Name: next-generation sequencing of 16s ribosomal rna gene amplicons
Uploaded: 2014-08-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons at JoVE.com

Development of the method presented here has been carried out with various sources of funding, including Genome Canada and Genome Quebec, Environment Canada STAGE program and internal NRC funds.

.1 16S rRNA ג&#39;ין Amplicon ספריית הכנה על ידי שיטת Fusion <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר פריימרים (קדימה, F343-Iona-MIDXX: 5&#39;- CAT CCA TCT CCC TGC GTG TCT CCG T AC CAG XXX XXX XXX XTA CGG RAG GCA GCA G-3 &#39;; הפוך, R533-IonP1: 5&#39;- CCT CTC TAT GGG CAG TCG GTG AT TTA CCG CGG CTG CTG GC-3 &#39;; נועזים: מתאמים ספציפיים יון Torrent; נטוי: מפתח לקביעת רצף לכיול עוצמת אות בתחילת ריצת הרצף; גופן רגיל: פריימרים ייחודיים לתבנית; X ... X: 10 רקוד נ&quot;ב, ראה טבלה 1 לכמה רצפים ברקוד), תערובת מאסטר 2x HotStartTaq פלוס והדגימות. מערבבים היטב לפני השימוש, פרט לתערובת ההורים שצריכים להיות מעורבים בעדינות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין תערובת PCR (20 תגובות μl) עם 0.5 מיקרומטר של פריימר ההפוכה, 0.4 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​של סרום שור Albumine (BSA) ומיקס מאסטר 1x HotStartTaq פלוס. הוספת 18.5 μl של מיקס מאסטר לדוארצינור ACH PCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף פריימר קדימה (0.5 μl ב20 מ&quot;מ) עם ברקוד שונה לכל אחת מהדגימות שיהיה רצף ביחד. הוסף 1 μl של מדגם (1-10 ng / μl) לצינור PCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצינורות במכונה PCR ולהפעיל את התכנית הבאה: denaturation הראשוני ב 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות; 25 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס במשך 30 שניות, 55 מעלות צלזיוס במשך 30 שניות ו72 מעלות צלזיוס למשך 45 שניות; התארכות סופית 72 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. יכולים להיות כל הזמן מוצרי PCR על 4 מעלות CO / N או קפוא עד שימוש. </li></ol> .2 Amplicon טיהור, כימות ואיגום <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 2% agarose ג&#39;ל באמצעות המסרקים הגדולים ביותר זמינים. הוסף 5 μl של טעינת צבע ג&#39;ל 6x לתגובה ועומס על הג&#39;ל, הפרדה כל דגימה על ידי ריק גם. הפעל את הג&#39;ל על 70 V ל50 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח תמונה של ג&#39;ל ולחתוך את הרצועות (גודל צפוי סביב 250 נ&quot;ב: מוצר נ&quot;ב 190 תוספת 63 מתאמים נ&quot;ב ורקודים) באמצעות אזמל נקי. </li><li&gt; לשקול את הלהקות נכרתה ולהמשיך בחילוץ ג&#39;ל וטיהור של מוצרי PCR (עם לדוגמא, ערכת Qiaquick חילוץ ג&#39;ל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת כל מוצר PCR עם PicoGreen ולעשות דילולים להשיג פתרון מניות ב5 x 10 9 מולקולות / μl (כ 1 ננוגרם / μl). אם כמה דוגמאות להראות הגברה נמוכה יותר, להתאים את דילולים לריכוז נמוך יותר, תוך התחשבות כי הריכוז הנמוך ביותר המתאימים לנהלים הבאים הוא 1.57 x 10 7 מולקולות / μl (26 PM). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בריכת 10 μl של כל מוצר PCR מדולל כדי לקבל בריכת equimolar של דגימות. הכן בריכה נפרדת אחד עבור כל אחד מריצת הרצף המתוכננת. יכולים להיות כל הזמן מוצרי PCR נקוו במקפיא עד שימוש. </li></ol> .3 אמולסיה PCR ורצף <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע PCR תחליב: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את מוצרי PCR ונקוו ל26 PM בנפח של 25 μl. ריאגנטים הפשרה מערכת תבנית יון PGM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכין את תערובת תחליב PCR (ריאגנטים המסופקים בערכה) במנדף PCR ולהוסיף מוצרים ויקוו PCR וחלקיקי הכדור (בתנאי) על הספסל. מערבבים היטב ומכניס את התערובת במחסנית מסנן ולמעלה בזהירות עם שמן תחליב (בתנאי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט לאט להפוך את מחסנית המסנן ועומס על מנגנון התחליב האוטומטי PCR (למשל, Touch 2 מכשיר יון אחת). בחר את התכנית המתאימה ולהתחיל את ההליך. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר התחליב האוטומטי PCR השלים, להסיר את supernatant מצינורות האיסוף ואחזור חלקיקי הכדור בחלק התחתון של הצינורות. Resuspend התחומים של פתרון לשטוף (מסופק בערכה) 100 μl ולקחת aliquot 2.0 μl לכימות ספרייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע כימות הספרייה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים של חיץ SSPE (150 mM NaCl, 10mm 4 Napo, 1 המ&quot;מ Na 2 -EDTA) עם 2 μl של מתאם B&#39;-Fam (5&#39;- FAM -CT 100 μlG AGA CTG CCA AGG CAC ACA GGG GAT AGG-3 &#39;) בדיקה ו2 μl של המתאם-Cy5 (5&#39;- CAT Cy5 -CCA TCT CCC TGC GTG TCT CCG ACT CAG-3&#39;) בדיקה. הוספת 52 μl של תערובת זו לaliquot 2.0 μl נלקח בשלב 3.2 ולהוסיף 2 μl של פתרון לשטוף (מערכת התבנית) ל52 μl שנותר כריק כדי לכמת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה ב 95 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, לאחר מכן על 37 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות. העבר את תערובת בצינורות 1.5 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 1.0 מ&quot;ל של חיץ TEX (10 מ&quot;מ טריס, 1 mM EDTA, 0.01% טריטון X-100, pH 8.0), לערבב וצנטריפוגות ב XG 15,500 עבור 3 דקות ב RT. הסר את supernatant ולהשאיר 20 μl בצינור אחד. חזור על תהליך זה הכביסה שתי פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 180 μl של חיץ TEX, resuspend חלקיקי טבליות ולהעביר לתוך 500 צינורות קיוביט μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד הקרינה לFAM וCy5 באמצעות מנגנון קיוביט ולחשב את היחס של תחומים חיוביים באמצעות המחשבון ניתן למצוא באתר יון הקהילה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעשיר את שארית חלקיקי הכדור לתחומים חיוביים (המכילים DNA המוגבר) באמצעות מערכת אוטומטית להעשרה (לדוגמא, מערכת העשרת Touch יון אחת). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ריאגנטים Pipet בבארות המתאימות של רצועת 8 היטב סיפקה: ובכן 1: חלקיקי תחום משלב 3.2; ובכן 2: מראש שטף חרוזים MyOne streptavidin C1 (13 μl); ובכן 3, 4 ו -5: פתרון לשטוף (מסופק בערכת התבנית); ובכן 6: ריק; ובכן 7: להמס-off פתרון (125 מ&quot;מ NaOH, 0.1% Tween 20); ובכן 8: ריק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התקן טיפ על זרוע pipetting וצינור 0.2 מ&quot;ל לאיסוף דגימה. התחל המכשיר. בסופו של ההעשרה, להוסיף 10 μl לנטרל פתרון (בתנאי). יכולים להישמר חרוזים המועשר 4 ° C. עד 15 ימים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאתחל את המכשיר לקביעת רצף: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתחבר למכשיר לקביעת רצף ולהכין תכנית ריצת רצף, המפרטים את הפרטים של ריצת הרצף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Install פתרון לשטוף # 2 (מסופק בערכת רצף יון PGM), פתרון לשטוף # 1 (350 μl 100 מ&quot;מ NaOH) והפתרון האוטומטי pH החיץ (מסופק). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל את הליך האתחול וכאשר תתבקש להוסיף dATP, dGTP dCTP ונוקלאוטידים dTTP (בתנאי) ב50 מ&quot;ל צינורות המיוחסים להם. הברג את הצינורות על מכונת הרצף ולהמשיך את הליך האתחול. כאשר האתחול הושלם, להתחיל הליך הריצה באופן מיידי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן דגימות עבור סידור ולטעון את השבב: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את הכדורים מועשרים מצעד 3.4 בחלק התחתון של הצינור על ידי צנטריפוגה ב15,500 XG ל1.5 דקות. הסר את supernatant עוזב בדיוק 3 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 3 μl של פריימר רצף (מסופק בערכת הרצף), ומערבב היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה כדי resuspend החלקיקים. דגירה ב 95 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, לאחר מכן על 37 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 μl של פולימראז (בתנאי), מערבב היטב וincubאכלתי בRT במשך 5 דקות. המשך לטעון את תערובת אנזים-כדור על שבב הרצף בתוך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך דגירה, לטעון את שבב הרצף ברצף ולבצע בדיקת איכות שבב. הסר את הנוזל מהשבב על ידי צנטריפוגה ולטעון את המדגם בשבב על ידי pipeting באיטיות במורד תערובת אנזים-הכדור (7 μl) והימנעות כניסתה של בועות בשבב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה השבב שלוש פעמים דקות 1 בmicrocentrifuge. שנה את הכיוון של השבב בכל צנטריפוגה ומערבבים על ידי pipetting למעלה ולמטה בין כל ריצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את השבב במכשיר ולהתחיל לרוץ. </li></ol></li></ol> ניתוח .4 יסוד רצף נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתחבר לשרת נתונים הרצף ולהוריד את קובץ fastq. צור קובץ מופרד באמצעות טאבים &quot;oligos&quot; המכיל את מידע פריימר וברקוד (ראה דוגמא בטבלה 1). הורד את קבצי התייחסות Greengenes מהמוותאתר חור <a href="http://www.mothur.org/wiki/Taxonomy_outline">(http://www.mothur.org/wiki/Taxonomy_outline).</a> </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל Mothur ולבצע ניתוחים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להמיר את קובץ fastq לfasta וקובץ באיכות באמצעות הפקודה הבאה: fastq.info (fastq = test.fastq) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את החברות בקבוצה של כל רצף ולקצץ את הרצפים באמצעות הפקודה הבאה: trim.seqs (fasta = test.fasta, oligos = barcode.txt, qfile = test.qual, qwindowaverage = 20, qwindowsize = 50, MINLENGTH = 150, keepforward = T) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתן לשנות האפשרויות השונות בהתאם לחומרה הרצויה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסווג את הרצפים בטקסונומיה greengenes באמצעות הפקודה הבאה: classify.seqs (fasta = test.trim.fasta, שיטה = wang, קבוצה = test.groups, תבנית = gg_99_otus.fasta, טקסונומיה = gg_99_otus.tax, הפסקת = 50) </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Sipos, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Addressing+PCR+biases+in+environmental+microbiology+studies.">Addressing PCR biases in environmental microbiology studies.