Name: genotyping of staphylococcus aureus by ribosomal spacer pcr (rs-pcr)
Uploaded: 2016-11-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR RS-PCR at JoVE.com

The author thanks R. Boss, A. Cosandey, C. Fournier, I. Ivanovic, and J. Naskova for their excellent work.

1. Staphylococcus aureus - Isolaten <ol><li> Verbreiten Sie 10 ul S. aureus Stammkultur oder eine Kolonie auf einem selektiven Medium gezüchtet auf Columbia - Agar - Platten , die 5% Schafblut (BA). </li><li> Inkubieren aerob bei 37 ° C für 18 Stunden bis 24 Stunden. </li></ol> 2. DNA-Extraktion <ol><li> Bereiten TEL - Puffer , enthaltend 10 mM Tris-HCl und 10 mM Na 2 EDTA, pH 8,5. Bereiten Aliquots und Autoklaven bei 121 ° C für 15 min. </li><li> Sammeln Sie 1 Kolonie von BA eine sterile Plastikschleife oder einen sterilen Holz Zahnstochers und resuspendieren in 100 &amp; mgr; l TEL verwenden. Verwenden Sie 1,5-ml-Röhrchen mit Schraubverschluss. </li><li> für 10 min bei 95 ° C inkubieren. Danach legen Sie die Proben sofort auf nassem Eis. </li><li> Verdünnen Sie die Proben 1: 100 in H 2 O geeignet für PCR (= Template - DNA für die PCR). Das unverwässerte und verwässerte Proben können für 1 Monat bei -20 ° C aufbewahrt werden. </li></ol> 3. RS-PCR <ol><li&gt; Für jede Probe Pipette in ein PCR - Röhrchen von 1,5 &amp; mgr; l H 2 O, 12,5 &amp; mgr; l Taq Master Mix, 2 &amp; mgr; l G1 Primer 10 uM, 2 &amp; mgr; l L1 Primer 10 uM, und 7 &amp; mgr; l Matrizen - DNA, die zu etwa 30 ng reiner entspricht DNA 2. </li><li> Führen Sie die folgende PCR-Programm in einem Standard-PCR-Cycler: 15 min 95 ° C, gefolgt von 27 Zyklen bestehend aus 94 ° C für 1 min, gefolgt von einer 2 min Rampe und Tempern bei 55 ° C für 7 min. Nach weiteren 2 min Rampe 2 min bei 72 ° C erstrecken. Beenden PCR von einer abschließenden Extension bei 72 ° C für 10 min, gefolgt von Abkühlen auf 4 ° C. HINWEIS: Die PCR-Produkte können für 5 Tage bei -20 ° C gelagert werden. </li><li> Für jeden Lauf von RS-PCR umfassen eine positive Kontrolle, dh eine Probe mit einem bekannten Genotyp (normalerweise GTB) und eine negative Kontrolle (H 2 O). </li></ol> 4. Elektrophorese <ol><li> Verwenden Sie eine kommerzielle miniaturisierten Elektrophorese-Kit für die DNA (MED-Kit) zusammenmit einem Bioanalyzer auf einem PC und der installierten Software verbunden. Studieren Sie die entsprechenden Handbücher des Herstellers sorgfältig durch. </li><li> Stellen Sie den Chip Priming Station und stellen Sie die Spritze Clip entsprechend der Anleitung des Herstellers. </li><li> Bereiten Sie die Gel-Farbstoffmischung nach der Anleitung des Herstellers. </li><li> Laden des Gel-Farbstoff-Mix (gemäß dem Handbuch des Herstellers). <ol><li> Äquilibrieren Sie das Gel-Farbstoff-Mix auf RT für 30 Minuten vor dem Gebrauch. </li><li> Setzen Sie neue DNA-Chip auf dem Chip Priming Station. Pipette 9 ul Gel-Farbstoff in dem gut markierten G. </li><li> Stellen Sie sicher, dass der Kolben in 1 ml positioniert ist, und dann den Chip Priming Station schließen. Drücken Sie Kolben, bis sie von der Spritze Klammer gehalten. Warten Sie genau 30 Sekunden dann die Spritze Clip lösen. </li><li> Warten Sie 5 Sekunden. Ziehen Sie langsam Kolben in 1 ml Position zurück. </li><li> Offene Chip Priming Station und Pipette 9 ul