Name: genotyping of staphylococcus aureus by ribosomal spacer pcr (rs-pcr)
Uploaded: 2016-11-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR RS-PCR at JoVE.com

The author thanks R. Boss, A. Cosandey, C. Fournier, I. Ivanovic, and J. Naskova for their excellent work.

1. Staphylococcus aureus <ol><li> Espalhe 10 ul de S. aureus cultura de reserva ou uma colónia crescida em meio selectivo em placas de agar de Columbia contendo 5% de sangue de carneiro (BA). </li><li> Incubar aerobicamente a 37 ° C durante 18 h a 24 h. </li></ol> 2. Extração de DNA <ol><li> Preparar tampão TEL contendo Tris-HCl 10 mM e 10 mM de Na 2 EDTA, pH 8,5. Preparar alíquotas e autoclave a 121 ° C durante 15 min. </li><li> Recolha 1 colónia da BA usando uma ansa estéril de plástico ou um palito de madeira estéril e ressuspender em 100 mL TEL. Use tubos de 1,5 ml com tampas de rosca. </li><li> Incubar a 95 ° C durante 10 min. Em seguida, coloque as amostras imediatamente em gelo molhado. </li><li> Dilui-se as amostras 1: 100 em H2O adequado para PCR (= ADN molde para PCR). As amostras não diluídas e diluídas podem ser mantidos à temperatura de -20 ° C durante 1 mês. </li></ol> 3. RS-PCR <ol><li&gt; para cada pipeta de amostra para um tubo de PCR de 1,5 ul de H2O, 12,5 uL de Taq Master Mix, 2 ul de iniciador G1 10? M, 2 ul de L1 iniciador 10 uM, e 7 ul de molde de ADN que corresponde a cerca de 30 ng de puro DNA 2. </li><li> Executar o seguinte programa de ciclos num ciclizador PCR padrão: 15 min 95 ° C, seguido por 27 ciclos que compreendem 94 ° C durante 1 min, seguido de uma rampa de 2 minutos e hibridação a 55 ° C durante 7 min. Após mais 2 min rampa, estender a 72 ° C durante 2 min. Terminar PCR por uma extensão final a 72 ° C durante 10 minutos, seguido por arrefecimento a 4 ° C. NOTA: Os produtos de PCR podem ser armazenadas a -20 ° C durante 5 dias. </li><li> Para cada passagem de RS-PCR incluem um controlo positivo, ou seja, uma amostra com um genótipo conhecido (normalmente GTB), e um controlo negativo (H2O). </li></ol> 4. Eletroforese <ol><li> Use um kit de eletroforese miniaturizado comercial para DNA (kit MED) em conjuntocom um Bioanalyzer conectado a um PC eo software instalado. Estudar os manuais correspondentes do fabricante com cuidado. </li><li> Configurar a estação de priming de chips e ajustar o clipe de seringa de acordo com o manual do fabricante. </li><li> Preparar a mistura de gel de corante-de acordo com o manual do fabricante. </li><li> Carregando o mix gel-dye (de acordo com o manual do fabricante). <ol><li> Equilibrar a mistura de gel de corante-à TA durante 30 min antes da utilização. </li><li> Coloque novo chip de ADN na estação de chip de priming. Pipeta 9 jul de gel-dye na G. bem marcado </li><li> Certifique-se de que o êmbolo está posicionado em 1 ml e depois fechar a estação de chip de priming. Pressione o êmbolo até que seja preso pelo clipe seringa. Espere exatamente durante 30 segundos, em seguida, solte o clipe seringa. </li><li> Espere por 5 seg. Puxe lentamente o êmbolo para 1 ml posição. </li><li> Abrir chip de estação de priming e pipeta 9 jul de gel-dye em ambos os poços marcados &#39;G&#39;. </li></ol></li><li> Carregando o Marker <ol><li> Pipetar 5 ul de marcador em todos os 12 poços de amostra e na escada bem. Não deixe qualquer um destes 13 poços vazios. </li></ol></li><li> Carregando a escada e as amostras. <ol><li> Pipeta de 1 ml de escada de DNA para o bem-marcados com o sinal escada. </li><li> Pipetar 1 mL da amostra (poços utilizados) ou 1 ul de água desionizada (poços) não utilizados. </li><li> Colocar o chip horizontalmente no adaptador e vortex durante 1 min a 2400 rpm. </li><li> Executar o chip no Bioanalyzer dentro de 5 min. </li></ol></li><li> Execução da análise <ol><li> Comece o Bioanalyzer eo computador conectado. Abra o software. </li><li> Abra a tampa do Bioanalyzer e colocar o chip no suporte do chip (o chip se encaixa apenas um caminho). Feche a tampa com cuidado. </li><li> No contexto Instrumento do software selecione &quot;Eletroforese&quot;&gt; &quot;dsDNA&quot;&gt; &quot;DNA 7500&quot;. Aceitar o prefixo do arquivo atual do software ou modificá-lo.</li><li> Clique no botão Iniciar presente no software. Digite os nomes de amostra no software. Quando o chip de execução é concluída (após cerca de 30 min) o Fim do Run mensagem aparece no software Bioanalyzer. </li><li> Remover o chip e limpar os eléctrodos do Bioanalyzer de acordo com as instruções do fabricante. </li></ol></li></ol> 5. inferir o genótipo do perfil Eletroforese <ol><li> Carregue o software Mahal (software está disponível gratuitamente a partir dos autores). </li><li> dados de referência importação para o software Mahal: &quot;Arquivo&quot;&gt; ​​&quot;Importar Dados de Referência&quot; </li><li> Abra o eletroforese executado no contexto de dados do software Bioanalyzer. Selecione um perfil de electroforese de uma amostra. </li><li> Verifique se os picos relevantes. <ol><li> Use o software Mahal para verificar se os picos relevantes: &quot;Ferramentas&quot;&gt; &quot;Média de Fluorescência&quot;. Insira na caixa &quot;fluorescência&quot;os valores de fluorescência indicado como unidades de fluorescência (UF), tal como eles podem ser lidos a partir do software Bioanalyzer. Insira as (3) picos 4 com a maior fluorescência em ordem crescente e separados por vírgulas. Exemplo: 126.130.132.137. NOTA: Se nem todos estes picos FU são indicados pelo software Bioanalyzer, eles precisam ser estimada por lê-los para fora da trama. </li></ol></li><li> Pressione o botão &quot;Calcular&quot;. Um pico é relevante se a fluorescência observado exceder o valor dado na caixa &quot;Minimal altura de pico&quot;. </li><li> Inferir o genótipo. <ol><li> Inserir na caixa de texto Mahal &quot;Picos de entrada (pb)&quot; os tamanhos em bp de todos os picos relevantes em ordem crescente e separados por vírgulas. Exemplo: 440.462.519.579.637. NOTA: Se nem todos esses tamanhos de pico são indicados pelo software Bioanalyzer, eles precisam ser estimada por lê-los para fora da trama. </li></ol></li><li> Pressione o botão &quot;Calcular&quot;. </li><li> Na listacaixa de, procure o mínimo quadrado distância de Mahalanobis &quot;D2M&quot;. Se o valor P correspondente direito a ela é ≥0.05 então a probabilidade é ≥5% que a hipótese nula H 0 é rejeitada (H 0: o observado e os contornos de referência são idênticos) o que significa que o perfil observado é aceito para ser idêntico ao o perfil de referência do genótipo indicada. </li><li> Se D2M é mínima, mas o campo do valor de P correspondente está vazia, rejeitar H 0 com uma probabilidade de &lt;5%. Nota: Isto significa que os perfis são desiguais embora D2M é mínima. Tal resultado pode resultar de condições não-médias electroforese. <ol><li> Para corrigir estes desvios, insira na caixa de texto &quot;Observado Peak (pb)&quot; o valor 395 e pressione o botão &quot;Calcular&quot;. Verifique novamente por D2M mínimo e um ≥0.05 valor P correspondente. Se não funcionar, tente os valores 405, 415 e 425. Nota: Às vezes pequenos passos são aindaindicado. Se ainda não tiver êxito, o perfil observado não está presente nos dados de referência, que pode ser um novo genótipo ou variante. </li></ol></li><li> vários perfis <ol><li> Repita os passos de 5,6-5,9 para cada perfil de electroforese em separado. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

