day Workflow Scheme for Bacterial Pathogen Detection and Antimicrobial Resistance Testing from Blood Cultures

Bloodstream infections are associated with high mortality rates because of the probable manifestation of sepsis, severe sepsis and septic shock1. Therefore, rapid administration of adequate antibiotic therapy is of foremost importance in the treatment of bloodstream infections. The critical element in this process is timing, heavily dependent on the results of bacterial identification and antibiotic susceptibility testing. Both of these parameters are routinely obtained by culture-based testing, which is time-consuming and takes on average 24-48 hours2, 4. The aim of the study was to develop DNA-based assays for rapid identification of bloodstream infections, as well as rapid antimicrobial susceptibility testing. The first assay is a eubacterial 16S rDNA-based real-time PCR assay complemented with species- or genus-specific probes5. Using these probes, Gram-negative bacteria including Pseudomonas spp., Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli as well as Gram-positive bacteria including Staphylococcus spp., Staphylococcus aureus, Enterococcus spp., Streptococcus spp., and Streptococcus pneumoniae could be distinguished. Using this multiprobe assay, a first identification of the causative micro-organism was given after 2 h.
Secondly, we developed a semi-molecular assay for antibiotic susceptibility testing of S. aureus, Enterococcus spp. and (facultative) aerobe Gram-negative rods6. This assay was based on a study in which PCR was used to measure the growth of bacteria7. Bacteria harvested directly from blood cultures are incubated for 6 h with a selection of antibiotics, and following a Sybr Green-based real-time PCR assay determines inhibition of growth. The combination of these two methods could direct the choice of a suitable antibiotic therapy on the same day (Figure 1). In conclusion, molecular analysis of both identification and antibiotic susceptibility offers a faster alternative for pathogen detection and could improve the diagnosis of bloodstream infections.

The design of a straightforward one-day workflow scheme for bacterial pathogen diagnostics enables the rapid recognition of bloodstream infections. The inclusion of eight clinically relevant bacterial targets and their antibiotic resistance profiles offers the clinician an initial insight on the same day, which can lead to more adequate therapy.

יום אחד זרימת עבודה עבור תוכנית זיהוי פתוגן חיידקי ובדיקות ההתנגדות Antimicrobial מתרבויות דם

Bloodstream infections are associated with high mortality rates because of the probable manifestation of sepsis, severe sepsis and septic shock1. ...

Biosensor for Detection of Antibiotic Resistant Staphylococcus Bacteria

A structurally transformed lytic bacteriophage having a broad host range of Staphylococcus aureus strains and a penicillin-binding protein (PBP 2a) antibody conjugated latex beads have been utilized to create a biosensor designed for discrimination of methicillin resistant (MRSA) and sensitive (MSSA) S. aureus species 1,2. The lytic phages have been converted into phage spheroids by contact with water-chloroform interface. Phage spheroid monolayers have been moved onto a biosensor surface by Langmuir-Blodgett (LB) technique 3. The created biosensors have been examined by a quartz crystal microbalance with dissipation tracking (QCM-D) to evaluate bacteria-phage interactions. Bacteria-spheroid interactions led to reduced resonance frequency and a rise in dissipation energy for both MRSA and MSSA strains. After the bacterial binding, these sensors have been further exposed to the penicillin-binding protein antibody latex beads. Sensors analyzed with MRSA responded to PBP 2a antibody beads; although sensors inspected with MSSA gave no response. This experimental distinction determines an unambiguous discrimination between methicillin resistant and sensitive S. aureus strains. Equally bound and unbound bacteriophages suppress bacterial growth on surfaces and in water suspensions. Once lytic phages are changed into spheroids, they retain their strong lytic activity and show high bacterial capture capability. The phage and phage spheroids can be utilized for testing and sterilization of antibiotic resistant microorganisms. Other applications may include use in bacteriophage therapy and antimicrobial surfaces.

Lytic phage biosensors and antibody beads are able to discriminate between methicillin resistant (MRSA) and sensitive staphylococcus bacteria. The phages were immobilized by a Langmuir-Blodgett method onto a surface of a quartz crystal microbalance sensor and worked as broad range staphylococcus probes. Antibody beads recognize MRSA.

Biosensor לאיתור של חיידקי סטפילוקוקוס עמידים לאנטיביוטיקה

A structurally transformed lytic bacteriophage having a broad host range of Staphylococcus aureus strains and a penicillin-binding protein (PBP 2a) ...

