Name: genotyping of staphylococcus aureus by ribosomal spacer pcr (rs-pcr)
Uploaded: 2016-11-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR RS-PCR at JoVE.com

The author thanks R. Boss, A. Cosandey, C. Fournier, I. Ivanovic, and J. Naskova for their excellent work.

1. Staphylococcus aureus <ol><li> Étaler 10 pi de S. aureus culture mère ou une colonie cultivée sur un milieu sélectif sur des plaques de gélose Columbia contenant du sang de mouton à 5% (BA). </li><li> Incuber aérobies à 37 ° C pendant 18 h à 24 h. </li></ol> 2. Extraction de l&#39;ADN <ol><li> Préparer un tampon contenant du Tris TEL-HCl 10 mM et 10 mM de Na2EDTA, pH 8,5. Préparer des aliquotes et autoclave à 121 ° C pendant 15 min. </li><li> Collecter une colonie de BA à l&#39;aide d&#39;une anse stérile en matière plastique ou d&#39;un cure-dent en bois stérile et remettre en suspension dans 100 ul TEL. Utiliser 1,5 ml tubes avec bouchons à vis. </li><li> Incuber à 95 ° C pendant 10 min. Ensuite, placez les échantillons immédiatement sur de la glace. </li><li> Diluer les échantillons 1: 100 dans H 2 O approprié pour la PCR (= ADN matrice pour la PCR). Les échantillons non dilués et dilués peuvent être conservés à -20 ° C pendant 1 mois. </li></ol> 3. RS-PCR <ol><li&gt; Pour chaque échantillon , la pipette dans un tube de PCR 1,5 ul de H 2 O, 12,5 pi de Taq Master Mix, 2 ul G1 amorce 10 pM, 2 ul L1 amorce 10 pM, et 7 ul de l&#39; ADN matrice qui correspond à environ 30 ng de pureté DNA 2. </li><li> Exécuter le programme de cyclage suivant dans un thermocycleur standard de PCR: 15 min 95 ° C, suivie par 27 cycles comprenant 94 ° C pendant 1 min, suivie d&#39;une rampe 2 min et recuit à 55 ° C pendant 7 min. Après encore 2 min rampe, étendre à 72 ° C pendant 2 min. Se terminer par PCR par une extension finale à 72 ° C pendant 10 min suivi par un refroidissement à 4 ° C. REMARQUE: Les produits de PCR peuvent être conservés à -20 ° C pendant 5 jours. </li><li> Pour chaque série de RS-PCR comprend un contrôle positif, à savoir, un échantillon avec un génotype connu (normalement GTB), et un contrôle négatif (H 2 O). </li></ol> 4. Electrophorèse <ol><li> Utilisez un kit commercial d&#39;électrophorèse miniaturisé pour l&#39;ADN (kit MED) ensembleavec un Bioanalyseur connecté à un PC et le logiciel installé. Étudier les manuels correspondants du fabricant avec soin. </li><li> Mettre en place la station d&#39;amorçage de la puce et ajuster le clip de seringue selon le manuel du fabricant. </li><li> Préparer le mélange gel colorant selon le manuel du fabricant. </li><li> Chargement du mélange gel-dye (selon le manuel du fabricant). <ol><li> Equilibrer le mélange gel colorant à la température ambiante pendant 30 min avant utilisation. </li><li> Mettez nouvelle puce à ADN sur la station puce d&#39;amorçage. Pipette 9 pi de gel colorant dans le G. bien marqué </li><li> Assurez-vous que le piston est positionné à 1 ml, puis fermer la station puce d&#39;amorçage. Appuyez sur le piston jusqu&#39;à ce qu&#39;il soit maintenu par la pince de seringue. Attendre exactement pendant 30 secondes, puis relâchez le clip de la seringue. </li><li> Attendre 5 sec. Tirez lentement le piston pour 1 ml poste. </li><li> station d&#39;amorçage Open puce et pipette 9 pi de gel colorant dans les deux puits marqués &#39;G&#39;. </li></ol></li><li> Chargement du Marker <ol><li> Pipette 5 pi de marqueur dans l&#39;ensemble des 12 puits d&#39;échantillon et à bien l&#39;échelle. Ne laissez pas l&#39;un de ces 13 puits vides. </li></ol></li><li> Chargement du Ladder et les échantillons. <ol><li> Pipette 1 pi d&#39;échelle d&#39;ADN pour le bien-marqué du signe de l&#39;échelle. </li><li> 1 ul d&#39;échantillon (puits utilisés) ou 1 pi d&#39;eau déminéralisée (puits non utilisés). </li><li> Mettre la puce horizontalement dans l&#39;adaptateur et le vortex pendant 1 min à 2400 rpm. </li><li> Exécutez la puce dans le Bioanalyseur à moins de 5 min. </li></ol></li><li> Exécution de l&#39;analyse <ol><li> Démarrez le Bioanalyseur et l&#39;ordinateur connecté. Ouvrez le logiciel. </li><li> Ouvrez le couvercle du Bioanalyseur et placez la puce dans le support de puce (la puce correspond à une seule façon). Fermez le couvercle avec précaution. </li><li> Dans le cadre de l&#39; instrument du logiciel sélectionnez &quot;Electrophoresis&quot;&gt; &quot;ADNdb&quot;&gt; &quot;DNA 7500&quot;. Acceptez le préfixe du fichier en cours du logiciel ou de le modifier.</li><li> Cliquez sur le bouton de démarrage présente dans le logiciel. Entrez les noms des échantillons dans le logiciel. Lorsque la course à puce est terminée (après environ 30 min) , la Fin du message Run apparaît dans le logiciel de Bioanalyseur. </li><li> Retirer la puce et nettoyer les électrodes de la Bioanalyseur selon les instructions du fabricant. </li></ol></li></ol> 5. Déduire le Génotype du profil Electrophoresis <ol><li> Chargez le logiciel Mahal (logiciel est disponible gratuitement auprès des auteurs). </li><li> des données de référence à l&#39;importation dans le logiciel Mahal: &quot;Fichier&quot;&gt; &quot;Importer des données de référence&quot; </li><li> Ouvrez l&#39;électrophorèse exécuter dans le contexte des données du logiciel Bioanalyseur. Sélectionnez un profil d&#39;électrophorèse d&#39;un échantillon. </li><li> Vérifiez les pics pertinents. <ol><li> Utilisez le logiciel Mahal pour vérifier les pics pertinents: &quot;Outils&quot;&gt; &quot;Fluorescence moyenne&quot;. Insérez dans la boîte &quot;Fluorescence&quot;les valeurs de fluorescence ont indiqué que les unités de fluorescence (FU), car ils peuvent être lus à partir du logiciel bioanalyser. Insérez les 4 (3) pics avec la plus haute fluorescence dans l&#39;ordre croissant et séparés par des virgules. Exemple: 126130132137. NOTE: Si tous ces pics FU sont indiqués par le logiciel Bioanalyseur, ils doivent être estimés en les lisant à partir de la parcelle. </li></ol></li><li> Appuyez sur le bouton «Calculer». Un pic est pertinent si la fluorescence observée dépasse la valeur indiquée dans la case «hauteur du pic Minimal&quot;. </li><li> Déduire le génotype. <ol><li> Insérer dans les textbox Mahal &quot;Peaks d&#39;entrée (pb)&quot; les tailles pb de tous les pics pertinents dans l&#39;ordre croissant et séparés par des virgules. Exemple: 440.462.519.579.637. NOTE: Si toutes ces dimensions maximales sont indiquées par le logiciel Bioanalyseur, ils doivent être estimés en les lisant à partir de la parcelle. </li></ol></li><li> Appuyez sur le bouton «Calculer». </li><li> Dans la listeboîte, chercher le minimum carré Mahalanobis distance &quot;D2M&quot;. Si la valeur de P droit correspondant à il est ≥0.05 alors la probabilité est ≥5% que l&#39;hypothèse nulle H 0 est rejetée (H 0: l&#39;observé et le profil de référence sont identiques) ce qui signifie que le profil observé est accepté d&#39;être identique à le profil de référence du génotype indiqué. </li><li> Si D2M est minime , mais le champ de la valeur P correspondant est vide, rejeter H 0 avec une probabilité &lt;5%. NOTE: Cela signifie que les profils sont inégaux bien D2M est minime. Un tel résultat peut résulter de conditions d&#39;électrophorèse non-moyenne. <ol><li> Pour corriger ces écarts, insérer dans la zone de texte &quot;Observé Peak (pb)&quot; la valeur 395 et appuyez sur le bouton &quot;Calculer&quot;. Vérifiez à nouveau pour D2M minimale et une ≥0.05 P de valeur correspondant. En cas d&#39;échec, essayez les valeurs 405, 415, et 425. REMARQUE: Parfois, les petites étapes sont encoreindiqué. Si toujours pas réussi, le profil observé est pas présent dans les données de référence, il peut être un nouveau génotype ou variante. </li></ol></li><li> Divers Profils <ol><li> Répéter les étapes 05.06 à 05.09 pour chaque profil d&#39;électrophorèse séparément. </li></ol></li></ol>