O passo mais importante de todo o processo é quando há um excesso de ADN de RS-PCR (&gt; 30 ng de ADN / ensaio puro) 2. Em geral, a resolução de um perfil é ideal se todos os seus picos de começar e terminar na linha de base. Se dois picos são muito próximos, a resolução é incompleto. Sob estas condições, o software Bioanalyzer inadequado pode levar ao pico de identificação de modo a que é requerida uma identificação manual. Todos os picos visivelmente separadas e relevantes expressos em pb ou FU são incluídos para análises posteriores. Demasiado DNA modelo para RS-PCR resulta em picos largos e, portanto, para o pico resolução sobreposição e deficientes dos picos. Além disso, a migração mais lenta é a principal pico de tamanhos que são falsamente aumentadas de modo a que o genótipo já não pode ser inferida. Finalmente, o número de picos irrelevantes é maior. Para perfis com mais de 3 picos, o pico com o máximo de fluorescência normalmente não deve exceder 150 FU. A genotipagem por RS-PCR como descrito é limitado pelo facto de que o investimento em máquinas é necessário e o software livre Mahal é necessária. Na verdade, são necessários uma máquina de PCR padrão e o Bioanalyzer. O primeiro é bastante barato hoje em dia, enquanto a segunda é mais caro. A resolução de electroforese em agarose-base não é suficiente, mesmo se for alta resolução de agarose é usado. Nestas condições, é apenas possível distinguir entre GTB, GTC, e todos os outros genótipos. Os custos para a electroforese utilizando o kit de MED ou electroforese em agarose, no entanto, são similares. O kit MED em conjunto com o Bioanalyzer ainda supera electroforese de agarose padrão de uma maneira que o último método é útil, para a frente, e os dados obtidos está presente na forma electrónica que simplifica o armazenamento e análise adicional consideravelmente. Principalmente todos bioanalyzers comercialmente disponíveis são adequados para este tipo de análise desde que o electrophoretresolução ic é adequado e o tamanho obtido das bandas é preciso e imparcial. A resolução da RS-PCR para as estirpes da espécie bovina de S. aureus é alta. É tão bom como tipagem spa, e melhor do que MLST e PFGE 4,14. Além disso, em comparação com todos os outros métodos de tipagem comumente utilizados para subtipagem S. aureus (tipagem spa, MLST, PFGE), o seu rendimento da amostra é elevada: extração de DNA é fácil e rápido, 96 amostras podem ser processadas em uma corrida RCR (normalmente O / N) e eletroforese e do genótipo inferência é sempre em frente. A análise completa de 96 amostras requer uma noite para PCR e um dia para eletroforese e avaliação. Outras vantagens de RS-PCR por Fournier et al. 2 são os custos baixos, em particular quando comparado com MLST que exige sete genes a serem sequenciados em ambas as direcções 15. Além disso, RS-PCR é o único método prevendo contagiosidade e patogenicidade de estirpes deS. aureus envolvidos em mastite bovina 2,5, preditores chave na medicina veterinária clínica. Finalmente, RS-PCR por si só é suficiente para investigar a epidemiologia de S. bovina aureus 3,4,5,14. A interpretação dos dados é sempre em frente, mesmo em um contexto internacional como apenas alguns genótipos principais são observados 2,3. Para comparações epidemiológicas entre bovinos e cepas humanas, RS-PCR e tipagem spa juntos são preferíveis como o último método é amplamente utilizado para subtipagem cepas humanas de modo que uma grande quantidade de dados está disponível. MLST, contudo, é adequado para avaliar a clonalidade das estirpes 15 e para análises filogenéticas 4. Para solução de problemas em relação à cycler PCR, kit MED, ea Bioanalyzer, os manuais correspondentes devem ser consultados. No caso do método de RS-PCR, solução de problemas é maciçamente simplificado se os controles de PCR positivas e negativas adequadas são included em cada corrida. Se o controle positivo é negativo, a mistura de PCR não foi adequadamente composto e / ou o ADN de controlo foi degradada. Se o controlo negativo (H2O) gerada uma ou mais bandas, a mistura de PCR foi contaminado com um pouco de DNA. Em ambos os casos, os perfis não deve ser interpretado e RS-PCR tem de ser repetido. Se a interpretação é impossível por causa de um problema de electroforese, electroforese deve ser repetido utilizando um novo chip. problemas electroforéticos são normalmente caracterizados pela migração inadequada e o alinhamento de uma ou ambas as bandas dos marcadores resultantes de carregamento e manipulação do chip inadequado. Se o perfil de electroforese obtida não pode ser interpretado pelo software Mahal, o ficheiro do perfil gerado pelo software Bioanalyzer é enviado para o autor para posterior avaliação. Normalmente, o ADN molde foi muito usado para RS-PCR ou o perfil representa um novo genótipo variante ou genotípico.