</a> Methods Mol. Biol. 599, 37-58 (2010).</li><li>Schloss, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+the+effects+of+PCR+amplification+and+sequencing+artifacts+on+16S+rRNA-based+studies.">Reducing the effects of PCR amplification and sequencing artifacts on 16S rRNA-based studies.</a> PLoS ONE. 6, e27310 (2011).</li><li>Tringe, S. G., Hugenholtz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+renaissance+for+the+pioneering+16S+rRNA+gene.">A renaissance for the pioneering 16S rRNA gene.</a> Curr. Opin. Microbiol. 11, 442-446 (2008).</li><li>Margulies, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequencing+in+microfabricated+high-density+picolitre+reactors.">Genome sequencing in microfabricated high-density picolitre reactors.</a> Nature. 437, 376-380 (2005).</li><li>Kuczynski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+community+resemblance+methods+differ+in+their+ability+to+detect+biologically+relevant+patterns.">Microbial community resemblance methods differ in their ability to detect biologically relevant patterns.</a> Nat. Methods. 7, 813-819 (2010).</li><li>Bondici, V. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+communities+in+low-permeability,+high+pH+uranium+mine+tailings:+characterization+and+potential+effects.">Microbial communities in low-permeability, high pH uranium mine tailings: characterization and potential effects.</a> J. Appl. Microbiol. 113, 1671-1686 (2013).</li><li>Auffret, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+water+quality+on+the+bacterial+populations+and+off-flavours+in+recirculating+aquaculture+systems.">Impact of water quality on the bacterial populations and off-flavours in recirculating aquaculture systems.</a> FEMS Microbiology Ecology. 84, 235-247 (2013).</li><li>Bell, T. H., Yergeau, E., Juck, D., Whyte, L. G., Greer, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alteration+of+microbial+community+structure+affects+diesel+biodegradation+in+an+Arctic+soil.">Alteration of microbial community structure affects diesel biodegradation in an Arctic soil.</a> FEMS Microbiol. Ecol. 85, 51-61 (2013).</li><li>Bell, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictable+bacterial+composition+and+hydrocarbon+degradation+in+Arctic+soils+following+diesel+and+nutrient+disturbance.">Predictable bacterial composition and hydrocarbon degradation in Arctic soils following diesel and nutrient disturbance.</a> ISME J. 7, 1200-1210 (2013).</li><li>Yergeau, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+sequencing+of+microbial+communities+in+the+Athabasca+River+and+its+tributaries+in+relation+to+oil+sands+mining+activities.">Next-generation sequencing of microbial communities in the Athabasca River and its tributaries in relation to oil sands mining activities.</a> Appl. Environ. Microbiol. 78, 7626-7637 (2012).</li><li>Yergeau, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aerobic+biofilms+grown+from+Athabasca+watershed+sediments+are+inhibited+by+increasing+bituminous+compounds+concentrations.">Aerobic biofilms grown from Athabasca watershed sediments are inhibited by increasing bituminous compounds concentrations.</a> Appl. Environ. Microbiol. 79, 7398-7412 (2013).</li><li>Yergeau, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+expression+profiles+in+the+rhizosphere+of+willows+depend+on+soil+contamination.">Microbial expression profiles in the rhizosphere of willows depend on soil contamination.</a> ISME J. 8, 344-358 (2013).</li><li>Deagle, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+sequence+proportions+in+a+DNA-based+diet+study+using+Ion+Torrent+amplicon+sequencing:+which+counts+count.">Quantifying sequence proportions in a DNA-based diet study using Ion Torrent amplicon sequencing: which counts count.</a> Mol. Ecol. Resour. 13, 620-633 (2013).</li><li>Milani, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+fecal+microbiota:+an+optimized+Ion+Torrent+16S+rRNA+gene-based+analysis+protocol.">Assessing the fecal microbiota: an optimized Ion Torrent 16S rRNA gene-based analysis protocol.</a> PLoS ONE. 8, e68739 (2013).</li><li>J&#252;nemann, S., Prior, P., Szczepanowski, R., Harks, I., Ehmke, B., Goesmann, A., Stoye, J., Dag Harmsen, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+community+shift+in+treated+periodontitis+patients+revealed+by+Ion+Torrent+16S+rRNA+gene+amplicon+sequencing.">Bacterial community shift in treated periodontitis patients revealed by Ion Torrent 16S rRNA gene amplicon sequencing.</a> PLoS ONE. 7, e41606 (2012).</li><li>Petrof, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stool+substitute+transplant+therapy+for+the+eradication+of+Clostridium+difficile+infection:+'RePOOPulating'+the+gut.">Stool substitute transplant therapy for the eradication of Clostridium difficile infection: 'RePOOPulating' the gut.</a> Microbiome. 1, 3 (2013).</li><li>Whiteley, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+16S+rRNA+Ion+Tag+and+community+metagenome+sequencing+using+the+Ion+Torrent+(PGM)+Platform.">Microbial 16S rRNA Ion Tag and community metagenome sequencing using the Ion Torrent (PGM) Platform.</a> J. Microbiol. Meth. 91, 80-88 (2012).</li><li>Caporaso, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-high-throughput+microbial+community+analysis+on+the+Illumina+HiSeq+and+MiSeq+platforms.">Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms.</a> ISME J. 6, 1621-1624 (2012).</li><li>Kozich, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+dual-index+sequencing+strategy+and+curation+pipeline+for+analyzing+amplicon+sequence+data+on+the+MiSeq+Illumina+sequencing+platform.">Development of a dual-index sequencing strategy and curation pipeline for analyzing amplicon sequence data on the MiSeq Illumina sequencing platform.</a> Appl. Environ. Microbiol. 79, 5112-5120 (2013).</li><li>Hamady, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+UniFrac:+facilitating+high-throughput+phylogenetic+analyses+of+microbial+communities+including+analysis+of+pyrosequencing+and+PhyloChip+data.">Fast UniFrac: facilitating high-throughput phylogenetic analyses of microbial communities including analysis of pyrosequencing and PhyloChip data.</a> ISME J. 4, 17-27 (2010).</li><li>Quince, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removing+noise+from+pyrosequenced+amplicons.">Removing noise from pyrosequenced amplicons.</a> BMC Bioinformatics. 12, 38 (2011).</li><li>Huse, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ironing+out+the+wrinkles+in+the+rare+biosphere+through+improved+OTU+clustering.">Ironing out the wrinkles in the rare biosphere through improved OTU clustering.</a> Environ. Microbiol. 12, 1889-1898 (2010).</li><li>Edwards, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+dynamics+of+initial+bacterial+colonization+of+nonconserved+forage+in+the+bovine+rumen.">Characterization of the dynamics of initial bacterial colonization of nonconserved forage in the bovine rumen.</a> FEMS Microbiol. Ecol. 62, 323-335 (2007).</li><li>Rastogi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+PCR-based+toolbox+for+the+culture-independent+quantification+of+total+bacterial+abundances+in+plant+environments.">A PCR-based toolbox for the culture-independent quantification of total bacterial abundances in plant environments.</a> J. Microbiol. Methods. 83, 127-132 (2010).</li><li>Baker, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+and+re-analysis+of+domain-specific+16S+primers.">Review and re-analysis of domain-specific 16S primers.</a> J. Microbiol. Methods. 55, 541-555 (2003).</li><li>Schloss, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+alignment+quality,+distance+calculation+method,+sequence+filtering,+and+region+on+the+analysis+of+16S+rRNA+gene-based+studies.">The effects of alignment quality, distance calculation method, sequence filtering, and region on the analysis of 16S rRNA gene-based studies.</a> PLoS Comput. Biol. 6, e1000844 (2010).</li><li>Links, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chaperonin-60+universal+target+Is+a+barcode+for+bacteria+that+enables+de+novo+assembly+of+metagenomic+sequence+data.">The chaperonin-60 universal target Is a barcode for bacteria that enables de novo assembly of metagenomic sequence data.</a> PLoS ONE. 7, e49755 (2012).</li><li>Vos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+rpoB+and+16S+rRNA+as+markers+in+pyrosequencing+studies+of+bacterial+diversity.">Comparison of rpoB and 16S rRNA as markers in pyrosequencing studies of bacterial diversity.</a> PLoS ONE. 7, e30600 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