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	<li>Sears, P. M., McCarthy, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Management+and+treatment+of+staphylococcal+mastitis.">Management and treatment of staphylococcal mastitis.</a> Vet.Clin.North Am.Food Anim.Pract. 19 (1), 171-185 (2003).</li><li>Fournier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bovine+Staphylococcus+aureus:+association+of+virulence+genes,+genotypes+and+clinical+outcome.">Bovine Staphylococcus aureus: association of virulence genes, genotypes and clinical outcome.</a> Res.Vet.Sci. 85 (3), 439-448 (2008).</li><li>Cosandey, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcus+aureus+genotype+B+and+other+genotypes+isolated+from+cow+milk+in+European+countries.">Staphylococcus aureus genotype B and other genotypes isolated from cow milk in European countries.</a> J.Dairy Sci. 99 (1), 529-540 (2016).</li><li>Boss, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bovine+Staphylococcus+aureus:+Subtyping,+evolution,+and+zoonotic+transfer.">Bovine Staphylococcus aureus: Subtyping, evolution, and zoonotic transfer.</a> J.Dairy Sci. 99 (1), 515-528 (2016).</li><li>Graber, H. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mastitis-related+subtypes+of+bovine+Staphylococcus+aureus+are+characterized+by+different+clinical+properties.">Mastitis-related subtypes of bovine Staphylococcus aureus are characterized by different clinical properties.</a> J.Dairy Sci. 92 (4), 1442-1451 (2009).</li><li>Heiniger, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kosten-Nutzen-Analyse+einer+Intervention+zur+Verbesserung+der+Eutergesundheit+in+Schweizer+Milchviehbetrieben.">Kosten-Nutzen-Analyse einer Intervention zur Verbesserung der Eutergesundheit in Schweizer Milchviehbetrieben.</a> Schweiz.Arch.Tierheilkd. 156 (10), 473-481 (2014).</li><li>Hamann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Definition+of+the+physiological+cell+count+threshold+based+on+changes+in+milk+composition.">Definition of the physiological cell count threshold based on changes in milk composition.</a> IDF Mastitis Newsletter. 25, 9-12 (2003).</li><li>Hwang, S. Y., Park, Y. K., Koo, H. C., Park, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=spa+typing+and+enterotoxin+gene+profile+of+Staphylococcus+aureus+isolated+from+bovine+raw+milk+in+Korea.">spa typing and enterotoxin gene profile of Staphylococcus aureus isolated from bovine raw milk in Korea.</a> J.Vet.Sci. 11 (2), 125-131 (2010).</li><li>Sakwinska, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Link+between+genotype+and+antimicrobial+resistance+in+bovine+mastitis-related+Staphylococcus+aureus+strains,+determined+by+comparing+Swiss+and+French+isolates+from+the+Rhone+Valley.">Link between genotype and antimicrobial resistance in bovine mastitis-related Staphylococcus aureus strains, determined by comparing Swiss and French isolates from the Rhone Valley.</a> Appl.Environ.Microbiol. 77 (10), 3428-3432 (2011).</li><li>Rabello, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilocus+sequence+typing+of+Staphylococcus+aureus+isolates+recovered+from+cows+with+mastitis+in+Brazilian+dairy+herds.">Multilocus sequence typing of Staphylococcus aureus isolates recovered from cows with mastitis in Brazilian dairy herds.</a> J.Med.Microbiol. 56, 1505-1511 (2007).</li><li>Tavakol, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bovine-associated+MRSA+ST398+in+the+Netherlands.">Bovine-associated MRSA ST398 in the Netherlands.</a> Acta Vet.Scand. 54, 28 (2012).</li><li>Harmsen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Typing+of+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus+in+a+university+hospital+setting+by+using+novel+software+for+spa+repeat+determination+and+database+management.">Typing of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in a university hospital setting by using novel software for spa repeat determination and database management.</a> J.Clin.Microbiol. 41 (12), 5442-5448 (2003).</li><li>Zadoks, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+pulsed-field+gel+electrophoresis+and+binary+typing+as+tools+in+veterinary+clinical+microbiology+and+molecular+epidemiologic+analysis+of+bovine+and+human+Staphylococcus+aureus+isolates.">Application of pulsed-field gel electrophoresis and binary typing as tools in veterinary clinical microbiology and molecular epidemiologic analysis of bovine and human Staphylococcus aureus isolates.</a> J.Clin.Microbiol. 38 (5), 1931-1939 (2000).</li><li>Cremonesi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+characteristics+of+Staphylococcus+aureus+strains+associated+with+high+within-herd+prevalence+of+intramammary+infections+in+dairy+cows.">Genomic characteristics of Staphylococcus aureus strains associated with high within-herd prevalence of intramammary infections in dairy cows.</a> J.Dairy Sci. 98 (10), 6828-6838 (2015).</li><li>Enright, M. C., Day, N. P., Davies, C. E., Peacock, S. J., Spratt, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilocus+sequence+typing+for+characterization+of+methicillin-resistant+and+methicillin-susceptible+clones+of+Staphylococcus+aureus.">Multilocus sequence typing for characterization of methicillin-resistant and methicillin-susceptible clones of Staphylococcus aureus.</a> J.Clin.Microbiol. 38 (3), 1008-1015 (2000).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