Bioengineering

Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec) typing is a very important molecular tool for understanding the epidemiology and clonal strain relatedness of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA), particularly with the emerging outbreaks of community-associated MRSA (CA-MRSA) occurring on a worldwide basis. Traditional PCR typing schemes classify SCCmec by targeting and identifying the individual mec and ccr gene complex types, but require the use of many primer sets and multiple individual PCR experiments. We designed and published a simple multiplex PCR assay for quick-screening of major SCCmec types and subtypes I to V, and later updated it as new sequence information became available. This simple assay targets individual SCCmec types in a single reaction, is easy to interpret and has been extensively used worldwide. However, due to the sophisticated nature of the assay and the large number of primers present in the reaction, there is the potential for difficulties while adapting this assay to individual laboratories. To facilitate the process of establishing a MRSA SCCmec assay, here we demonstrate how to set up our multiplex PCR assay, and discuss some of the vital steps and procedural nuances that make it successful.

Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

We demonstrate a simple multiplex PCR assay for quick-screening and typing of Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec) types I-V for methicillin-resistant Staphylococcus aureus, and provide some of the vital steps and procedural nuances that make it successful for adapting this assay to individual laboratories.

Multiplex assay PCR ?????? ?? ???? Mec ???????? ???? Staphylococcal I ?V ?-methicillin<em&gt; ???????????</em

Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec) typing  is a very important molecular tool for understanding the epidemiology and  clonal strain ...

MS2-Affinity Purification Coupled with RNA Sequencing in Gram-Positive Bacteria

Although small regulatory RNAs (sRNAs) are widespread among the bacterial domain of life, the functions of many of them remain poorly characterized notably due to the difficulty of identifying their mRNA targets. Here, we described a modified protocol of the MS2-Affinity Purification coupled with RNA Sequencing (MAPS) technology, aiming to reveal all RNA partners of a specific sRNA in vivo. Broadly, the MS2 aptamer is fused to the 5&#8217; extremity of the sRNA of interest. This construct is then expressed in vivo, allowing the MS2-sRNA to interact with its cellular partners. After bacterial harvesting, cells are mechanically lysed. The crude extract is loaded into an amylose-based chromatography column previously coated with the MS2 protein fused to the maltose binding protein. This enables the specific capture of MS2-sRNA and interacting RNAs. After elution, co-purified RNAs are identified by high-throughput RNA sequencing and subsequent bioinformatic analysis. The following protocol has been implemented in the Gram-positive human pathogen Staphylococcus aureus and is, in principle, transposable to any Gram-positive bacteria. To sum up, MAPS technology constitutes an efficient method to deeply explore the regulatory network of a particular sRNA, offering a snapshot of its whole targetome. However, it is important to keep in mind that putative targets identified by MAPS still need to be validated by complementary experimental approaches.

MAPS technology has been developed to scrutinize the targetome of a specific regulatory RNA in vivo. The sRNA of interest is tagged with a MS2 aptamer enabling the co-purification of its RNA partners and their identification by RNA sequencing. This modified protocol is particularly suited for Gram-positive bacteria.&#160;

טיהור MS2-זיקה בשילוב עם רצף RNA בחיידקים גראם חיוביים

Although small regulatory RNAs (sRNAs) are widespread among the bacterial domain of life, the functions of many of them remain poorly characterized ...

Biochemistry

Identification of Rare Bacterial Pathogens by 16S rRNA Gene Sequencing and MALDI-TOF MS

There are a number of rare and, therefore, insufficiently described bacterial pathogens which are reported to cause severe infections especially in immunocompromised patients. In most cases only few data, mostly published as case reports, are available which investigate the role of such pathogens as an infectious agent. Therefore, in order to clarify the pathogenic character of such microorganisms, it is necessary to conduct epidemiologic studies which include large numbers of these bacteria. The methods used in such a surveillance study have to meet the following criteria: the identification of the strains has to be accurate according to the valid nomenclature, they should be easy to handle (robustness), economical in routine diagnostics and they have to generate comparable results among different laboratories. Generally, there are three strategies for identifying bacterial strains in a routine setting: 1) phenotypic identification characterizing the biochemical and metabolic properties of the bacteria, 2) molecular techniques such as 16S rRNA gene sequencing and 3) mass spectrometry as a novel proteome based approach. Since mass spectrometry and molecular approaches are the most promising tools for identifying a large variety of bacterial species, these two methods are described. Advances, limitations and potential problems when using these techniques are discussed.

Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) and molecular techniques (16S rRNA gene sequencing) permit the identification of rare bacterial pathogens in routine diagnostics. The goal of this protocol lies in the combination of both techniques which leads to more accurate and reliable data.

זיהוי של חיידקים פתוגנים נדירים לפי 16S rRNA ג&#39;ין סידור MALDI-TOF MS

There are a number of rare and, therefore, insufficiently described bacterial pathogens which are reported to cause severe infections especially in ...

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Transposon mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is less time consuming, less costly, and does not require completed genome information, there are two weaknesses in this method: (1) the possibility of a disparate mutants in the mixed mutant library that counter-selects mutants with decreased competition; and (2) the possibility of partial gene inactivation whereby genes do not entirely lose their function following the insertion of a transposon. Single-gene deletion analysis may compensate for the drawbacks associated with transposon mutagenesis. To improve the efficiency of genome-wide single gene deletion, we attempt to establish a high-throughput technique for genome-wide single gene deletion using Streptococcus sanguinis as a model organism. Each gene deletion construct in S. sanguinis genome is designed to comprise 1-kb upstream of the targeted gene, the aphA-3 gene, encoding kanamycin resistance protein, and 1-kb downstream of the targeted gene. Three sets of primers F1/R1, F2/R2, and F3/R3, respectively, are designed and synthesized in a 96-well plate format for PCR-amplifications of those three components of each deletion construct. Primers R1 and F3 contain 25-bp sequences that are complementary to regions of the aphA-3 gene at their 5' end. A large scale PCR amplification of the aphA-3 gene is performed once for creating all single-gene deletion constructs. The promoter of aphA-3 gene is initially excluded to minimize the potential polar effect of kanamycin cassette. To create the gene deletion constructs, high-throughput PCR amplification and purification are performed in a 96-well plate format. A linear recombinant PCR amplicon for each gene deletion will be made up through four PCR reactions using high-fidelity DNA polymerase. The initial exponential growth phase of S. sanguinis cultured in Todd Hewitt broth supplemented with 2.5% inactivated horse serum is used to increase competence for the transformation of PCR-recombinant constructs. Under this condition, up to 20% of S. sanguinis cells can be transformed using ~50 ng of DNA. Based on this approach, 2,048 mutants with single-gene deletion were ultimately obtained from the 2,270 genes in S. sanguinis excluding four gene ORFs contained entirely within other ORFs in S. sanguinis SK36 and 218 potential essential genes. The technique on creating gene deletion constructs is high throughput and could be easy to use in genome-wide single gene deletions for any transformable bacteria.

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

An efficient genome-wide single gene mutation method has been established using Streptococcus sanguinis as a model organism. This method has achieved via high throughput recombinant PCRs and transformations.

מחיקות Gene הגנום ב<em&gt; סטרפטוקוקוס sanguinis</em&gt; על ידי תפוקה הגבוהה PCR

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

Biology

Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the long-lasting gold standards is to sequence 16S ribosomal RNA (rRNA) gene amplicons generated by domain-level PCR reactions amplifying from genomic DNA. Traditionally, this was performed by cloning and Sanger (capillary electrophoresis) sequencing of PCR amplicons. The advent of next-generation sequencing has tremendously simplified and increased the sequencing depth for 16S rRNA gene sequencing. The introduction of benchtop sequencers now allows small labs to perform their 16S rRNA sequencing in-house in a matter of days. Here, an approach for 16S rRNA gene amplicon sequencing using a benchtop next-generation sequencer is detailed. The environmental DNA is first amplified by PCR using primers that contain sequencing adapters and barcodes. They are then coupled to spherical particles via emulsion PCR. The particles are loaded on a disposable chip and the chip is inserted in the sequencing machine after which the sequencing is performed. The sequences are retrieved in fastq format, filtered and the barcodes are used to establish the sample membership of the reads. The filtered and binned reads are then further analyzed using publically available tools. An example analysis where the reads were classified with a taxonomy-finding algorithm within the software package Mothur is given. The method outlined here is simple, inexpensive and straightforward and should help smaller labs to take advantage from the ongoing genomic revolution.

Characterizing microbial community has been a longstanding goal in environmental microbiology. Next-generation sequencing methods now allow for the characterization of microbial communities at an unprecedented depth with minimal cost and labor. We detail here our approach to sequence bacterial 16S ribosomal RNA genes using a benchtop sequencer.