Staphylococcus (S. aureus) é conhecido como o mais importante agente patogénico responsável a nível mundial para a infecção intramamária (IMI) em bovinos 1. O estudo realizado por Fournier et al. 2 demonstraram em vacas suíças e os estudos por Cosandey et al. 3 e Boss et al. 4, em vacas de 12 países europeus que S. aureus isolados de bovinos IMI é um grupo geneticamente heterogénea. Por amplificação por PCR de rRNA 16S-23S região espaçadora de intergénica (RS-PCR), um total de 17 genótipos foram inicialmente detectados em 101 isolados independentes epidemiologicamente 2. Genótipo B eo genótipo C (GTC) eram mais comuns (80%), enquanto os outros 15 genótipos (GTs) ocorreram raramente, cada um fazendo 1 a 4% de todos os isolados. A nível europeu 3, GTB, GTC, GTF, GTI e GTR foram os genótipos mais importantes que compreendem 76% de todas as cepas analisadas (n = 456). GTB estava situada na Europa Central whereas os outros genótipos foram amplamente divulgados. Os restantes 24% das cepas incluiu 41 genótipos, muitos deles, no entanto, foram observados apenas uma vez. Os estudos por Fournier et al. 2, Cosandey et al. 3, e Graber et ai. 5 ainda demonstrado que os genótipos foram altamente associado com o seu padrão de gene de virulência, bem como no Swiss como a nível europeu. Os estudos revelaram ainda grandes diferenças na prevalência do IMI entre S. aureus GTB, GTC e os outros genótipos de 2,5: Considerando GTB, até 87% das vacas em um rebanho foram infectados por esse genótipo. No caso de GTC e de outros genótipos, no entanto, o IMI foi encontrado apenas em 1 a 2 vacas de uma manada. IMI causada por S. aureus, normalmente resulta em inflamação das glândulas mamárias correspondentes e um aumento de células inflamatórias no leite. Como consequência, a co células somáticasunts no leite (SCC), o principal indicador da qualidade do leite na maioria dos países, é aumentada levando a um preço de leite diminuída ou até mesmo parar de entrega. Além do RS-PCR de Fournier et ai. 2, outros métodos de tipagem foram descritas para subtipar estirpes de S. bovina aureus 8-11. Dois dos mais comuns incluem spa digitação 12 e multi Locus Sequence Typing (MLST) 13. O primeiro é baseado em sequenciação de ADN da região variável de espaçador do gene que codifica para a proteína Termas de estafilococos A, enquanto que o segundo exige uma sequenciação de 7 genes housekeeping. Isto significa que um e sete 12 PCRs 13, respectivamente, têm de ser realizada, seguido por purificação amplicão, reacção de sequenciação e análise utilizando equipamento específico. Em comparação com RS-PCR, estes métodos requerem um considerável esforço adicional no laboratório resultando num rendimento de amostras de baixo e custos elevados. othroughput é particularmente baixa para PFGE. Considerando a resolução destes métodos para as estirpes da espécie bovina de S. aureus, RS-PCR é pelo menos tão boa como spa digitando 4 e melhor do que MLST 4 ou 15 PFGE. Todos estes métodos, incluindo digitação binário 13 demonstraram a sua eficácia na obtenção de mais conhecimento sobre a patogênese da bovina IMI causada por S. aureus, mas por causa das restrições mencionadas são menos apropriada para grandes investigações clínicas. Além disso, a genotipagem pela RS-PCR como descrito por Fournier et al. 2 permite a previsão fiável do epidemiológica e o potencial patogênico de S. aureus envolvido no IMI bovina, dois valores-chave na medicina veterinária clínica.