L&#39;étape la plus critique de toute la procédure est quand il y a un excès d&#39;ADN dans RS-PCR (&gt; 30 ng pur ADN / dosage) 2. En général, la résolution d&#39;un profil est optimale si tous ses sommets commencent et se terminent à la ligne de base. Si deux pics sont trop rapprochés, la résolution est incomplète. Dans ces conditions, le logiciel peut conduire à bioanalyser inappropriée identification des pics de telle sorte que l&#39;identification manuelle est nécessaire. Tous les pics visiblement séparés et pertinents exprimés en pb ou FU sont incluses pour d&#39;autres analyses. ADN matrice Trop pour RS-PCR se traduit par des pics larges et donc à pic résolution chevauchement et une altération des pics. En outre, la migration est le plus important ralentissement au pic des tailles qui sont faussement augmenté de sorte que le génotype ne peut plus être déduite. Enfin, le nombre de pics pertinents est plus grand. Pour les profils de plus de 3 pics, le pic de fluorescence maximale ne devrait pas dépasser 150 FU. Génotypage par RS-PCR comme décrit est limitée par le fait que l&#39;investissement dans les machines est nécessaire et le logiciel libre Mahal est nécessaire. En effet, une machine standard de PCR et le bioanalyseur sont nécessaires. Le premier est plutôt pas cher de nos jours, alors que le second est plus cher. La résolution de l&#39;électrophorèse à base d&#39;agarose ne suffit pas, même si haute résolution agarose est utilisé. Dans ces conditions, il est seulement possible de faire la distinction entre GTB, GTC, et tous les autres génotypes. Les coûts pour l&#39;électrophorèse en utilisant le kit MED ou une électrophorèse sur agarose, cependant, sont similaires. Le kit MED avec le Bioanalyseur plus performant que l&#39;électrophorèse agarose standard dans une manière que cette dernière méthode est pratique, simple, et les données obtenues est présent sous forme électronique qui simplifie le stockage et une analyse plus poussée considérablement. Principalement tous les bioanalyzers disponibles dans le commerce sont appropriés pour ce type d&#39;analyse à condition que le electrophoretrésolution ic est adéquate et la taille obtenue des bandes est exacte et impartiale. La résolution de RS-PCR pour les souches bovines de S. aureus est élevé. Il est aussi bon que spa dactylographie, et mieux que MLST et ECP 4,14. En outre, par rapport à toutes les autres méthodes de typage couramment utilisés pour le sous - typage S. aureus (spa dactylographie, MLST, ECP), son débit d&#39;échantillons est élevé: l&#39; extraction d&#39;ADN est facile et rapide, 96 échantillons peuvent être traités en un seul passage RCR (normalement O / N) et l&#39; électrophorèse et le génotype inférant est simple. L&#39;analyse complète des 96 échantillons nécessite une nuit pour la PCR et un jour pour l&#39;électrophorèse et l&#39;évaluation. D&#39; autres avantages de RS-PCR par Fournier et al. 2 sont les faibles coûts, en particulier par rapport à MLST qui nécessite sept gènes à séquencés dans les deux directions 15. En outre, RS-PCR est la seule méthode prédire contagiosité et la pathogénicité des souches deS. aureus impliqués dans la mammite bovine 2,5, prédicteurs clés en médecine vétérinaire clinique. Enfin, RS-PCR seul est suffisant pour étudier l&#39;épidémiologie de S. bovine aureus 3,4,5,14. L&#39; interprétation des données est simple , même dans un contexte international en tant que quelques génotypes majeurs sont observés 2,3. Pour les comparaisons épidémiologiques entre les bovins et les souches humaines, RS-PCR et le spa typage ensemble sont préférables car cette dernière méthode est largement utilisée pour le typage des souches humaines de sorte que beaucoup de données sont disponibles. MLST, cependant, est apte à évaluer la clonalité des souches 15 et pour les analyses phylogénétiques 4. Pour le dépannage concernant le cycleur PCR, kit MED et le Bioanalyseur, les manuels correspondants doivent être consultés. Dans le cas de la méthode RS-PCR, le dépannage est massivement simplifiée si les contrôles de PCR positifs et négatifs appropriés sont included dans chaque série. Si le contrôle positif est négatif, le mélange de PCR n&#39;a pas été composé de manière adéquate et / ou l&#39;ADN de contrôle a été dégradé. Si le contrôle négatif (H 2 O) a généré une ou plusieurs bandes, le mélange de PCR a été contaminé par un peu d&#39; ADN. Dans les deux cas, les profils ne doivent pas être interprétées et RS-PCR doit être répétée. Si l&#39;interprétation est impossible en raison d&#39;un problème électrophorétique, électrophorèse doit être répété en utilisant une nouvelle puce. problèmes électrophorétiques sont normalement caractérisés par la migration inadéquate et l&#39;alignement de l&#39;un ou les deux bandes de marqueur résultant de chargement inapproprié et la manipulation de la puce. Si le profil d&#39;électrophorèse obtenu ne peut pas être interprété par le logiciel Mahal, le fichier de profil généré par le logiciel de Bioanalyseur est envoyé à l&#39;auteur pour une évaluation plus poussée. Normalement, l&#39;ADN matrice trop a été utilisé pour RS-PCR ou le profil représente un nouveau génotype ou variant génotypique.