<html> השיטה המוצגת כאן היא פשוטה ולא יקרה, וצריכה לאפשר מעבדות רבות כדי לגשת לכוחו של רצף metagenomic. למרות שזה משתנה בהתאם לפלטפורמת הרצף בשימוש, פעם אחת הספריות בנויות על ידיים מעט מאוד זמן נדרש, עם רוב של התהליך automatized. עבור פלטפורמת הרצף משמשת כאן (יון Torrent PGM), ההליך המלא ניתן לבצע בתוך שני ימי העבודה. ברגע הכתיבה (ספטמבר 2013), עלויות מגיב הקשורים לדוגמא המפורטת לעיל היו כדלקמן: הגברה של 36 דגימות PCR: $ 25, quantitation טיהור ג&#39;ל וPicoGreen DNA של 36 דגימות: $ 125, תחליב PCR למדגם amplicon נקווה אחד : $ 150 וריאגנטים רצף: $ 250, עבור הסכום כולל של 550 $ או 15 $ למדגם או 0.0015 $ לקריאה מסונן באיכות. מחיר זה אינו כולל מכשיר חוזה שירות, פחת מכשיר, שכר טכנאי ושימוש בשטח מעבדה. אוהל &quot;&gt; אחד הצעדים החשובים ביותר הוא לאגם את כל המוצרים ביחס equimolar, כדי לאחזר מספר דומה של קורא לכל אחת מהדגימות. כימות PicoGreen שימש כאן, אלא בשיטות אחרות עשויות להיות מתאימות, אם כי פחות מדויק (למשל, כימות UV, כימות מבוסס ג&#39;ל). גם על ידי עושה כימות ואיגום מדויקים ביותר, יש כמה השתנות במספר קורא לדגימה, ובטווח האופייני המפורטים בטבלה 2, זה נע בין 4,380 ל 32,750 קורא, עם ממוצע של 10,338 קורא. אם עיבוד מספר גדול של דגימות (יותר מ 40-50), ניתן להחליף טיהור ג&#39;ל עמודה אחת על ידי טיהור ג&#39;ל בחרוזי צלחת או טיהור באמצעות עם הפסקת גודל מחמיר (למשל, חרוזים AMPure) . נכון להיום, טכנולוגיית הריצוף של הדור הבא ביותר בשימוש לגן 16S rRNA היא 454. טכנולוגיית ריצוף יון Torrent שימוש בפרוטוקול זה באופן רעיוני דומה מאודל454 ושני הטכנולוגיות נוטות לאותו הסוג של טעויות רצף. באופן לא מפתיע, זה היה הראה כי רצף יון Torrent הביא תוצאות רצף דומות מאוד ל454 רצף 10. לאחרונה, חוקרים רבים בחנו את השימוש בטכנולוגית Illumina עבור סידור amplicon גן 16S rRNA 18,19. בכל מקרה, זה יהיה קל להתאים את הפרוטוקול הנוכחי למרצפים המעבדתיים אחרים כמו מיסק Illumina או 454 GS Junior על ידי שינוי רצפי פריימר ההיתוך כדי להתאים את המתאמים ורקודים דרושים לטכנולוגיות רצף אלה, כמו בשיטה שתואר לאחרונה לIllumina מיסק 19. לחלופין, חוקרים יכולים בצע את השלבים 1 ו -2 של הפרוטוקול המפורט כאן ולשלוח amplicons נקוותה למרכז רצף שבו התחליב PCR וסדר היה להתבצע. גן 16S rRNA כניסות היו גזוז ומסווג באמצעות Mothur, אבל יכולים להתבצע על הרבה ניתוחים אחריםamplicons גן 16S rRNA. לדוגמא, גיוון בטא יכול להיות מוערך על ידי חישוב מרחקי Unifrac בין כל זוג מדגם באמצעות ההליך המתואר <a href="http://unifrac.colorado.edu/">בhttp://unifrac.colorado.edu/</a> 20. מדדי גיוון אלפא ומספר יחידות מיון שונים מבצעיות של כל דגימה יכולים להיות מחושבים באמצעות כלים בתוך QIIME כמו AmpliconNoise 21 או באמצעות ההליך המתואר על ידי Huse et al. 22 וזמינים בתוך Mothur. פריימרים משמשים כאן מוגברים האזורים משתנים 3 ו -4 מגן 16S rRNA, אבל יכולים להיות ממוקדים אזורים רבים אחרים. במחקר נוכחי, גני 16S rRNA היו מוגברים מחומר צמחי והבחירה של פריימר נעשתה כדי למנוע הגברה של הכלורופלסט 16S rRNA גן 23,24. יש מגוון רחב של צבעי יסוד זמינים אחרים המשתנים בטווח של אורך המוצר, כוח הטקסונומי ו25,26 תועלת. עם זאת, בכל המקרים 200-400 נ&quot;ב קורא של גן 16S rRNA לא יכול להיות מסווג באופן אמין, ברמת המין, וניתוחים מוגבלים לסוג ורמות מיון השונים גבוהות יותר. גנים אחרים יכולים להיות מתאימים יותר אם יש צורך במידע ברמת מינים, כמו גני cpn60 וrpoB 27,28. טיפות דרסטית בעתיד בעלות של רצף ועלייה בכוחם של כלים אנליטיים עשויות לעשות את זה אפשרי להחליף לסידור של גני 16S rRNA על ידי metagenomics רובה, אבל עד אז סידור של גני 16S rRNA נשאר סטנדרטי למיקרוביולוגיה הסביבתית זהב.