Gel-Farbstoff in beiden Brunnen markiert &#39;G&#39;. </li></ol></li><li> Laden der MArker <ol><li> Pipette 5 ul Marker in allen 12 Probenvertiefungen und in der Leiter gut. Nicht jeder dieser 13 Brunnen leer lassen. </li></ol></li><li> Laden der Leiter und die Proben. <ol><li> Pipette 1 ul DNA-Leiter mit dem gut markierten mit der Leiter zu unterzeichnen. </li><li> Pipette 1 ul Probe (verwendet Vertiefungen) oder 1 &amp; mgr; l VE-Wasser (nicht verwendeten Wells). </li><li> Setzen Sie den Chip horizontal in den Adapter und Vortex für 1 min bei 2.400 Umdrehungen pro Minute. </li><li> Führen Sie den Chip in der Bioanalyzer innerhalb von 5 min. </li></ol></li><li> Durchführung der Analyse <ol><li> Starten Sie den Bioanalyzer und dem angeschlossenen Computer. Öffnen Sie die Software. </li><li> Öffnen Sie den Deckel des Bioanalyzer und platzieren Sie den Chip in den Chiphalter (der Chip passt nur in eine Richtung). Schließen Sie den Deckel vorsichtig. </li><li> Im Instrument Kontext der Software wählen Sie &quot;Elektrophorese&quot;&gt; &quot;dsDNA&quot;&gt; &quot;DNA 7500&quot;. Akzeptieren Sie die aktuelle Datei - Präfix der Software oder zu modifizieren.</li><li> Klicken Sie auf die Start-Taste in der Software. Geben Sie die Beispielnamen in der Software. Wenn der Chip Lauf (nach ca. 30 min) das Ende der Run Meldung erscheint in der Bioanalyzer Software beendet ist. </li><li> Entfernen Sie den Chip und reinigen Sie die Elektroden der Bioanalyzer gemäß den Anweisungen des Herstellers. </li></ol></li></ol> 5. Herleitung des Genotyps von der Elektrophorese Profil <ol><li> Laden Sie die Mahal Software (Software von den Autoren frei verfügbar ist). </li><li> Import von Referenzdaten in die Software Mahal: &quot;Datei&quot;&gt; &quot;Import-Referenzdaten&quot; </li><li> Öffnen Sie die Elektrophorese in der Datenkontext des Bioanalyzer Software. Wählen Sie ein Elektrophorese Profil einer Probe. </li><li> Überprüfen Sie für die entsprechenden Peaks. <ol><li> Verwenden Sie die Mahal Software für die jeweiligen Spitzen zu überprüfen: &quot;Extras&quot;&gt; &quot;Mean Fluoreszenz&quot;. Legen Sie in die &quot;Fluoreszenz&quot; -Boxdie Fluoreszenzwerte als Fluoreszenzeinheiten (FU) bezeichnet, da sie aus dem Bioanalyzer Software ausgelesen werden kann. Legen Sie die 4 (3) Gipfeln mit dem höchsten Fluoreszenz in aufsteigender Reihenfolge und durch Komma getrennt. Beispiel: 126.130.132.137. HINWEIS: Wenn nicht alle diese Spitzen FU durch die Bioanalyzer Software angezeigt werden, müssen sie durch das Lesen sie aus dem Grundstück zu schätzen. </li></ol></li><li> Drücken Sie die Schaltfläche &quot;Berechnen&quot;. Ein Höhepunkt ist dann relevant, wenn die beobachtete Fluoreszenz den Wert im Feld &quot;Minimal Peakhöhe&quot; gegeben überschreitet. </li><li> Infer den Genotyp. <ol><li> Legen Sie in die Textbox Mahal &quot;Input Peaks (bp)&quot; die Größen in bp aller relevanten Peaks in aufsteigender Reihenfolge und durch Komma getrennt. Beispiel: 440.462.519.579.637. HINWEIS: Wenn nicht alle diese Spitzengrößen von der Bioanalyzer Software angezeigt werden, müssen sie durch das Lesen sie aus dem Grundstück zu schätzen. </li></ol></li><li> Drücken Sie die Schaltfläche &quot;Berechnen&quot;. </li><li> In der ListeFeld, suchen Sie nach der