Staphylocoques (S. aureus) est connu comme le pathogène le plus important dans le monde responsable de l&#39; infection intra - mammaire (IMI) chez les bovins 1. L&#39;étude menée par Fournier et al. 2 démontré chez les vaches suisses, les études réalisées par Cosandey et al. 3 et Boss et al. 4 vaches de 12 pays européens que S. aureus isolé de bovin IMI est un groupe génétiquement hétérogène. Par amplification par PCR de la région d&#39;espaceur intergénique 16S-23S ARNr (RS-PCR), un total de 17 génotypes ont été initialement détecté dans 101 isolats épidémiologiquement indépendants 2. Génotype B et le génotype C (GTC) étaient les plus fréquentes (80%), tandis que les 15 autres génotypes (SMT) se sont produits rarement, chaque prise de 1 à 4% de tous les isolats. Au niveau européen 3, GTB, GTC, GTF, GTI et GTR étaient les génotypes les plus importants , comprenant 76% de toutes les souches analysées (n = 456). GTB était situé en Europe centrale wconsidérant que les autres génotypes ont été largement diffusés. Les 24% restants des souches inclus 41 génotypes, beaucoup d&#39;entre eux, cependant, ont été observés une seule fois. Les études menées par Fournier et al. 2, Cosandey et al. 3, et Graber et al. 5 ont démontré en outre que les génotypes étaient fortement associés à leur modèle de gène de virulence, ainsi que le suisse au niveau européen. Les autres études ont révélé des différences massives dans la prévalence IMI chez S. aureus GTB, GTC et les autres génotypes 2,5: compte tenu de GTB, jusqu&#39;à 87% des vaches dans un troupeau ont été infectées par ce génotype. Dans le cas du GTC et des autres génotypes, cependant, l&#39;IMI a été trouvé que dans 1 à 2 vaches d&#39;un troupeau. IMI causée par S. aureus, se traduit normalement par une inflammation des glandes mammaires correspondant et une augmentation des cellules inflammatoires dans le lait. En conséquence, la coopération de cellules somatiquesunts dans le lait (SCC), l&#39;indicateur clé de la qualité du lait dans la plupart des pays, est augmenté conduisant à un prix du lait a diminué ou même l&#39;arrêt de la livraison. En plus de l&#39;interface RS-PCR de Fournier et al. 2, d&#39; autres méthodes de typage ont été décrites pour le sous - typage des souches bovines de S. aureus 8-11. Deux plus communs comprennent le typage spa 12 et Multi Locus Sequence Typing (MLST) 13. L&#39;ancien est basée sur le séquençage d&#39; ADN de la région d&#39;espacement variable du gène codant spa pour la protéine A staphylococcique, alors que celui - ci nécessite une séquencement de 7 gènes de ménage. Cela signifie qu&#39;un 12 et 13 sept PCR, respectivement, doivent être réalisées, suivies d&#39; une purification de l&#39; amplicon, une réaction de séquençage et l&#39; analyse en utilisant un équipement spécifique. Par rapport à RS-PCR, ces méthodes nécessitent un effort supplémentaire considérable dans le laboratoire résultant en un débit d&#39;échantillons faibles et des coûts élevés. lele débit est particulièrement faible pour les ECP. Compte tenu de la résolution de ces méthodes pour les souches bovines de S. aureus, RS-PCR est au moins aussi bon que spa tapant 4 et mieux que MLST 4 ou ECP 15. Toutes ces méthodes , y compris la dactylographie binaire 13 ont démontré leur efficacité dans l&#39; obtention d&#39; un éclairage supplémentaire sur la pathogenèse de bovins IMI causée par S. aureus, mais à cause des restrictions mentionnées ils sont moins appropriés pour les grandes investigations cliniques. En outre, le génotypage par RS-PCR comme décrit par Fournier et al. 2 permet la prédiction fiable de l&#39;épidémiologie et le potentiel pathogène de S. aureus impliqué dans l&#39; IMI bovine, deux valeurs clés de la médecine vétérinaire clinique.

<table><tbody><tr><td>Tris(hydroxymethyl)-aminomethan</td><td>Merck</td><td>1.08382.0500</td><td>Mw = 121.14 g/mol</td></tr><tr><td>Titriplex III</td><td>Merck</td><td>1.08418.0250</td><td>Mw = 372.24 g/mol; Substance is equivalent to Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;EDTA&amp;middot;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>Hydrochloric acid 5 mol/L</td><td>Merck</td><td>1.09911.0001</td><td></td></tr><tr><td>Columbia agar+5% sheep blood</td><td>bioM&amp;eacute;rieux</td><td>43049</td><td></td></tr><tr><td>Agilent DNA7500 Kit</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1504</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2940CA</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 2100 expert sofware</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HotStarTaq master mix&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>203445</td><td></td></tr><tr><td>Primer L1</td><td>Mycrosinth</td><td></td><td>5&#039;CAA GGC ATC CAC CGT3&#039;</td></tr><tr><td>Primer G1</td><td>Mycrosinth</td><td></td><td>5&#039;GAA GTC GTA ACA AGG3&#039;</td></tr></tbody></table>

genotyping of staphylococcus aureus by ribosomal spacer pcr (rs-pcr)

The ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is a highly resolving and robust genotyping method for S. aureus that allows a high throughput at moderate costs and is, therefore, suitable to be used for routine purposes. For best resolution, data evaluation and data management, a miniaturized electrophoresis system is required. Together with such an electrophoresis system and the in-house developed software (freely available here) assignment of the pattern of bands to a genotype is standardized and straight forward. DNA extraction is simple (boiling prep), setting-up of the reactions is easy and they can be run on any standard PCR machine. PCR cycling is common except prolonged ramping and elongation times. Compared to spa typing and Multi Locus Sequence Typing (MLST), RS-PCR does not require DNA sequencing what simplifies the analysis considerably and allows a high throughput. Furthermore, the resolution for bovine strains of S. aureus is at least as good as spa typing and better than MLST or pulsed-field gel electrophoresis (PFGE). The RS-PCR data base includes presently a total of 141 genotypes and variants. The method is highly associated with the virulence gene pattern, contagiosity and pathogenicity of S. aureus strains involved in bovine mastitis. S. aureus genotype B (GTB) is contagious and causes herds problems causing large costs in the Switzerland and other European countries. All the other genotypes observed in Switzerland infect individual cows and quarters. Genotyping by RS-PCR allows the reliable prediction of the epidemiological and the pathogenic potential of S. aureus involved in bovine intramammary infection (IMI), two key factors for clinical veterinary medicine. Because of these beneficial properties together with moderate costs and a high sample throughput the goal of this publication is to give a detailed, step-by-step protocol for easily establishing and running RS-PCR for genotyping S. aureus in other laboratories.