רצף של הדור הבא של 16S ריבוזומלי amplicons ג&#39;ין RNA

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the ...

Efficient Nucleic Acid Extraction and 16S rRNA Gene Sequencing for Bacterial Community Characterization

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing technologies have allowed for the rapid and efficient characterization of bacterial communities using 16S rRNA gene sequencing from a variety of sources. Although readily available tools for 16S rRNA sequence analysis have standardized computational workflows, sample processing for DNA extraction remains a continued source of variability across studies. Here we describe an efficient, robust, and cost effective method for extracting nucleic acid from swabs. We also delineate downstream methods for 16S rRNA gene sequencing, including generation of sequencing libraries, data quality control, and sequence analysis. The workflow can accommodate multiple samples types, including stool and swabs collected from a variety of anatomical locations and host species. Additionally, recovered DNA and RNA can be separated and used for other applications, including whole genome sequencing or RNA-seq. The method described allows for a common processing approach for multiple sample types and accommodates downstream analysis of genomic, metagenomic and transcriptional information.

We describe an efficient, robust, and cost effective method for extracting nucleic acid from swabs for characterization of bacterial communities using 16S rRNA gene amplicon sequencing. The method allows for a common processing approach for multiple sample types and accommodates a number of downstream analytic processes.

הפקת חומצות גרעין יעיל 16S rRNA ג&#39;ין רצף עבור בקטריאלי קהילת אפיון

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing ...

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the immune system. Perturbation of the healthy gut microbiome has been suggested to play a role in the development of inflammatory diseases, including multiple sclerosis (MS). Environmental and genetic factors can influence the composition of the microbiome; therefore, identification of microbial communities linked with a disease phenotype has become the first step towards defining the microbiome&#8217;s role in health and disease. Use of 16S rRNA metagenomic sequencing for profiling bacterial community has helped in advancing microbiome research. Despite its wide use, there is no uniform protocol for 16S rRNA-based taxonomic profiling analysis. Another limitation is the low resolution of taxonomic assignment due to technical difficulties such as smaller sequencing reads, as well as use of only forward (R1) reads in the final analysis due to low quality of reverse (R2) reads. There is need for a simplified method with high resolution to characterize bacterial diversity in a given biospecimen. Advancements in sequencing technology with the ability to sequence longer reads at high resolution have helped to overcome some of these challenges. Present sequencing technology combined with a publicly available metagenomic analysis pipeline such as R-based Divisive Amplicon Denoising Algorithm-2 (DADA2) has helped advance microbial profiling at high resolution, as DADA2 can assign sequence at the genus and species levels. Described here is a guide for performing bacterial profiling using two-step amplification of the V3-V4 region of the 16S rRNA gene, followed by analysis using freely available analysis tools (i.e., DADA2, Phyloseq, and METAGENassist). It is believed that this simple and complete workflow will serve as an excellent tool for researchers interested in performing microbiome profiling studies.

Described here is a simplified standard operating procedure for microbiome profiling using 16S rRNA metagenomic sequencing and analysis using freely available tools. This protocol will help researchers who are new to the microbiome field as well as those requiring updates on methods to achieve bacterial profiling at a higher resolution.

אנליזה microbiota באמצעות שני שלבים PCR ו-הדור הבא של 16 rRNA גן רצף

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...

genotyping של

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

מהדור ג'ין-שיבשו סטרפטוקוקוס mutans זן בלי ג'ין שיבוט

יום אחד זרימת עבודה עבור תוכנית זיהוי פתוגן חיידקי ובדיקות ההתנגדות Antimicrobial מתרבויות דם

Biosensor לאיתור של חיידקי סטפילוקוקוס עמידים לאנטיביוטיקה

Multiplex assay PCR ?????? ?? ???? Mec ???????? ???? Staphylococcal I ?V ?-methicillin

טיהור MS2-זיקה בשילוב עם רצף RNA בחיידקים גראם חיוביים

זיהוי של חיידקים פתוגנים נדירים לפי 16S rRNA ג'ין סידור MALDI-TOF MS

מחיקות Gene הגנום ב

רצף של הדור הבא של 16S ריבוזומלי amplicons ג'ין RNA

הפקת חומצות גרעין יעיל 16S rRNA ג'ין רצף עבור בקטריאלי קהילת אפיון

אנליזה microbiota באמצעות שני שלבים PCR ו-הדור הבא של 16 rRNA גן רצף