רצף metagenomic הוא טכנולוגיה מאוד חזקה כפי שהוא מתמקד בשלמותו של המידע הגנטי הכלול במדגם סביבתי. יש טעמים שונים של רצף metagenomic, כוללים רצף רובה ציד, ספריות גדולות להוסיף ורצף amplicon. רצף Amplicon מציע את היתרון של להיות זול יחסית, מהיר ומסוגלים לייצר קורא מאזור הגנומי יחיד שיכול להיות מתואם בדרך כלל. בנוסף, זרימת העבודה ניתוח נתונים עבור סידור amplicon בעיקר טופל. עם זאת, מאחר שהוא מבוסס על PCR, יש לו את כל ההטיות הקשורים לייחוד שלם, כיסוי חלקי ופריימר מטה את 1,2, מה שהופך את הגישה זו חצי כמותית, במקרה הטוב. מספר אזורים הגנומי יכולים להיות ממוקדים עבור סידור amplicon כוללים גנים פונקציונליים, אבל האפשרויות הפופולריות ביותר הן להשתמש בגני סמן כגון גן 16S rRNA כדי ליצור פרופיל קהילה. באופן מסורתי, seque amplicon גן 16S rRNAncing בוצע תוך שימוש בטכניקות עבודה אינטנסיביות שכללו שיבוט בE. coli, קטיף מושבה והפקת פלסמיד ואחריו סנגר רצף על פלסמידים המבודדים, וכתוצאה מכך, רוב המחקרים ניתחו לדגימה פחות מ -100 שיבוטים. רצף של הדור הבא הביא שתי התקדמות גדולה: במקביל מסיבית של תגובות ברצף, והכי חשוב, הפרדה משובט של תבניות ללא הצורך להכניס שברי גנים במארח. זה פישט מאוד את הרצף של amplicons גן 16S rRNA, שנמצא עכשיו בחזרה כתכונה שגרתית של לימודי מיקרוביולוגיה הסביבתית רבים, וכתוצאה מכך &quot;רנסנס&quot; עבור סידור amplicon גן 16S rRNA 3. מאז כניסתו של רצף רוש 454 ב2005 4, מספר טכנולוגיות רצף של הדור הבא אחרות הופיעו בשוק (למשל, Illumina, מוצק, PacBio). לאחרונה, את ההקדמה של רצף ספסל העליוןrs הובא למעבדות קטנות קיבולת הרצף פעם אחת בלעדית למרכזי רצף גדולים. חמש מכונות benchtop זמינות כעת: GS Junior 454, אישי הגנום מכונת יון Torrent (PGM) ופרוטון, ומיסק Illumina וNextSeq 500. בעוד שכל מרצפים אלה מציעים פחות קוראים לריצה ופחות בסיסים לדולר ממה שרוב המשרה מלאה מרצפי קנה מידה, הם יותר גמישים, מהירים, ועלויות הרכישה והפעלתם נמוכות הופכים אותם במחיר סביר עבור מעבדות אקדמיות קטנות. מרצפים המעבדתיים במיוחד מתאימים גם לamplicon, הגנום קטן ורצף metagenome נמוכות מורכבות בלימודי מיקרוביולוגיה סביבתיות, כי זה סוג של לימודים בדרך כלל אינו דורש עומק קיצוני של רצף. לדוגמא, אותו יש הסכמה כללית כי לסידור של גני 16S rRNA חוקר את מספר קורא לדגימה הוא לא בעל חשיבות עליונה, כ~ 1,000 קורא יכול ליצור את אותם דפוסים כמרובים מיליון קוראים מערכי נתונים 5. אחרי שאמר את זה, הבא generatio המעבדתיים<html> n sequencers עדיין מייצר כמויות גדולות של נתונים ברצף, עם תשואות מקסימליים של ~ 35 MBP (454 GS Junior), ~ 2 Gbp (יון Torrent PGM), ~ 10-15 Gbp (יון Torrent פרוטון), ~ 10 Gbp (Illumina מיסק) ו~ 100 Gbp (Illumina הבא Seq 500), וזה יותר ממספיק עבור רוב מחקרי מיקרוביולוגיה הסביבתיים. רצף של הדור הבא של amplicons 16S rRNA באמצעות מרצפים המעבדתיים הוחל לאחרונה למגוון רחב של סביבות. לדוגמא, יון Torrent PGM היה בשימוש כבר קהילת ניתוחים של שבבים מכרה אורניום שהיו גבוה במיוחד pH ונמוכים חדירות 6, הסירקולציה מחודשת מערכות חקלאות ימית 7, של קרקעות הארקטי מזוהם פחמימנים 8,9, של משקעים מושפעים כריית חולות נפט ו biofilms מנהר Athabasca 10,11, של rhizosphere של עצי ערבה ניטעו בקרקעות מזוהמות 12, של גופות אדם ובעלי חי 13-16 ושל מעכלים אנאירוביים 17. jove_content &quot;&gt; בפירוט אנו תרומה זו הגישה שלנו לרצף amplicons גן 16S rRNA בתוך הבית באמצעות המעבדתיים ברצף של הדור הבא (יון Torrent PGM). לאחר מיצוי DNA, גני 16S rRNA הם מוגברים באמצעות פריימרים חיידקים ברמת תחום המכילים מתאמי רצף ורצפים ייחודיים, מדגם ספציפי (ברקודים). amplicons הם מטוהרים, לכמת ונקוו ביחס equimolar. אז הדגימות נקוו הם מוגברות clonally בתחליב PCR ורצף. רצפי כתוצאה מכך הם ניתחו באמצעות כלים ביואינפורמטיקה זמינים לציבור ( למשל, Mothur).