Définition d&#39;un génotype et ses variants Un profil électrophorétique différent dans plus d&#39;une bande de tous les génotypes identifiés est considéré comme un nouveau génotype. Les nouveaux génotypes sont nommés et étendus selon Fournier et al. 5 conduisant à des génotypes de la RGT à la GTZ, suivis par les génotypes GTAA à GTAZ et GTBA à GTBZ et GTCA à GTCC à l&#39; heure actuelle. Variation en un groupe est considéré comme une variante génotypique. Il est indiqué en chiffres romains en exposant après le nom du génotype (par exemple, GTRI, GTRII). Au total, il existe actuellement 141 génotypes et variantes dans la base de données de référence. Dans les conditions décrites ci - dessus, RS-PCR par Fournier et al. 5 est hautement reproductible au génotype des souches de S. aureus. L&#39;identification définitive d&#39;ungénotype ou variante connue est toujours possible si les problèmes techniques peuvent être exclus. Un résultat typique est présenté à la figure 1 montrant l&#39;électrophorèse sur 12 produits RS-PCR et présenté dans le mode de gel de pseudo par le logiciel de bioanalyser. Chaque voie est caractérisée par un motif de deux ou plusieurs bandes de PCR et d&#39;une bande de marquage en avant et une bande de marqueur à la fin. Un double-clic dans une ruelle ouvre le profil électrophorétique correspondant, effectivement mesuré dans une fenêtre séparée. Le logiciel Bioanalyseur permet, entre autres possibilités, les pics observés en cours de lecture que la taille en unités fluorescentes FU (Figure 2) ou en pb (figure 3) dans lequel un pic correspond exactement à une bande dans le mode pseudo-gel. Lecture Peak FU est nécessaire pour évaluer les pics pertinents d&#39;un profil dans le logiciel Mahal (figure 4), la lecture en pb pour inférer le génotype. pics Irrelevant sont définis dans le logiciel Mahal comme petit poisks dont la fluorescence observée FU est inférieure à 40% de la moyenne géométrique des 4 (3) avec des pics de fluorescence la plus élevée. Ils sont normalement observés lorsqu&#39;il y a un excès d&#39;ADN RS-PCR (&gt; 30 ng de l&#39; ADN pur / dosage) 2. A titre d&#39;exemple, le génotype de l&#39; échantillon 211 présente sur la figure 1 est déduite. L&#39; analyse visuelle du profil électrophorétique sur la figure 2 (logiciel bioanalyser) et l&#39; analyse avec le logiciel Mahal utilisant l&#39;outil pour tester les pics pertinents ont révélé 6 pics pertinents ayant des dimensions maximales de 395 pb, 432 pb, 453 pb, 505 pb, 567 pb, et 622 pb (figure 3). Ces valeurs sont remplis et séparés par des virgules dans le champ &quot;Peaks d&#39;entrée (pb)&quot; du logiciel Mahal (Figure 4). Pour corriger les écarts spécifiques à exécution, la valeur 415 a été inséré dans la zone de texte &quot;Observé Peak (pb)&quot; (Figure 4). Après avoir appuyé sur le &quot;Cbouton alculez &quot;, une liste est présentée ordonnée par le génotype avec le Mahalanobis D2M de distance au carré entre le profil génotypique demandées et indiquées. Faites défiler la liste à la recherche de D2M minimal. Dans le cas présent, D2M minimale est égale à 4.499 (Figure 4) une valeur de P ≥0.05, ce qui signifie que le profil demandées ne diffère pas sensiblement de celle du GTB. Des variantes de génotypes sont indiqués comme _I à _XV dans le logiciel Mahal. Dans le cas du génotype B, il existe trois variantes GBT I, GBT II et III GBT indiqué comme b_i, B_II et B_III dans le logiciel (Figure 4). Une puce de la trousse MED permet aux produits d&#39;analyse de 12 RS-PCR à la fois. Si moins de produits sont disponibles, les puits restants doivent être chargés avec de l&#39;eau déminéralisée. Les résultats peuvent être interprétés si les contrôles iNCLUS RS-PCR sont appropriés. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/54623/54623fig1.jpg" /> Figure 1. Pseudo-gel représentant 12 produits RS-PCR et leurs génotypes inférées. Douze souches différentes de S. aureus ont été analysés par RS-PCR en utilisant le kit MED conjointement avec un Bioanalyseur et le logiciel inclus. La voie sur le côté gauche montre le marqueur ou «échelle» pour la taille étalonnage du système en pb. Sur le haut des graphiques, les noms des échantillons et les génotypes correspondants sont inculpés qui ont été obtenus par le logiciel Mahal. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54623/54623fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/54623/54623fig2.jpg" /> Figure 2. profil électrophorétique de sample 161 présente sur la figure 1. En plus des pics de la fluorescence mesurée est indiquée dans le FU. Pics visuellement distinguables qui ne sont pas détectés par la nécessité d&#39; un logiciel de Bioanalyseur à estimer en les lisant à partir de l&#39;intrigue comme effectué pour le pic avec une valeur de fluorescence estimée de 113 FU (en bleu). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54623/54623fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/54623/54623fig3.jpg" /> Figure 3. Le profil électrophorétique de l&#39; échantillon 211 présente dans la figure 1. En plus des pics de leur taille est indiquée en pb. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54623/54623fig3large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 4" src = &quot;/ files / ftp_upload / 54623 / 54623fig4.jpg&quot; /&gt; Figure 4. Capture d&#39; écran du logiciel Mahal. Dans la zone de texte &quot;Peaks d&#39;entrée (pb)&quot; les tailles de pointe de l&#39; échantillon 211 de la figure 3 sont remplis. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54623/54623fig4large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

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Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR RS-PCR

Here, ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is used together with a miniaturized electrophoresis system as a fast and high resolution method for genotyping S. aureus at moderate costs allowing a high throughput.

génotypage des<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; par Ribosomal Spacer PCR (RS-PCR)

The ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is a highly resolving and robust genotyping method for S. aureus that allows a high throughput at moderate costs and is, ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR (RS-PCR)

9.6K vues.  Agroscope. Here, ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is used together with a miniaturized electrophoresis system as a fast and high resolution method for genotyping S. aureus at moderate costs allowing a high throughput.