minimalen squared Mahalanobisdistanz &quot;d2m&quot;. Wenn der entsprechende Wert P Recht, es ist ≥0.05 dann ist die Wahrscheinlichkeit ≥5% , dass die Null - Hypothese H 0 wird abgelehnt (H 0: die beobachtete und das Bezugsprofil identisch sind) , was bedeutet , daß die beobachtete Profil zu sein wird angenommen , identisch mit das Bezugsprofil des angegebenen Genotyp. </li><li> Wenn d2m minimal ist , aber das Feld des entsprechenden P - Wert ist leer, ablehnen H 0 mit einer Wahrscheinlichkeit &lt;5%. ANMERKUNG: Dies bedeutet, dass die Profilierungen ungleich sind, obwohl d2m minimal ist. Ein solches Ergebnis aus nicht-Durchschnitt Elektrophorese-Bedingungen führen kann. <ol><li> Um diese Abweichungen zu korrigieren, fügen Sie in das Textfeld &quot;Beobachtet Peak (bp)&quot; den Wert 395 ein und drücken Sie die Schaltfläche &quot;Berechnen&quot;. Überprüfen Sie noch einmal für minimale d2m und eine entsprechende P-Wert ≥0.05. Gelingt dies nicht, versuchen Sie die Werte 405, 415 und 425. HINWEIS: Manchmal kleinere Schritte sind auchangegeben. Wenn noch nicht erfolgreich, das beobachtete Profil nicht in der Referenzdaten ist, kann es einen neuen Genotyp oder eine Variante sein. </li></ol></li><li> Verschiedene Profile <ol><li> Wiederholen Sie die Schritte 5,6-5,9 für jede Elektrophorese Profil getrennt. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Der wichtigste Schritt des gesamten Verfahrens ist , wenn ein Überschuß an DNA in RS-PCR ist (&gt; 30 ng reine DNA / assay) 2. Im allgemeinen Auflösung eines Profils ist optimal, wenn alle ihre Spitzen an der Grundlinie beginnen und enden. Wenn zwei Spitzen zu nahe beieinander sind, die Auflösung ist unvollständig. Unter diesen Bedingungen kann die Bioanalyzer Software zu unangemessenen Spitzen Identifizierung führen, so dass die manuelle Identifikation erforderlich ist. Alle sichtbar getrennt und relevanten Peaks als bp oder FU ausgedrückt werden für weitere Analysen einbezogen. Zu viel Templat-DNA für die RS-PCR-Ergebnisse in breiten Peaks und daher überlappend und beeinträchtigter Auflösung der Peaks zu Spitze. Zusätzlich ist die Migration langsamer Führungsgrößen zu Peak, die fälschlicherweise erhöht werden, so dass der Genotyp nicht mehr geschlossen werden kann. Schließlich ist die Anzahl irrelevanter Peaks größer. Für Profile mit mehr als 3 Spitzen, sollte die Spitze mit einer maximalen Fluoreszenz normalerweise nicht mehr als 150 FU. Genotypisierung von RS-PCR, wie beschrieben wird durch die Tatsache, dass die Investitionen in Maschinen notwendig ist, und die freie Mahal-Software erforderlich ist. In der Tat sind eine Standard-PCR-Maschine und die Bioanalyzers benötigt. Ersteres ist eher billig heutzutage während letztere teurer ist. Die Auflösung der Agarose-basierte Elektrophorese reicht nicht aus, auch wenn hochauflösende Agarose verwendet wird. Unter diesen Bedingungen ist es nur möglich, zwischen GTB, GTC und alle anderen Genotypen zu unterscheiden. Die Kosten für die Elektrophorese der MED-Kit oder Agarose-Elektrophorese unter Verwendung sind jedoch ähnlich. Die MED-Kit zusammen mit dem Bioanalyzer trifft weitere Standard-Agarose-Elektrophorese in einer Weise, dass das letztgenannte Verfahren ist praktisch, gerade nach vorne und erhaltenen Daten ist in