<table><tbody><tr><td>Tris(hydroxymethyl)-aminomethan</td><td>Merck</td><td>1.08382.0500</td><td>Mw = 121.14 g/mol</td></tr><tr><td>Titriplex III</td><td>Merck</td><td>1.08418.0250</td><td>Mw = 372.24 g/mol; Substance is equivalent to Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;EDTA&amp;middot;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>Hydrochloric acid 5 mol/L</td><td>Merck</td><td>1.09911.0001</td><td></td></tr><tr><td>Columbia agar+5% sheep blood</td><td>bioM&amp;eacute;rieux</td><td>43049</td><td></td></tr><tr><td>Agilent DNA7500 Kit</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1504</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2940CA</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 2100 expert sofware</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HotStarTaq master mix&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>203445</td><td></td></tr><tr><td>Primer L1</td><td>Mycrosinth</td><td></td><td>5&#039;CAA GGC ATC CAC CGT3&#039;</td></tr><tr><td>Primer G1</td><td>Mycrosinth</td><td></td><td>5&#039;GAA GTC GTA ACA AGG3&#039;</td></tr></tbody></table>

genotyping of staphylococcus aureus by ribosomal spacer pcr (rs-pcr)

The ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is a highly resolving and robust genotyping method for S. aureus that allows a high throughput at moderate costs and is, therefore, suitable to be used for routine purposes. For best resolution, data evaluation and data management, a miniaturized electrophoresis system is required. Together with such an electrophoresis system and the in-house developed software (freely available here) assignment of the pattern of bands to a genotype is standardized and straight forward. DNA extraction is simple (boiling prep), setting-up of the reactions is easy and they can be run on any standard PCR machine. PCR cycling is common except prolonged ramping and elongation times. Compared to spa typing and Multi Locus Sequence Typing (MLST), RS-PCR does not require DNA sequencing what simplifies the analysis considerably and allows a high throughput. Furthermore, the resolution for bovine strains of S. aureus is at least as good as spa typing and better than MLST or pulsed-field gel electrophoresis (PFGE). The RS-PCR data base includes presently a total of 141 genotypes and variants. The method is highly associated with the virulence gene pattern, contagiosity and pathogenicity of S. aureus strains involved in bovine mastitis. S. aureus genotype B (GTB) is contagious and causes herds problems causing large costs in the Switzerland and other European countries. All the other genotypes observed in Switzerland infect individual cows and quarters. Genotyping by RS-PCR allows the reliable prediction of the epidemiological and the pathogenic potential of S. aureus involved in bovine intramammary infection (IMI), two key factors for clinical veterinary medicine. Because of these beneficial properties together with moderate costs and a high sample throughput the goal of this publication is to give a detailed, step-by-step protocol for easily establishing and running RS-PCR for genotyping S. aureus in other laboratories.