Vidéo: Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR RS-PCR

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in which the gene of interest has been disrupted. A gene-disruption DNA construct containing a suitable antibiotic resistance marker gene is useful for the generation of gene-disrupted strains in bacteria. However, conventional construction methods, which require gene cloning steps, involve complex and time-consuming protocols. Here, a relatively facile, rapid, and cost-effective method for targeted gene disruption in Streptococcus mutans is described. The method utilizes a 2-step fusion polymerase chain reaction (PCR) to generate the disruption construct and electroporation for genetic transformation. This method does not require an enzymatic reaction, other than PCR, and additionally offers greater flexibility in terms of the design of the disruption construct. Employment of electroporation facilitates the preparation of competent cells and improves the transformation efficiency. The present method may be adapted for the generation of gene-disrupted strains of various species.

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

We describe a facile, rapid, and relatively inexpensive method for the generation of gene-disrupted Streptococcus mutans strains; this technique may be adapted for the generation of gene-disrupted strains of various species.

Génération d’un gène-perturbé Streptococcus mutans souche sans gène clonage

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in ...

Recherche

Génétique

One-day Workflow Scheme for Bacterial Pathogen Detection and Antimicrobial Resistance Testing from Blood Cultures

Bloodstream infections are associated with high mortality rates because of the probable manifestation of sepsis, severe sepsis and septic shock1. Therefore, rapid administration of adequate antibiotic therapy is of foremost importance in the treatment of bloodstream infections. The critical element in this process is timing, heavily dependent on the results of bacterial identification and antibiotic susceptibility testing. Both of these parameters are routinely obtained by culture-based testing, which is time-consuming and takes on average 24-48 hours2, 4. The aim of the study was to develop DNA-based assays for rapid identification of bloodstream infections, as well as rapid antimicrobial susceptibility testing. The first assay is a eubacterial 16S rDNA-based real-time PCR assay complemented with species- or genus-specific probes5. Using these probes, Gram-negative bacteria including Pseudomonas spp., Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli as well as Gram-positive bacteria including Staphylococcus spp., Staphylococcus aureus, Enterococcus spp., Streptococcus spp., and Streptococcus pneumoniae could be distinguished. Using this multiprobe assay, a first identification of the causative micro-organism was given after 2 h.
Secondly, we developed a semi-molecular assay for antibiotic susceptibility testing of S. aureus, Enterococcus spp. and (facultative) aerobe Gram-negative rods6. This assay was based on a study in which PCR was used to measure the growth of bacteria7. Bacteria harvested directly from blood cultures are incubated for 6 h with a selection of antibiotics, and following a Sybr Green-based real-time PCR assay determines inhibition of growth. The combination of these two methods could direct the choice of a suitable antibiotic therapy on the same day (Figure 1). In conclusion, molecular analysis of both identification and antibiotic susceptibility offers a faster alternative for pathogen detection and could improve the diagnosis of bloodstream infections.

The design of a straightforward one-day workflow scheme for bacterial pathogen diagnostics enables the rapid recognition of bloodstream infections. The inclusion of eight clinically relevant bacterial targets and their antibiotic resistance profiles offers the clinician an initial insight on the same day, which can lead to more adequate therapy.

Schéma de flux de travail d&#39;une journée pour la détection de pathogènes et des bactéries tests de résistance antimicrobienne à partir d&#39;hémocultures

Bloodstream infections are associated with high mortality rates because of the probable manifestation of sepsis, severe sepsis and septic shock1. ...

Immunologie et infection

Biosensor for Detection of Antibiotic Resistant Staphylococcus Bacteria

A structurally transformed lytic bacteriophage having a broad host range of Staphylococcus aureus strains and a penicillin-binding protein (PBP 2a) antibody conjugated latex beads have been utilized to create a biosensor designed for discrimination of methicillin resistant (MRSA) and sensitive (MSSA) S. aureus species 1,2. The lytic phages have been converted into phage spheroids by contact with water-chloroform interface. Phage spheroid monolayers have been moved onto a biosensor surface by Langmuir-Blodgett (LB) technique 3. The created biosensors have been examined by a quartz crystal microbalance with dissipation tracking (QCM-D) to evaluate bacteria-phage interactions. Bacteria-spheroid interactions led to reduced resonance frequency and a rise in dissipation energy for both MRSA and MSSA strains. After the bacterial binding, these sensors have been further exposed to the penicillin-binding protein antibody latex beads. Sensors analyzed with MRSA responded to PBP 2a antibody beads; although sensors inspected with MSSA gave no response. This experimental distinction determines an unambiguous discrimination between methicillin resistant and sensitive S. aureus strains. Equally bound and unbound bacteriophages suppress bacterial growth on surfaces and in water suspensions. Once lytic phages are changed into spheroids, they retain their strong lytic activity and show high bacterial capture capability. The phage and phage spheroids can be utilized for testing and sterilization of antibiotic resistant microorganisms. Other applications may include use in bacteriophage therapy and antimicrobial surfaces.

Lytic phage biosensors and antibody beads are able to discriminate between methicillin resistant (MRSA) and sensitive staphylococcus bacteria. The phages were immobilized by a Langmuir-Blodgett method onto a surface of a quartz crystal microbalance sensor and worked as broad range staphylococcus probes. Antibody beads recognize MRSA.

Biocapteurs pour la détection de bactéries aux antibiotiques de staphylocoques résistants

A structurally transformed lytic bacteriophage having a broad host range of Staphylococcus aureus strains and a penicillin-binding protein (PBP 2a) ...