elektronischer Form, die erheblich die Lagerung und die weitere Analyse vereinfacht. Prinzipiell alle handelsüblichen bioanalyzers sind für diese Art von Analyse geeignet, vorausgesetzt, daß die electrophoretic Auflösung ist ausreichend und die erhaltene Größe der Bänder ist genau und unparteiisch. Die Auflösung von RS-PCR für Rinder-Stämme von S. aureus ist hoch. Es ist so gut wie Spa - Typisierung, und besser als MLST und PFGE 4,14. Zusätzlich, im Vergleich zu allen anderen Typisierungsmethoden üblicherweise für Subtypisierung S. verwendet aureus (Spa - Typisierung, MLST, PFGE), dessen Probendurchsatz ist hoch: DNA - Extraktion ist einfach und schnell, 96 Proben können in einem RCR Lauf ( in der Regel O / N) und Elektrophorese und Genotyp Inferenzabschnitts ist geradlinig weiterverarbeitet werden. Die vollständige Analyse von 96 Proben erfordert eine Nacht für die PCR und eines Tages für die Elektrophorese und Auswertung. Weitere Vorteile der RS-PCR von Fournier et al. 2 sind die niedrigen Kosten, insbesondere wenn sie auf MLST verglichen , die sieben Gene erfordert in beiden Richtungen 15 sequenziert werden. Weiterhin RS-PCR ist die einzige Methode, die Vorhersage Kontagiosität und Pathogenität der Stämme vonS. aureus bei Rindern beteiligt Mastitis 2,5, Schlüssel Prädiktoren in der klinischen Veterinärmedizin. Schließlich allein RS-PCR ist ausreichend , um die Epidemiologie von Rinder S. zu untersuchen aureus 3,4,5,14. Die Interpretation der Daten ist gerade nach vorne , auch im internationalen Kontext als nur wenige große Genotypen 2,3 beobachtet werden. Für epidemiologische Vergleiche zwischen Rinder- und menschlichen Stämme, RS-PCR und Spa - Typisierung zusammen sind vorzuziehen , da die letztere Methode häufig für Subtypisierung menschlichen Stämme verwendet wird , so dass eine Menge von Daten zur Verfügung steht. MLST ist jedoch geeignet , um die Klonalität der Stämme 15 Bewertung und für phylogenetische Analysen 4. Für die Fehlersuche in Bezug auf die PCR-Cycler, MED-Kit und dem Bioanalyzer sind die entsprechenden Handbücher zu konsultieren. Im Falle des RS-PCR-Verfahren vereinfacht wird Fehlerbehebung massiv gegebenenfalls positive und negative PCR-Kontrollen sind incin jedem Lauf luded. Wenn die positive Kontrolle negativ ist, wurde die PCR-Mischung nicht ausreichend zusammengesetzt und / oder die Kontroll-DNA war verschlechtert. Wenn die negative Kontrolle (H 2 O) erzeugt , eine oder mehrere Banden wurde das PCR - Gemisch mit einigen DNA kontaminiert. In beiden Fällen müssen die Profile nicht interpretiert und RS-PCR hat wiederholt werden. Wenn Auslegung aufgrund eines elektrophoretischen Problems nicht möglich ist, muss die Elektrophorese wiederholt werden, um einen neuen Chip. Die elektrophoretische Probleme werden in der Regel durch eine unzureichende Migration und Ausrichtung eines oder beider Markierungsbänder, die aus ungeeigneter Laden und Manipulieren des Chips aus. Wenn das erhaltene Elektrophorese Profil kann nicht durch die Mahal Software interpretiert werden, die Profildatei von der Bioanalyzer Software erzeugt wird zur weiteren Auswertung an den Autor gesendet. Normalerweise zuviel Templat-DNA wurde für RS-PCR verwendet oder das Profil stellt einen neuen Genotyp oder genotypische Variante.