Definição de um genótipo e suas variantes Um perfil electroforético que difira em mais do que uma banda de todos os genótipos identificados é considerado como um novo genótipo. Novos genótipos são nomeados e ampliado de acordo com a Fournier et al. 5 levando aos genótipos GTA a GTZ, seguido pelos genótipos GTAA para GTAZ e GTBA para GTBZ e GTCA para GTCC no presente. Variação em apenas uma faixa é considerado como uma variante genotípico. É indicado com algarismos romanos sobrescritos após o nome do genótipo (por exemplo, GTRI, GTRII). No total, existem atualmente 141 genótipos e variantes na base de dados de referência. Sob as condições descritas acima, RS-PCR por Fournier et al. 5 é altamente reprodutível para genotipar estirpes de S. aureus. a identificação definitiva de umagenótipo ou variante conhecida é sempre possível se os problemas técnicos podem ser excluídos. Um resultado típico é apresentada na Figura 1 demonstra a electroforese de 12 produtos de RS-PCR e apresentados no modo pseudo-gel por o software Bioanalyzer. Cada pista é caracterizado por um padrão de dois ou mais bandas de PCR e uma banda marcadora na frente e uma faixa do marcador no final. Clicando duas vezes em uma pista abre o perfil eletroforético correspondente, realmente medido em uma janela separada. O software Bioanalyzer permite, entre outras possibilidades, os picos observados como sendo lido tamanho como unidades fluorescentes FU (Figura 2) ou na pb (Figura 3) através do qual um pico corresponde exactamente a uma banda no modo pseudo-gel. Leitura de pico em FU é necessário para avaliar os picos relevantes de um perfil no software Mahal (Figura 4), a leitura no pb para inferir o genótipo. picos irrelevantes são definidos no software Mahal tão pequena ervilhaKS cuja fluorescência observada FU é inferior a 40% da média geométrica dos (3) 4 picos com maior fluorescência. Eles são normalmente observado quando há um excesso de ADN em RS-PCR (&gt; 30 ng de ADN / ensaio puro) 2. Como um exemplo, o genótipo da amostra 211 presente na Figura 1 é inferida. A análise visual do perfil eletroforético na Figura 2 (software Bioanalyzer) e análise com o software Mahal usando a ferramenta para testar os picos irrelevantes revelou 6 picos relevantes com tamanhos de pico de 395 bp, 432 bp, 453 bp, 505 bp, 567 bp, e 622 pb (Figura 3). Estes valores são preenchidos e separados por vírgulas na caixa de texto &quot;picos de entrada (pb)&quot; do software Mahal (Figura 4). Para corrigir desvios específicos de funcionamento, o valor 415 foi inserido na caixa de texto &quot;Observado Peak (pb)&quot; (Figura 4). Depois de ter pressionado o &quot;Calculate &quot;botão, uma lista é apresentada ordenados por genótipo em conjunto com o D2M distância de Mahalanobis ao quadrado entre o perfil genotípico consultado e indicado. Role a lista procurando D2M mínima. No presente caso, mínimo D2M é igual a 4.499 (Figura 4) com um valor de P ≥0.05, o que significa que o perfil consultado não diferem significativamente do de um GTB. Variantes de genótipos são indicados como _I para _XV no software Mahal. No caso de genótipo B, existem os três variantes GBT I, GBT II, III e GBT indicados como B_I, B_II, e B_III no software (Figura 4). Um chip do kit MED permite que os produtos de análise de 12 RS-PCR de cada vez. Se menos produtos estão disponíveis, os restantes poços têm de ser carregado com água desionizada. Os resultados só podem ser interpretados se os controlos included na RS-PCR são adequados. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54623/54623fig1.jpg" /> Figura 1. Pseudo-gel representando 12 produtos RS-PCR e seus genótipos inferidos. Doze diferentes cepas de S. aureus foram analisados por RS-PCR utilizando o kit de MED em conjunto com um Bioanalyzer e o software incluído. A pista do lado esquerdo mostra o marcador ou &quot;escada&quot; para a calibração tamanho do sistema em pb. No topo dos gráficos, os nomes de amostra e os genótipos correspondentes são indiciados que foram obtidos pelo software Mahal. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54623/54623fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54623/54623fig2.jpg" /> Figura 2. Perfil eletroforético de sample 161 presente na Figura 1. No topo dos picos da fluorescência medida é indicado em FU. Picos visualmente distinguíveis que não foram detectados pela necessidade software Bioanalyzer a ser estimado por lê-los para fora da trama como realizado para o pico com um valor de fluorescência estimado de 113 FU (em azul). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54623/54623fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54623/54623fig3.jpg" /> Figura 3. Perfil eletroforética da amostra de 211 presentes na Figura 1. No topo dos picos seu tamanho é indicado em pb. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54623/54623fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src = &quot;/ files / ftp_upload / 54623 / 54623fig4.jpg&quot; /&gt; Figura 4. Captura de tela do software Mahal. Na caixa de texto &quot;Picos de entrada (pb)&quot; os tamanhos de pico de amostra 211 da Figura 3 são preenchidos. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54623/54623fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR RS-PCR

Here, ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is used together with a miniaturized electrophoresis system as a fast and high resolution method for genotyping S. aureus at moderate costs allowing a high throughput.

genotipagem de<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; por Ribossômico Spacer PCR (RS-PCR)

The ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is a highly resolving and robust genotyping method for S. aureus that allows a high throughput at moderate costs and is, ...

genotyping-of-staphylococcus-aureus-by-ribosomal-spacer-pcr-rs-pcr

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR (RS-PCR)

9.6K visualizações.  Agroscope. Here, ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is used together with a miniaturized electrophoresis system as a fast and high resolution method for genotyping S. aureus at moderate costs allowing a high throughput.

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Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in which the gene of interest has been disrupted. A gene-disruption DNA construct containing a suitable antibiotic resistance marker gene is useful for the generation of gene-disrupted strains in bacteria. However, conventional construction methods, which require gene cloning steps, involve complex and time-consuming protocols. Here, a relatively facile, rapid, and cost-effective method for targeted gene disruption in Streptococcus mutans is described. The method utilizes a 2-step fusion polymerase chain reaction (PCR) to generate the disruption construct and electroporation for genetic transformation. This method does not require an enzymatic reaction, other than PCR, and additionally offers greater flexibility in terms of the design of the disruption construct. Employment of electroporation facilitates the preparation of competent cells and improves the transformation efficiency. The present method may be adapted for the generation of gene-disrupted strains of various species.

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

We describe a facile, rapid, and relatively inexpensive method for the generation of gene-disrupted Streptococcus mutans strains; this technique may be adapted for the generation of gene-disrupted strains of various species.

Geração de um Gene-interrompeu Streptococcus mutans estirpe sem Gene clonagem

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in ...