Bio-ingénierie

Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec) typing is a very important molecular tool for understanding the epidemiology and clonal strain relatedness of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA), particularly with the emerging outbreaks of community-associated MRSA (CA-MRSA) occurring on a worldwide basis. Traditional PCR typing schemes classify SCCmec by targeting and identifying the individual mec and ccr gene complex types, but require the use of many primer sets and multiple individual PCR experiments. We designed and published a simple multiplex PCR assay for quick-screening of major SCCmec types and subtypes I to V, and later updated it as new sequence information became available. This simple assay targets individual SCCmec types in a single reaction, is easy to interpret and has been extensively used worldwide. However, due to the sophisticated nature of the assay and the large number of primers present in the reaction, there is the potential for difficulties while adapting this assay to individual laboratories. To facilitate the process of establishing a MRSA SCCmec assay, here we demonstrate how to set up our multiplex PCR assay, and discuss some of the vital steps and procedural nuances that make it successful.

Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

We demonstrate a simple multiplex PCR assay for quick-screening and typing of Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec) types I-V for methicillin-resistant Staphylococcus aureus, and provide some of the vital steps and procedural nuances that make it successful for adapting this assay to individual laboratories.

PCR multiplex pour le typage des staphylocoques Cassette Chromosome Mec types I 

Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec) typing  is a very important molecular tool for understanding the epidemiology and  clonal strain ...

MS2-Affinity Purification Coupled with RNA Sequencing in Gram-Positive Bacteria

Although small regulatory RNAs (sRNAs) are widespread among the bacterial domain of life, the functions of many of them remain poorly characterized notably due to the difficulty of identifying their mRNA targets. Here, we described a modified protocol of the MS2-Affinity Purification coupled with RNA Sequencing (MAPS) technology, aiming to reveal all RNA partners of a specific sRNA in vivo. Broadly, the MS2 aptamer is fused to the 5&#8217; extremity of the sRNA of interest. This construct is then expressed in vivo, allowing the MS2-sRNA to interact with its cellular partners. After bacterial harvesting, cells are mechanically lysed. The crude extract is loaded into an amylose-based chromatography column previously coated with the MS2 protein fused to the maltose binding protein. This enables the specific capture of MS2-sRNA and interacting RNAs. After elution, co-purified RNAs are identified by high-throughput RNA sequencing and subsequent bioinformatic analysis. The following protocol has been implemented in the Gram-positive human pathogen Staphylococcus aureus and is, in principle, transposable to any Gram-positive bacteria. To sum up, MAPS technology constitutes an efficient method to deeply explore the regulatory network of a particular sRNA, offering a snapshot of its whole targetome. However, it is important to keep in mind that putative targets identified by MAPS still need to be validated by complementary experimental approaches.

MAPS technology has been developed to scrutinize the targetome of a specific regulatory RNA in vivo. The sRNA of interest is tagged with a MS2 aptamer enabling the co-purification of its RNA partners and their identification by RNA sequencing. This modified protocol is particularly suited for Gram-positive bacteria.&#160;

Purification par affinité MS2 couplée au séquençage de l’ARN dans les bactéries à Gram positif

Although small regulatory RNAs (sRNAs) are widespread among the bacterial domain of life, the functions of many of them remain poorly characterized ...

Biochimie

Identification of Rare Bacterial Pathogens by 16S rRNA Gene Sequencing and MALDI-TOF MS

There are a number of rare and, therefore, insufficiently described bacterial pathogens which are reported to cause severe infections especially in immunocompromised patients. In most cases only few data, mostly published as case reports, are available which investigate the role of such pathogens as an infectious agent. Therefore, in order to clarify the pathogenic character of such microorganisms, it is necessary to conduct epidemiologic studies which include large numbers of these bacteria. The methods used in such a surveillance study have to meet the following criteria: the identification of the strains has to be accurate according to the valid nomenclature, they should be easy to handle (robustness), economical in routine diagnostics and they have to generate comparable results among different laboratories. Generally, there are three strategies for identifying bacterial strains in a routine setting: 1) phenotypic identification characterizing the biochemical and metabolic properties of the bacteria, 2) molecular techniques such as 16S rRNA gene sequencing and 3) mass spectrometry as a novel proteome based approach. Since mass spectrometry and molecular approaches are the most promising tools for identifying a large variety of bacterial species, these two methods are described. Advances, limitations and potential problems when using these techniques are discussed.

Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) and molecular techniques (16S rRNA gene sequencing) permit the identification of rare bacterial pathogens in routine diagnostics. The goal of this protocol lies in the combination of both techniques which leads to more accurate and reliable data.

Identification des bactéries pathogènes rares par 16S ARNr Gene Séquençage et MALDI-TOF MS

There are a number of rare and, therefore, insufficiently described bacterial pathogens which are reported to cause severe infections especially in ...

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Transposon mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is less time consuming, less costly, and does not require completed genome information, there are two weaknesses in this method: (1) the possibility of a disparate mutants in the mixed mutant library that counter-selects mutants with decreased competition; and (2) the possibility of partial gene inactivation whereby genes do not entirely lose their function following the insertion of a transposon. Single-gene deletion analysis may compensate for the drawbacks associated with transposon mutagenesis. To improve the efficiency of genome-wide single gene deletion, we attempt to establish a high-throughput technique for genome-wide single gene deletion using Streptococcus sanguinis as a model organism. Each gene deletion construct in S. sanguinis genome is designed to comprise 1-kb upstream of the targeted gene, the aphA-3 gene, encoding kanamycin resistance protein, and 1-kb downstream of the targeted gene. Three sets of primers F1/R1, F2/R2, and F3/R3, respectively, are designed and synthesized in a 96-well plate format for PCR-amplifications of those three components of each deletion construct. Primers R1 and F3 contain 25-bp sequences that are complementary to regions of the aphA-3 gene at their 5' end. A large scale PCR amplification of the aphA-3 gene is performed once for creating all single-gene deletion constructs. The promoter of aphA-3 gene is initially excluded to minimize the potential polar effect of kanamycin cassette. To create the gene deletion constructs, high-throughput PCR amplification and purification are performed in a 96-well plate format. A linear recombinant PCR amplicon for each gene deletion will be made up through four PCR reactions using high-fidelity DNA polymerase. The initial exponential growth phase of S. sanguinis cultured in Todd Hewitt broth supplemented with 2.5% inactivated horse serum is used to increase competence for the transformation of PCR-recombinant constructs. Under this condition, up to 20% of S. sanguinis cells can be transformed using ~50 ng of DNA. Based on this approach, 2,048 mutants with single-gene deletion were ultimately obtained from the 2,270 genes in S. sanguinis excluding four gene ORFs contained entirely within other ORFs in S. sanguinis SK36 and 218 potential essential genes. The technique on creating gene deletion constructs is high throughput and could be easy to use in genome-wide single gene deletions for any transformable bacteria.