<table><tbody><tr><td>Ion 314 Chip Kit v2</td><td>Life Technologies</td><td>4482261</td><td></td></tr><tr><td>Ion PGM Sequencing 200 Kit v2</td><td>Life Technologies</td><td>4482006</td><td></td></tr><tr><td>Ion PGM Template OT2 200 Kit</td><td>Life Technologies</td><td>4480974</td><td></td></tr><tr><td>HotStarTaq Plus Master Mix Kit</td><td>Qiagen</td><td>203646</td><td></td></tr><tr><td>Primers and probes</td><td>IDT</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Qiaquick Gel Extraction Kit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>BSA 20 mg/ml</td><td>Roche</td><td>10,711,454,001</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td><td>Life Technologies</td><td>65001</td><td></td></tr></tbody></table>

next-generation sequencing of 16s ribosomal rna gene amplicons

אחת השאלות החשובות באקולוגיה של חיידקים הוא &quot;מי נמצא שם?&quot; שאלה זו ניתן לענות באמצעות כלים שונים, אבל אחד מסטנדרטי זהב לטווח הארוך הוא רצף amplicons 16S RNA ריבוזומלי גן (rRNA) שנוצרה על ידי ברמת תחום PCR תגובות הגברה מהדנ&quot;א הגנומי. באופן מסורתי, זה בוצע על ידי שיבוט וסנגרתי (אלקטרופורזה נימים) רצף של amplicons PCR. כניסתו של רצף של הדור הבא פישטה מאוד והגדילה את עומק הרצף לסידור של גני 16S rRNA. כניסתה של מרצפים המעבדתיים עכשיו מאפשרת מעבדות קטנות לבצע רצף rRNA 16S שלהם בבית בעניין של ימים. כאן, גישה לרצף amplicon גן 16S rRNA באמצעות המעבדתיים ברצף של הדור הבא מפורטת. DNA הסביבתי מוגבר לראשונה על ידי PCR באמצעות פריימרים המכילים מתאמי רצף וברקודים. אז הם מצמידים את חלקיקים כדוריים באמצעות תחליב PCR. החלקיקים הם loaded על שבב חד פעמי והשבב מותקן במכונת הרצף לאחר שהרצף מתבצע. רצפי תאוחזרנה בפורמט fastq, מסונן וברקודים משמשים להקמת חברות במדגם של הקורא. מסונן וזרק לפח כניסות לאחר מכן ניתח נוסף תוך שימוש בכלים זמינים בפומבי. ניתוח דוגמא שבה קורא סווגו עם אלגוריתם מציאת-טקסונומיה בתוך חבילת תוכנת Mothur הוא נתון. השיטה המתוארת כאן היא פשוטה, זולה ופשוט, וצריכה לעזור למעבדות קטנות יותר כדי לנצל מהמהפכה הגנומי המתמשכת.

לאחר הטיהור בג&#39;ל, עם 25 מחזורים של PCR הגברה, מוצרי ההגברה הם בדרך כלל בריכוז של .2-10.0 ng ב50 μl מים. זה עשוי להשתנות במידה רבה בהתאם לריכוז מתחיל DNA, הסוג של מדגם וערכת הטיהור משמשת. מומלץ לשמור את מספר מחזורי PCR לנמוך ביותר האפשרי כדי למנוע היווצרות הכימרה ולהקטין הטיות הגברה, תוך התחשבות כי כל הדגימות צריכה להיות מוגברות תוך שימוש באותו מספר המחזורים. כדי למזער את מספר polyclonal קוראת ותחומים ריקים ומקסם את מספר קורא, יחס קיוביט צריך להיות בין 0.1 ו0.3 וקרינת FAM צריכה להיות מעל 200. שימוש שבב 314 על יון Torrent PGM, התפוקה הממוצעת היא בסביבות 0.3-0.5 באיכות טובה M קוראת אחרי הסינון של התוצאות בMothur. טבלה 2 מראה התפלגות טיפוסית של מספר קורא אחרי כל צעד של ההליך לריצה המכילה 36 Environ המרובבדגימות נפשיות מוגברות עם פריימרים מיקוד אזור V3-4 של 16S ונותחו באמצעות Mothur. בMothur, הליך trim.seqs ליצור קובץ &quot;* .trim.fasta&quot; המכיל את הרצפים שעברו את מסנני איכות ו&quot; * .scrap.fasta &quot;המכיל את הרצפים שלא עברה את מסנני האיכות יחד עם הסיבה לדחייה בכותרת הרצף. כשהוא מוזן ברקודים בקובץ &quot;oligos&quot;, בפקודה זו תהיה גם ליצור קובץ &quot;* .groups&quot; המכיל את החברות בקבוצתו של כל רצף המבוסס על הרצף ברקוד. Classify.seqs ההליך יוצר &quot;.tax.summary&quot; שניתן לפתוח בExcel. קובץ זה מכיל הסיכום של ההשתייכות הטקסונומית (בשורות) לכל אחת מהדגימות (בעמודות). קובץ זה יכול לשמש לניתוחים סטטיסטיים במורד הזרם וכדי להמחיש הרכב קהילה ברמות טקסונומיות שונות. קובץ &quot;.taxonomy&quot; מכיל הטקסונומית מפורטתהשתייכות לכל רצף. הרכב הקהילה הממוצע ברמת המיון הצמחי / כיתה בכל 36 הדגימות מוצג באיור 1. <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51709/51709fig1highres.jpg" width="500" /> איור 1 הרכב הקהילה ממוצע ברמת המיון הצמחי / המעמד מעבר לכל דוגמאות. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="248" style=";text-align:right;direction:rtl"><colgroup><col /><col /><col /></colgroup><tbody><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:64px;"> קדימה </td><td style="width:139px;"> TACGGRAGGCAGCAG </td><td style="width:47px;"></td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> ברקוד </td><td> CTAAGGTAAC </td><td> Sample01 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> ברקוד </td><td> TAAGGAGAAC </td><td> Sample02 </td></tr><tr height = &quot;20&quot;&gt; <td height="20" style="height:20px;"> ברקוד </td><td> AAGAGGATTC </td><td> Sample03 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> ברקוד </td><td> TACCAAGATC </td><td> Sample04 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> ברקוד </td><td> CAGAAGGAAC </td><td> Sample05 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> ברקוד </td><td> CTGCAAGTTC </td><td> Sample06 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> ברקוד </td><td> TTCGTGATTC </td><td> Sample07 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> ברקוד </td><td> TTCCGATAAC </td><td> Sample08 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> ברקוד </td><td> TGAGCGGAAC </td><td> Sample09 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> ברקוד </td><td> CTGACCGAAC </td><td> Sample10 </td></tr></tbody></table> דוגמא 1 &quot;oligos&quot; קובץ שולחן לשימוש בMothur. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="660" style=";text-align:right;direction:rtl"><colgroup><col /><col /><col /><col /></colgroup><tbody><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:363px;"></td><td style="width:67px;"> # של קורא </td><td style="width:123px;"> % משלב קודם </td><td style="width:107px;"> ממוצע. לדגימה </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:363px;"> מספר הבארות </td><td align="center"> 1262519 </td><td> - </td><td align="center"> 35,070 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:363px;"> ולס עם חרוזים </td><td align="center"> 1114108 </td><td align="center"> 88.20% </td><td align="center"> 30947 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:363px;"> חרוזים עם תבניות </td><td align="center"> 1112746 </td><td align="center"> 99.90% </td><td align="center"> 30910 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:363px;"> חרוזים חד שבטיים </td><td align="center"> 826805 </td><td align="center"> 74.30% </td><td align="center"> 22967 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:363px;"> איכות טובה קוראת (יציאה מהרצף) </td><td align="center"> 782204 </td><td align="center"> 94.60% </td><td align="center"> 21728 </td></tr><tr height="40"><td height="40" style="height:40px;width:363px;"> Pass Mothur מסננים (דקות. ממוצע. ציון איכות של 20 מעל חלון -50 נקודתי בסיס, דקות. אורך של 150bp) </td><td align="center"> 372168 </td><td align="center"> 47.60% </td><td align="center"> 10,338 </td></tr><tr height="40"><td height="40" style="height:40px;width:363px;"> מסווג ברמת המיון הצמחית בGreenGenes (50% סף ביטחון) </td><td align="center"> 342171 </td><td align="center"> 91.90% </td><td align="center"> 9505 </td></tr><tr height="40"><td height="40" style="height:40px;width:363px;"> מסווג ברמת המשפחה בGreenGenes (50% סף ביטחון) </td><td align="center"> 316512 </td><td align="center"> 92.50% </td><td align="center"> 8,792 </td></tr><tr height="40"><td height="40" style="height:40px;width:363px;"> מסווג ברמת הסוג בGreenGenes (50% סף ביטחון) </td><td align="center"> 289899 </td><td align="center"> 91.60% </td><td align="center"> 8053 </td></tr></tbody></table> מספר 2 בטבלה של כניסות המופקים מריצה אופיינית ל36 דגימות סביבתיות multiplexed על אחד שבב יון Torrent 314.