Genética

One-day Workflow Scheme for Bacterial Pathogen Detection and Antimicrobial Resistance Testing from Blood Cultures

Bloodstream infections are associated with high mortality rates because of the probable manifestation of sepsis, severe sepsis and septic shock1. Therefore, rapid administration of adequate antibiotic therapy is of foremost importance in the treatment of bloodstream infections. The critical element in this process is timing, heavily dependent on the results of bacterial identification and antibiotic susceptibility testing. Both of these parameters are routinely obtained by culture-based testing, which is time-consuming and takes on average 24-48 hours2, 4. The aim of the study was to develop DNA-based assays for rapid identification of bloodstream infections, as well as rapid antimicrobial susceptibility testing. The first assay is a eubacterial 16S rDNA-based real-time PCR assay complemented with species- or genus-specific probes5. Using these probes, Gram-negative bacteria including Pseudomonas spp., Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli as well as Gram-positive bacteria including Staphylococcus spp., Staphylococcus aureus, Enterococcus spp., Streptococcus spp., and Streptococcus pneumoniae could be distinguished. Using this multiprobe assay, a first identification of the causative micro-organism was given after 2 h.
Secondly, we developed a semi-molecular assay for antibiotic susceptibility testing of S. aureus, Enterococcus spp. and (facultative) aerobe Gram-negative rods6. This assay was based on a study in which PCR was used to measure the growth of bacteria7. Bacteria harvested directly from blood cultures are incubated for 6 h with a selection of antibiotics, and following a Sybr Green-based real-time PCR assay determines inhibition of growth. The combination of these two methods could direct the choice of a suitable antibiotic therapy on the same day (Figure 1). In conclusion, molecular analysis of both identification and antibiotic susceptibility offers a faster alternative for pathogen detection and could improve the diagnosis of bloodstream infections.

The design of a straightforward one-day workflow scheme for bacterial pathogen diagnostics enables the rapid recognition of bloodstream infections. The inclusion of eight clinically relevant bacterial targets and their antibiotic resistance profiles offers the clinician an initial insight on the same day, which can lead to more adequate therapy.

Um dia-Esquema de fluxo de trabalho para detecção de patógenos de bactérias e de resistência antimicrobiana de hemoculturas

Bloodstream infections are associated with high mortality rates because of the probable manifestation of sepsis, severe sepsis and septic shock1. ...

Imunologia e Infecção

Biosensor for Detection of Antibiotic Resistant Staphylococcus Bacteria

A structurally transformed lytic bacteriophage having a broad host range of Staphylococcus aureus strains and a penicillin-binding protein (PBP 2a) antibody conjugated latex beads have been utilized to create a biosensor designed for discrimination of methicillin resistant (MRSA) and sensitive (MSSA) S. aureus species 1,2. The lytic phages have been converted into phage spheroids by contact with water-chloroform interface. Phage spheroid monolayers have been moved onto a biosensor surface by Langmuir-Blodgett (LB) technique 3. The created biosensors have been examined by a quartz crystal microbalance with dissipation tracking (QCM-D) to evaluate bacteria-phage interactions. Bacteria-spheroid interactions led to reduced resonance frequency and a rise in dissipation energy for both MRSA and MSSA strains. After the bacterial binding, these sensors have been further exposed to the penicillin-binding protein antibody latex beads. Sensors analyzed with MRSA responded to PBP 2a antibody beads; although sensors inspected with MSSA gave no response. This experimental distinction determines an unambiguous discrimination between methicillin resistant and sensitive S. aureus strains. Equally bound and unbound bacteriophages suppress bacterial growth on surfaces and in water suspensions. Once lytic phages are changed into spheroids, they retain their strong lytic activity and show high bacterial capture capability. The phage and phage spheroids can be utilized for testing and sterilization of antibiotic resistant microorganisms. Other applications may include use in bacteriophage therapy and antimicrobial surfaces.

Lytic phage biosensors and antibody beads are able to discriminate between methicillin resistant (MRSA) and sensitive staphylococcus bacteria. The phages were immobilized by a Langmuir-Blodgett method onto a surface of a quartz crystal microbalance sensor and worked as broad range staphylococcus probes. Antibody beads recognize MRSA.

Biossensor para detecção de bactérias Staphylococcus resistente a antibióticos

A structurally transformed lytic bacteriophage having a broad host range of Staphylococcus aureus strains and a penicillin-binding protein (PBP 2a) ...

Bioengenharia

Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec) typing is a very important molecular tool for understanding the epidemiology and clonal strain relatedness of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA), particularly with the emerging outbreaks of community-associated MRSA (CA-MRSA) occurring on a worldwide basis. Traditional PCR typing schemes classify SCCmec by targeting and identifying the individual mec and ccr gene complex types, but require the use of many primer sets and multiple individual PCR experiments. We designed and published a simple multiplex PCR assay for quick-screening of major SCCmec types and subtypes I to V, and later updated it as new sequence information became available. This simple assay targets individual SCCmec types in a single reaction, is easy to interpret and has been extensively used worldwide. However, due to the sophisticated nature of the assay and the large number of primers present in the reaction, there is the potential for difficulties while adapting this assay to individual laboratories. To facilitate the process of establishing a MRSA SCCmec assay, here we demonstrate how to set up our multiplex PCR assay, and discuss some of the vital steps and procedural nuances that make it successful.

Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

We demonstrate a simple multiplex PCR assay for quick-screening and typing of Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec) types I-V for methicillin-resistant Staphylococcus aureus, and provide some of the vital steps and procedural nuances that make it successful for adapting this assay to individual laboratories.