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

An efficient genome-wide single gene mutation method has been established using Streptococcus sanguinis as a model organism. This method has achieved via high throughput recombinant PCRs and transformations.

La délétion de gènes dans le génome entier<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; Par PCR à haut débit

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

Biologie

Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the long-lasting gold standards is to sequence 16S ribosomal RNA (rRNA) gene amplicons generated by domain-level PCR reactions amplifying from genomic DNA. Traditionally, this was performed by cloning and Sanger (capillary electrophoresis) sequencing of PCR amplicons. The advent of next-generation sequencing has tremendously simplified and increased the sequencing depth for 16S rRNA gene sequencing. The introduction of benchtop sequencers now allows small labs to perform their 16S rRNA sequencing in-house in a matter of days. Here, an approach for 16S rRNA gene amplicon sequencing using a benchtop next-generation sequencer is detailed. The environmental DNA is first amplified by PCR using primers that contain sequencing adapters and barcodes. They are then coupled to spherical particles via emulsion PCR. The particles are loaded on a disposable chip and the chip is inserted in the sequencing machine after which the sequencing is performed. The sequences are retrieved in fastq format, filtered and the barcodes are used to establish the sample membership of the reads. The filtered and binned reads are then further analyzed using publically available tools. An example analysis where the reads were classified with a taxonomy-finding algorithm within the software package Mothur is given. The method outlined here is simple, inexpensive and straightforward and should help smaller labs to take advantage from the ongoing genomic revolution.

Characterizing microbial community has been a longstanding goal in environmental microbiology. Next-generation sequencing methods now allow for the characterization of microbial communities at an unprecedented depth with minimal cost and labor. We detail here our approach to sequence bacterial 16S ribosomal RNA genes using a benchtop sequencer.

La nouvelle génération de séquençage de l&#39;ARN ribosomal 16S gènes amplicons

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the ...

Efficient Nucleic Acid Extraction and 16S rRNA Gene Sequencing for Bacterial Community Characterization

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing technologies have allowed for the rapid and efficient characterization of bacterial communities using 16S rRNA gene sequencing from a variety of sources. Although readily available tools for 16S rRNA sequence analysis have standardized computational workflows, sample processing for DNA extraction remains a continued source of variability across studies. Here we describe an efficient, robust, and cost effective method for extracting nucleic acid from swabs. We also delineate downstream methods for 16S rRNA gene sequencing, including generation of sequencing libraries, data quality control, and sequence analysis. The workflow can accommodate multiple samples types, including stool and swabs collected from a variety of anatomical locations and host species. Additionally, recovered DNA and RNA can be separated and used for other applications, including whole genome sequencing or RNA-seq. The method described allows for a common processing approach for multiple sample types and accommodates downstream analysis of genomic, metagenomic and transcriptional information.

We describe an efficient, robust, and cost effective method for extracting nucleic acid from swabs for characterization of bacterial communities using 16S rRNA gene amplicon sequencing. The method allows for a common processing approach for multiple sample types and accommodates a number of downstream analytic processes.

L&#39;extraction d&#39;acide nucléique et efficace de l&#39;ARNr 16S bactérien pour Séquençage génique communautaire Caractérisation

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing ...

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the immune system. Perturbation of the healthy gut microbiome has been suggested to play a role in the development of inflammatory diseases, including multiple sclerosis (MS). Environmental and genetic factors can influence the composition of the microbiome; therefore, identification of microbial communities linked with a disease phenotype has become the first step towards defining the microbiome&#8217;s role in health and disease. Use of 16S rRNA metagenomic sequencing for profiling bacterial community has helped in advancing microbiome research. Despite its wide use, there is no uniform protocol for 16S rRNA-based taxonomic profiling analysis. Another limitation is the low resolution of taxonomic assignment due to technical difficulties such as smaller sequencing reads, as well as use of only forward (R1) reads in the final analysis due to low quality of reverse (R2) reads. There is need for a simplified method with high resolution to characterize bacterial diversity in a given biospecimen. Advancements in sequencing technology with the ability to sequence longer reads at high resolution have helped to overcome some of these challenges. Present sequencing technology combined with a publicly available metagenomic analysis pipeline such as R-based Divisive Amplicon Denoising Algorithm-2 (DADA2) has helped advance microbial profiling at high resolution, as DADA2 can assign sequence at the genus and species levels. Described here is a guide for performing bacterial profiling using two-step amplification of the V3-V4 region of the 16S rRNA gene, followed by analysis using freely available analysis tools (i.e., DADA2, Phyloseq, and METAGENassist). It is believed that this simple and complete workflow will serve as an excellent tool for researchers interested in performing microbiome profiling studies.

Described here is a simplified standard operating procedure for microbiome profiling using 16S rRNA metagenomic sequencing and analysis using freely available tools. This protocol will help researchers who are new to the microbiome field as well as those requiring updates on methods to achieve bacterial profiling at a higher resolution.

Analyse du microbiote à l'aide de PCR en deux étapes et de la prochaine génération 16S rRNA Gene Sequencing

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...

génotypage des

Résumé

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Chapitres dans cette vidéo

Génération d’un gène-perturbé Streptococcus mutans souche sans gène clonage

Schéma de flux de travail d'une journée pour la détection de pathogènes et des bactéries tests de résistance antimicrobienne à partir d'hémocultures

Biocapteurs pour la détection de bactéries aux antibiotiques de staphylocoques résistants

PCR multiplex pour le typage des staphylocoques Cassette Chromosome Mec types I

Purification par affinité MS2 couplée au séquençage de l’ARN dans les bactéries à Gram positif

Identification des bactéries pathogènes rares par 16S ARNr Gene Séquençage et MALDI-TOF MS

La délétion de gènes dans le génome entier

La nouvelle génération de séquençage de l'ARN ribosomal 16S gènes amplicons

L'extraction d'acide nucléique et efficace de l'ARNr 16S bactérien pour Séquençage génique communautaire Caractérisation

Analyse du microbiote à l'aide de PCR en deux étapes et de la prochaine génération 16S rRNA Gene Sequencing