Watch this Scientific Journal Video about Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons at JoVE.com

Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons

Characterizing microbial community has been a longstanding goal in environmental microbiology. Next-generation sequencing methods now allow for the characterization of microbial communities at an unprecedented depth with minimal cost and labor. We detail here our approach to sequence bacterial 16S ribosomal RNA genes using a benchtop sequencer.

רצף של הדור הבא של 16S ריבוזומלי amplicons ג&#39;ין RNA

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the ...

next-generation-sequencing-of-16s-ribosomal-rna-gene-amplicons

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

83.2K Views.  National Research Council Canada. Characterizing microbial community has been a longstanding goal in environmental microbiology. Next-generation sequencing methods now allow for the characterization of microbial communities at an unprecedented depth with minimal cost and labor. We detail here our approach to sequence bacterial 16S ribosomal RNA genes using a benchtop sequencer. 

Video: Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons

Metagenomic Analysis of Silage

Metagenomics is defined as the direct analysis of deoxyribonucleic acid (DNA) purified from environmental samples and enables taxonomic identification of the microbial communities present within them. Two main metagenomic approaches exist; sequencing the 16S rRNA gene coding region, which exhibits sufficient variation between taxa for identification, and shotgun sequencing, in which genomes of the organisms that are present in the sample are analyzed and ascribed to "operational taxonomic units"; species, genera or families depending on the extent of sequencing coverage. 
In this study, shotgun sequencing was used to analyze the microbial community present in cattle silage and, coupled with a range of bioinformatics tools to quality check and filter the DNA sequence reads, perform taxonomic classification of the microbial populations present within the sampled silage, and achieve functional annotation of the sequences. These methods were employed to identify potentially harmful bacteria that existed within the silage, an indication of silage spoilage. If spoiled silage is not remediated, then upon ingestion it could be potentially fatal to the livestock.

Metagenomics was used to investigate the microbiome of silage cattle feed. Analysis was performed by shotgun sequencing. This approach was used to characterize the composition of the microbial community within the cattle feed.

Metagenomic ניתוח של תחמיץ

Metagenomics is defined as the direct analysis of deoxyribonucleic acid (DNA) purified from environmental samples and enables taxonomic identification of ...

Genetics

Simultaneous DNA-RNA Extraction from Coastal Sediments and Quantification of 16S rRNA Genes and Transcripts by Real-time PCR

Real Time Polymerase Chain Reaction also known as quantitative PCR (q-PCR) is a widely used tool in microbial ecology to quantify gene abundances of taxonomic and functional groups in environmental samples. Used in combination with a reverse transcriptase reaction (RT-q-PCR), it can also be employed to quantify gene transcripts. q-PCR makes use of highly sensitive fluorescent detection chemistries that allow quantification of PCR amplicons during the exponential phase of the reaction. Therefore, the biases associated with &#39;end-point&#39; PCR detected in the plateau phase of the PCR reaction are avoided. A protocol to quantify bacterial 16S rRNA genes and transcripts from coastal sediments via real-time PCR is provided. First, a method for the co-extraction of DNA and RNA from coastal sediments, including the additional steps required for the preparation of DNA-free RNA, is outlined. Second, a step-by-step guide for the quantification of 16S rRNA genes and transcripts from the extracted nucleic acids via q-PCR and RT-q-PCR is outlined. This includes details for the construction of DNA and RNA standard curves. Key considerations for the use of RT-q-PCR assays in microbial ecology are included.

A protocol to quantify bacterial 16S rRNA genes and transcripts from coastal sediments via real-time PCR is provided. The methodology includes the co-extraction of DNA and RNA; preparation of DNA-free RNA; and 16S rRNA gene and transcript quantification via RT-q-PCR, including standard curve construction.

הפקת DNA-RNA סימולטני החוף משקעים וכימות של 16S rRNA גנים תעתיקי ידי בזמן אמת PCR

Real Time Polymerase Chain Reaction also known as quantitative PCR (q-PCR) is a widely used tool in microbial ecology to quantify gene abundances of ...