Multiplex PCR Ensaio para a digita

Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec) typing  is a very important molecular tool for understanding the epidemiology and  clonal strain ...

MS2-Affinity Purification Coupled with RNA Sequencing in Gram-Positive Bacteria

Although small regulatory RNAs (sRNAs) are widespread among the bacterial domain of life, the functions of many of them remain poorly characterized notably due to the difficulty of identifying their mRNA targets. Here, we described a modified protocol of the MS2-Affinity Purification coupled with RNA Sequencing (MAPS) technology, aiming to reveal all RNA partners of a specific sRNA in vivo. Broadly, the MS2 aptamer is fused to the 5&#8217; extremity of the sRNA of interest. This construct is then expressed in vivo, allowing the MS2-sRNA to interact with its cellular partners. After bacterial harvesting, cells are mechanically lysed. The crude extract is loaded into an amylose-based chromatography column previously coated with the MS2 protein fused to the maltose binding protein. This enables the specific capture of MS2-sRNA and interacting RNAs. After elution, co-purified RNAs are identified by high-throughput RNA sequencing and subsequent bioinformatic analysis. The following protocol has been implemented in the Gram-positive human pathogen Staphylococcus aureus and is, in principle, transposable to any Gram-positive bacteria. To sum up, MAPS technology constitutes an efficient method to deeply explore the regulatory network of a particular sRNA, offering a snapshot of its whole targetome. However, it is important to keep in mind that putative targets identified by MAPS still need to be validated by complementary experimental approaches.

MAPS technology has been developed to scrutinize the targetome of a specific regulatory RNA in vivo. The sRNA of interest is tagged with a MS2 aptamer enabling the co-purification of its RNA partners and their identification by RNA sequencing. This modified protocol is particularly suited for Gram-positive bacteria.&#160;

Purificação de Afinidade MS2 juntamente com sequenciamento de RNA em bactérias gram-positivas

Although small regulatory RNAs (sRNAs) are widespread among the bacterial domain of life, the functions of many of them remain poorly characterized ...

Bioquímica

Identification of Rare Bacterial Pathogens by 16S rRNA Gene Sequencing and MALDI-TOF MS

There are a number of rare and, therefore, insufficiently described bacterial pathogens which are reported to cause severe infections especially in immunocompromised patients. In most cases only few data, mostly published as case reports, are available which investigate the role of such pathogens as an infectious agent. Therefore, in order to clarify the pathogenic character of such microorganisms, it is necessary to conduct epidemiologic studies which include large numbers of these bacteria. The methods used in such a surveillance study have to meet the following criteria: the identification of the strains has to be accurate according to the valid nomenclature, they should be easy to handle (robustness), economical in routine diagnostics and they have to generate comparable results among different laboratories. Generally, there are three strategies for identifying bacterial strains in a routine setting: 1) phenotypic identification characterizing the biochemical and metabolic properties of the bacteria, 2) molecular techniques such as 16S rRNA gene sequencing and 3) mass spectrometry as a novel proteome based approach. Since mass spectrometry and molecular approaches are the most promising tools for identifying a large variety of bacterial species, these two methods are described. Advances, limitations and potential problems when using these techniques are discussed.

Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) and molecular techniques (16S rRNA gene sequencing) permit the identification of rare bacterial pathogens in routine diagnostics. The goal of this protocol lies in the combination of both techniques which leads to more accurate and reliable data.

Identificação de patógenos bacterianos raras, seqüência do gene 16rRNA e MALDI-TOF MS

There are a number of rare and, therefore, insufficiently described bacterial pathogens which are reported to cause severe infections especially in ...

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Transposon mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is less time consuming, less costly, and does not require completed genome information, there are two weaknesses in this method: (1) the possibility of a disparate mutants in the mixed mutant library that counter-selects mutants with decreased competition; and (2) the possibility of partial gene inactivation whereby genes do not entirely lose their function following the insertion of a transposon. Single-gene deletion analysis may compensate for the drawbacks associated with transposon mutagenesis. To improve the efficiency of genome-wide single gene deletion, we attempt to establish a high-throughput technique for genome-wide single gene deletion using Streptococcus sanguinis as a model organism. Each gene deletion construct in S. sanguinis genome is designed to comprise 1-kb upstream of the targeted gene, the aphA-3 gene, encoding kanamycin resistance protein, and 1-kb downstream of the targeted gene. Three sets of primers F1/R1, F2/R2, and F3/R3, respectively, are designed and synthesized in a 96-well plate format for PCR-amplifications of those three components of each deletion construct. Primers R1 and F3 contain 25-bp sequences that are complementary to regions of the aphA-3 gene at their 5' end. A large scale PCR amplification of the aphA-3 gene is performed once for creating all single-gene deletion constructs. The promoter of aphA-3 gene is initially excluded to minimize the potential polar effect of kanamycin cassette. To create the gene deletion constructs, high-throughput PCR amplification and purification are performed in a 96-well plate format. A linear recombinant PCR amplicon for each gene deletion will be made up through four PCR reactions using high-fidelity DNA polymerase. The initial exponential growth phase of S. sanguinis cultured in Todd Hewitt broth supplemented with 2.5% inactivated horse serum is used to increase competence for the transformation of PCR-recombinant constructs. Under this condition, up to 20% of S. sanguinis cells can be transformed using ~50 ng of DNA. Based on this approach, 2,048 mutants with single-gene deletion were ultimately obtained from the 2,270 genes in S. sanguinis excluding four gene ORFs contained entirely within other ORFs in S. sanguinis SK36 and 218 potential essential genes. The technique on creating gene deletion constructs is high throughput and could be easy to use in genome-wide single gene deletions for any transformable bacteria.