Environment

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to abiotic stresses and diseases. As the plant microbiome can be highly complex, low-cost, high-throughput methods such as amplicon-based sequencing of the 16S rRNA gene are often preferred for characterizing its microbial composition and diversity. However, the selection of appropriate methodology when conducting such experiments is critical for reducing biases that can make analysis and comparisons between samples and studies difficult. This protocol describes in detail a standardized methodology for the collection and extraction of DNA from soil, rhizosphere, and root samples. Additionally, we highlight a well-established 16S rRNA amplicon sequencing pipeline that allows for the exploration of the composition of bacterial communities in these samples, and can easily be adapted for other marker genes. This pipeline has been validated for a variety of plant species, including sorghum, maize, wheat, strawberry, and agave, and can help overcome issues associated with the contamination from plant organelles.

Here, we describe a protocol to obtain amplicon sequence data of soil, rhizosphere, and root endosphere microbiomes. This information can be used to investigate the composition and diversity of plant-associated microbial communities, and is suitable for the use with a wide range of plant species.

לחקור את השורש Microbiome: שליפת נתונים הקהילה חיידקי מן האדמה, Rhizosphere, Endosphere שורש

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

Hybrid De Novo Genome Assembly for the Generation of Complete Genomes of Urinary Bacteria using Short- and Long-read Sequencing Technologies

Complete genome sequences provide valuable data for the understanding of genetic diversity and unique colonization factors of urinary microbes. These data may include mobile genetic elements, such as plasmids and extrachromosomal phage, that contribute to the dissemination of antimicrobial resistance and further complicate treatment of urinary tract infection (UTI). In addition to providing fine resolution of genome structure, complete, closed genomes allow for the detailed comparative genomics and evolutionary analyses. The generation of complete genomes de novo has long been a challenging task due to limitations of available sequencing technology. Paired-end Next Generation Sequencing (NGS) produces high quality short reads often resulting in accurate but fragmented genome assemblies. On the contrary, Nanopore sequencing provides long reads of lower quality normally leading to error-prone complete assemblies. Such errors may hamper genome-wide association studies or provide misleading variant analysis results. Therefore, hybrid approaches combining both short and long reads have emerged as reliable methods to achieve highly accurate closed bacterial genomes. Reported herein is a comprehensive method for the culture of diverse urinary bacteria, species identification by 16S rRNA gene sequencing, extraction of genomic DNA (gDNA), and generation of short and long reads by NGS and Nanopore platforms, respectively. Additionally, this method describes a bioinformatic pipeline of quality control, assembly, and gene prediction algorithms for the generation of annotated complete genome sequences. Combination of bioinformatic tools enables the selection of high quality read data for hybrid genome assembly and downstream analysis. The streamlined approach for the hybrid de novo genome assembly described in this protocol may be adapted for the use in any culturable bacteria.

Hybrid De Novo Genome Assembly for the Generation of Complete Genomes of Urinary Bacteria using Short- and Long-read Sequencing Technologies

This protocol details a comprehensive approach for the culturing, sequencing, and de novo hybrid genome assembly of urinary bacteria. It provides a reproducible procedure for the generation of complete, circular genome sequences useful in studying both chromosomal and extrachromosomal genetic elements contributing to urinary colonization, pathogenesis, and antimicrobial resistance dissemination.

הרכבה הגנום ההיברידית דה נובו לייצור גנומים שלמים של חיידקי השתן באמצעות טכנולוגיות רצף קצרות וארוכות

Complete genome sequences provide valuable data for the understanding of genetic diversity and unique colonization factors of urinary microbes. These data ...

RIBO-seq in Bacteria: a Sample Collection and Library Preparation Protocol for NGS Sequencing

The ribosome profiling technique (RIBO-seq) is currently the most effective tool for studying the process of protein synthesis in vivo. The advantage of this method, in comparison to other approaches, is its ability to monitor translation by precisely mapping the position and number of ribosomes on a mRNA transcript.
In this article, we describe the consecutive stages of sample collection and preparation for RIBO-seq method in bacteria, highlighting the details relevant to the planning and execution of the experiment.
Since the RIBO-seq relies on intact ribosomes and related mRNAs, the key step is rapid inhibition of translation and adequate disintegration of cells. Thus, we suggest filtration and flash-freezing in liquid nitrogen for cell harvesting with an optional pretreatment with chloramphenicol to arrest translation in bacteria. For the disintegration, we propose grinding frozen cells with mortar and pestle in the presence of aluminum oxide to mechanically disrupt the cell wall. In this protocol, sucrose cushion or a sucrose gradient ultracentrifugation for monosome purification is not required. Instead, mRNA separation using polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) followed by the ribosomal footprint excision (28-30 nt band) is applied and provides satisfactory results. This largely simplifies the method as well as reduces the time and equipment requirements for the procedure. For library preparation, we recommend using the commercially available small RNA kit for Illumina sequencing from New England Biolabs, following manufacturer&#39;s guidelines with some degree of optimization.
The resulting cDNA libraries present appropriate quantity and quality required for next generation sequencing (NGS). Sequencing of the libraries prepared according to the described protocol results in 2 to 10 mln uniquely mapped reads per sample providing sufficient data for comprehensive bioinformatic analysis. The protocol we present is quick and relatively easy and can be performed with standard laboratory equipment.

Here we describe the stages of sample collection and preparation for RIBO-seq in bacteria. Sequencing of the libraries prepared according to these guidelines results in sufficient data for comprehensive bioinformatic analysis. The protocol we present is simple, uses standard laboratory equipment and takes seven days from lysis to obtaining libraries.

RIBO-seq בחיידקים: אוסף לדוגמה ופרוטוקול הכנת ספריה לריצוף NGS

The ribosome profiling technique (RIBO-seq) is currently the most effective tool for studying the process of protein synthesis in vivo. The advantage of ...

Biochemistry

Identification of Rare Bacterial Pathogens by 16S rRNA Gene Sequencing and MALDI-TOF MS

There are a number of rare and, therefore, insufficiently described bacterial pathogens which are reported to cause severe infections especially in immunocompromised patients. In most cases only few data, mostly published as case reports, are available which investigate the role of such pathogens as an infectious agent. Therefore, in order to clarify the pathogenic character of such microorganisms, it is necessary to conduct epidemiologic studies which include large numbers of these bacteria. The methods used in such a surveillance study have to meet the following criteria: the identification of the strains has to be accurate according to the valid nomenclature, they should be easy to handle (robustness), economical in routine diagnostics and they have to generate comparable results among different laboratories. Generally, there are three strategies for identifying bacterial strains in a routine setting: 1) phenotypic identification characterizing the biochemical and metabolic properties of the bacteria, 2) molecular techniques such as 16S rRNA gene sequencing and 3) mass spectrometry as a novel proteome based approach. Since mass spectrometry and molecular approaches are the most promising tools for identifying a large variety of bacterial species, these two methods are described. Advances, limitations and potential problems when using these techniques are discussed.

Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) and molecular techniques (16S rRNA gene sequencing) permit the identification of rare bacterial pathogens in routine diagnostics. The goal of this protocol lies in the combination of both techniques which leads to more accurate and reliable data.

זיהוי של חיידקים פתוגנים נדירים לפי 16S rRNA ג&#39;ין סידור MALDI-TOF MS

There are a number of rare and, therefore, insufficiently described bacterial pathogens which are reported to cause severe infections especially in ...