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

An efficient genome-wide single gene mutation method has been established using Streptococcus sanguinis as a model organism. This method has achieved via high throughput recombinant PCRs and transformations.

Do genoma deleções de genes em<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; Por PCR de Alto Rendimento

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

Biologia

Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the long-lasting gold standards is to sequence 16S ribosomal RNA (rRNA) gene amplicons generated by domain-level PCR reactions amplifying from genomic DNA. Traditionally, this was performed by cloning and Sanger (capillary electrophoresis) sequencing of PCR amplicons. The advent of next-generation sequencing has tremendously simplified and increased the sequencing depth for 16S rRNA gene sequencing. The introduction of benchtop sequencers now allows small labs to perform their 16S rRNA sequencing in-house in a matter of days. Here, an approach for 16S rRNA gene amplicon sequencing using a benchtop next-generation sequencer is detailed. The environmental DNA is first amplified by PCR using primers that contain sequencing adapters and barcodes. They are then coupled to spherical particles via emulsion PCR. The particles are loaded on a disposable chip and the chip is inserted in the sequencing machine after which the sequencing is performed. The sequences are retrieved in fastq format, filtered and the barcodes are used to establish the sample membership of the reads. The filtered and binned reads are then further analyzed using publically available tools. An example analysis where the reads were classified with a taxonomy-finding algorithm within the software package Mothur is given. The method outlined here is simple, inexpensive and straightforward and should help smaller labs to take advantage from the ongoing genomic revolution.

Characterizing microbial community has been a longstanding goal in environmental microbiology. Next-generation sequencing methods now allow for the characterization of microbial communities at an unprecedented depth with minimal cost and labor. We detail here our approach to sequence bacterial 16S ribosomal RNA genes using a benchtop sequencer.

O sequenciamento de próxima geração de 16S RNA ribossomal Gene amplicons

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the ...

Efficient Nucleic Acid Extraction and 16S rRNA Gene Sequencing for Bacterial Community Characterization

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing technologies have allowed for the rapid and efficient characterization of bacterial communities using 16S rRNA gene sequencing from a variety of sources. Although readily available tools for 16S rRNA sequence analysis have standardized computational workflows, sample processing for DNA extraction remains a continued source of variability across studies. Here we describe an efficient, robust, and cost effective method for extracting nucleic acid from swabs. We also delineate downstream methods for 16S rRNA gene sequencing, including generation of sequencing libraries, data quality control, and sequence analysis. The workflow can accommodate multiple samples types, including stool and swabs collected from a variety of anatomical locations and host species. Additionally, recovered DNA and RNA can be separated and used for other applications, including whole genome sequencing or RNA-seq. The method described allows for a common processing approach for multiple sample types and accommodates downstream analysis of genomic, metagenomic and transcriptional information.

We describe an efficient, robust, and cost effective method for extracting nucleic acid from swabs for characterization of bacterial communities using 16S rRNA gene amplicon sequencing. The method allows for a common processing approach for multiple sample types and accommodates a number of downstream analytic processes.

Eficiente de Ácido Nucleico Extração e sequenciamento genético 16S rRNA para Bacteriana Comunidade Caracterização

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing ...

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the immune system. Perturbation of the healthy gut microbiome has been suggested to play a role in the development of inflammatory diseases, including multiple sclerosis (MS). Environmental and genetic factors can influence the composition of the microbiome; therefore, identification of microbial communities linked with a disease phenotype has become the first step towards defining the microbiome&#8217;s role in health and disease. Use of 16S rRNA metagenomic sequencing for profiling bacterial community has helped in advancing microbiome research. Despite its wide use, there is no uniform protocol for 16S rRNA-based taxonomic profiling analysis. Another limitation is the low resolution of taxonomic assignment due to technical difficulties such as smaller sequencing reads, as well as use of only forward (R1) reads in the final analysis due to low quality of reverse (R2) reads. There is need for a simplified method with high resolution to characterize bacterial diversity in a given biospecimen. Advancements in sequencing technology with the ability to sequence longer reads at high resolution have helped to overcome some of these challenges. Present sequencing technology combined with a publicly available metagenomic analysis pipeline such as R-based Divisive Amplicon Denoising Algorithm-2 (DADA2) has helped advance microbial profiling at high resolution, as DADA2 can assign sequence at the genus and species levels. Described here is a guide for performing bacterial profiling using two-step amplification of the V3-V4 region of the 16S rRNA gene, followed by analysis using freely available analysis tools (i.e., DADA2, Phyloseq, and METAGENassist). It is believed that this simple and complete workflow will serve as an excellent tool for researchers interested in performing microbiome profiling studies.

Described here is a simplified standard operating procedure for microbiome profiling using 16S rRNA metagenomic sequencing and analysis using freely available tools. This protocol will help researchers who are new to the microbiome field as well as those requiring updates on methods to achieve bacterial profiling at a higher resolution.

Análise de microbiota usando PCR de duas etapas e sequenciamento do gene 16S rRNA de próxima geração

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...

genotipagem de

Resumo

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