Immunology and Infection

Efficient Nucleic Acid Extraction and 16S rRNA Gene Sequencing for Bacterial Community Characterization

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing technologies have allowed for the rapid and efficient characterization of bacterial communities using 16S rRNA gene sequencing from a variety of sources. Although readily available tools for 16S rRNA sequence analysis have standardized computational workflows, sample processing for DNA extraction remains a continued source of variability across studies. Here we describe an efficient, robust, and cost effective method for extracting nucleic acid from swabs. We also delineate downstream methods for 16S rRNA gene sequencing, including generation of sequencing libraries, data quality control, and sequence analysis. The workflow can accommodate multiple samples types, including stool and swabs collected from a variety of anatomical locations and host species. Additionally, recovered DNA and RNA can be separated and used for other applications, including whole genome sequencing or RNA-seq. The method described allows for a common processing approach for multiple sample types and accommodates downstream analysis of genomic, metagenomic and transcriptional information.

We describe an efficient, robust, and cost effective method for extracting nucleic acid from swabs for characterization of bacterial communities using 16S rRNA gene amplicon sequencing. The method allows for a common processing approach for multiple sample types and accommodates a number of downstream analytic processes.

הפקת חומצות גרעין יעיל 16S rRNA ג&#39;ין רצף עבור בקטריאלי קהילת אפיון

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing ...

Guided Protocol for Fecal Microbial Characterization by 16S rRNA-Amplicon Sequencing

The human intestinal microbiome plays a central role in protecting cells from injury, in processing energy and nutrients, and in promoting immunity. Deviations from what is considered a healthy microbiota composition (dysbiosis) may impair vital functions leading to pathologic conditions. Recent and ongoing research efforts have been directed toward the characterization of associations between microbial composition and human health and disease.
Advances in high-throughput sequencing technologies enable characterization of the gut microbial composition. These methods include 16S rRNA-amplicon sequencing and shotgun sequencing. 16S rRNA-amplicon sequencing is used to profile taxonomical composition, while shotgun sequencing provides additional information about gene predictions and functional annotation. An advantage in using a targeted sequencing method of the 16S rRNA gene variable region is its substantially lower cost compared to shotgun sequencing. Sequence differences in the 16S rRNA gene are used as a microbial fingerprint to identify and quantify different taxa within an individual sample.
Major international efforts have enlisted standards for 16S rRNA-amplicon sequencing. However, several studies report a common source of variation caused by batch effect. To minimize this effect, uniformed protocols for sample collection, processing, and sequencing must be implemented. This protocol proposes the integration of broadly used protocols starting from fecal sample collection to data analyses. This protocol includes a column-free, direct-PCR approach that enables simultaneous handling and DNA extraction of large numbers of fecal samples, along with PCR amplification of the V4 region. In addition, the protocol describes the analysis pipeline and provides a script using the latest version of QIIME (QIIME 2 version 2017.7.0 and DADA2). This step-by-step protocol is aimed to guide those interested in initiating the use of 16S rRNA-amplicon sequencing in a robust, reproductive, easy to use, detailed way.

This manuscript describes a detailed standardized protocol of high-throughput 16S rRNA-amplicon sequencing. The protocol introduces an integrated, uniformed, feasible, and inexpensive protocol starting from fecal sample collection through data analyses. This protocol enables analysis of large numbers of samples with rigorous standards and several controls.

פרוטוקול מודרך לקבלת צואה אפיון חיידקים על ידי מטוסי אף-16 rRNA-אמפליקון רצף

The human intestinal microbiome plays a central role in protecting cells from injury, in processing energy and nutrients, and in promoting immunity. ...

Tick Microbiome Characterization by Next-Generation 16S rRNA Amplicon Sequencing

In recent decades, vector-borne diseases have re-emerged and expanded at alarming rates, causing considerable morbidity and mortality worldwide. Effective and widely available vaccines are lacking for a majority of these diseases, necessitating the development of novel disease mitigation strategies. To this end, a promising avenue of disease control involves targeting the vector microbiome, the community of microbes inhabiting the vector. The vector microbiome plays a pivotal role in pathogen dynamics, and manipulations of the microbiome have led to reduced vector abundance or pathogen transmission for a handful of vector-borne diseases. However, translating these findings into disease control applications requires a thorough understanding of vector microbial ecology, historically limited by insufficient technology in this field. The advent of next-generation sequencing approaches has enabled rapid, highly parallel sequencing of diverse microbial communities. Targeting the highly-conserved 16S rRNA gene has facilitated characterizations of microbes present within vectors under varying ecological and experimental conditions. This technique involves amplification of the 16S rRNA gene, sample barcoding via PCR, loading samples onto a flow cell for sequencing, and bioinformatics approaches to match sequence data with phylogenetic information. Species or genus-level identification for a high number of replicates can typically be achieved through this approach, thus circumventing challenges of low detection, resolution, and output from traditional culturing, microscopy, or histological staining techniques. Therefore, this method is well-suited for characterizing vector microbes under diverse conditions but cannot currently provide information on microbial function, location within the vector, or response to antibiotic treatment. Overall, 16S next-generation sequencing is a powerful technique for better understanding the identity and role of vector microbes in disease dynamics.

Here we present a next-generation sequencing protocol for 16S rRNA sequencing which enables identification and characterization of microbial communities within vectors. This method involves DNA extraction, amplification and barcoding of samples through PCR, sequencing on a flow-cell, and bioinformatics to match sequence data to phylogenetic information.

אפיון Microbiome שנתות על-ידי מטוסי אף-16 הדור הבא rRNA אמפליקון רצף

In recent decades, vector-borne diseases have re-emerged and expanded at alarming rates, causing considerable morbidity and mortality worldwide. Effective ...

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the immune system. Perturbation of the healthy gut microbiome has been suggested to play a role in the development of inflammatory diseases, including multiple sclerosis (MS). Environmental and genetic factors can influence the composition of the microbiome; therefore, identification of microbial communities linked with a disease phenotype has become the first step towards defining the microbiome&#8217;s role in health and disease. Use of 16S rRNA metagenomic sequencing for profiling bacterial community has helped in advancing microbiome research. Despite its wide use, there is no uniform protocol for 16S rRNA-based taxonomic profiling analysis. Another limitation is the low resolution of taxonomic assignment due to technical difficulties such as smaller sequencing reads, as well as use of only forward (R1) reads in the final analysis due to low quality of reverse (R2) reads. There is need for a simplified method with high resolution to characterize bacterial diversity in a given biospecimen. Advancements in sequencing technology with the ability to sequence longer reads at high resolution have helped to overcome some of these challenges. Present sequencing technology combined with a publicly available metagenomic analysis pipeline such as R-based Divisive Amplicon Denoising Algorithm-2 (DADA2) has helped advance microbial profiling at high resolution, as DADA2 can assign sequence at the genus and species levels. Described here is a guide for performing bacterial profiling using two-step amplification of the V3-V4 region of the 16S rRNA gene, followed by analysis using freely available analysis tools (i.e., DADA2, Phyloseq, and METAGENassist). It is believed that this simple and complete workflow will serve as an excellent tool for researchers interested in performing microbiome profiling studies.

Described here is a simplified standard operating procedure for microbiome profiling using 16S rRNA metagenomic sequencing and analysis using freely available tools. This protocol will help researchers who are new to the microbiome field as well as those requiring updates on methods to achieve bacterial profiling at a higher resolution.

אנליזה microbiota באמצעות שני שלבים PCR ו-הדור הבא של 16 rRNA גן רצף

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...

רצף של הדור הבא של 16S ריבוזומלי amplicons ג'ין RNA

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video