Staphylococcus (S. aureus) als wichtigste Erreger weltweit verantwortlich für die intramammäre Infektion (IMI) bei Rindern 1 bekannt. Die Studie wurde von Fournier et al. 2 in Schweizer Kühe unter Beweis gestellt und die Studien von Cosandey et al. 3 und Boss et al. 4 bei Kühen von 12 europäischen Ländern , dass S. aureus isoliert aus Rinder IMI ist eine genetisch heterogene Gruppe. Durch PCR - Amplifikation des 16S-23S - rRNA intergenischen Spacer - Region (RS-PCR), insgesamt 17 Genotypen wurden zunächst in 101 epidemiologisch unabhängige Isolate 2 detektiert. Genotype B und Genotyp C (AGB) wurden am häufigsten (80%), während die anderen 15 Genotypen (GTs) selten aufgetreten, jeder macht 1 bis 4% aller Isolate. Auf europäischer Ebene 3, GTB, GTC, GTF, GTI und GTR waren die wichtigsten Genotypen 76% aller untersuchten Stämme, die (n = 456). GTB wurde in Mitteleuropa während die anderen Genotypen wurden weit verbreitet. Die restlichen 24% der Stämme enthalten 41 Genotypen, von denen viele, aber nur einmal beobachtet. Die Studien von Fournier et al. 2, Cosandey et al. 3 und Graber et al. 5 weiter gezeigt , dass die Genotypen stark mit ihrer Virulenz - Gen - Muster verbunden waren, sowie an der Schweizer wie auf europäischer Ebene. Die Untersuchungen ergaben , weitere massive Unterschiede in IMI - Prävalenz unter S. aureus GTB, GTC und die anderen Genotypen 2,5: Berücksichtigung GTB, bis zu 87% der Kühe in einer Herde wurden von diesem Genotyp infiziert. Im Falle von GTC und der anderen Genotypen, jedoch wurde IMI nur in 1 bis 2 Kühen einer Herde gefunden. IMI verursacht durch S. aureus, führt normalerweise zu einer Entzündung der entsprechenden Brustdrüsen und einem Anstieg von Entzündungszellen in der Milch. Als Folge co die somatische Zellunts in Milch (SCC), dem Schlüsselindikator für die Milchqualität in den meisten Ländern, erhöht wird, um eine verringerte Milchpreis oder sogar Lieferstopp führt. Neben dem RS-PCR von Fournier et al. 2, haben andere Typisierungsmethoden für Subtypisierung Rinder Stämme von S. beschrieben aureus 11.08. Zwei häufigsten sind Spa - Typisierung 12 und Multi - Locus - Sequenz Typing (MLST) 13. Der erstere wird basierend auf DNA - Sequenzierung der variablen Spacer - Bereich des Staphylokokken - Spa Gen , das für Protein A, während die letztere die Sequenzierung von 7 Housekeeping - Genen erfordert. Dies bedeutet , dass eine 12 bis sieben PCRs 13 jeweils durchgeführt werden müssen, gefolgt von Amplicon Reinigung Sequenzierungsreaktion und Analyse unter Verwendung spezifischer Ausrüstung. Im Vergleich zu RS-PCR, erfordern diese Verfahren einen erheblichen Mehraufwand in der resultierenden Labor in einem geringen Probendurchsatz und hohe Kosten. DasDurchsatz besonders niedrig ist die PFGE. Unter Berücksichtigung der Auflösung dieser Methoden für Rinder Stämme von S. aureus, RS-PCR ist mindestens so gut wie spa Eingabe 4 und besser als MLST 4 oder PFGE 15. Alle diese Methoden auch binäre Typisierung 13 gezeigt , um ihre Wirksamkeit bei der Beschaffung weitere Einblicke in die Pathogenese von Rinder-IMI verursacht durch S. aureus, aber wegen der genannten Einschränkungen sind sie weniger geeignet für große klinische Untersuchungen. Zusätzlich Genotypisierung von RS-PCR wie von Fournier et al. 2 ermöglicht die zuverlässige Vorhersage der epidemiologischen und das pathogene Potential von S. aureus in Rinder-IMI, zwei Schlüsselwerte in der klinischen Veterinärmedizin beteiligt.

<table><tbody><tr><td>Tris(hydroxymethyl)-aminomethan</td><td>Merck</td><td>1.08382.0500</td><td>Mw = 121.14 g/mol</td></tr><tr><td>Titriplex III</td><td>Merck</td><td>1.08418.0250</td><td>Mw = 372.24 g/mol; Substance is equivalent to Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;EDTA&amp;middot;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>Hydrochloric acid 5 mol/L</td><td>Merck</td><td>1.09911.0001</td><td></td></tr><tr><td>Columbia agar+5% sheep blood</td><td>bioM&amp;eacute;rieux</td><td>43049</td><td></td></tr><tr><td>Agilent DNA7500 Kit</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1504</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2940CA</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 2100 expert sofware</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HotStarTaq master mix&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>203445</td><td></td></tr><tr><td>Primer L1</td><td>Mycrosinth</td><td></td><td>5&#039;CAA GGC ATC CAC CGT3&#039;</td></tr><tr><td>Primer G1</td><td>Mycrosinth</td><td></td><td>5&#039;GAA GTC GTA ACA AGG3&#039;</td></tr></tbody></table>

genotyping of staphylococcus aureus by ribosomal spacer pcr (rs-pcr)

The ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is a highly resolving and robust genotyping method for S. aureus that allows a high throughput at moderate costs and is, therefore, suitable to be used for routine purposes. For best resolution, data evaluation and data management, a miniaturized electrophoresis system is required. Together with such an electrophoresis system and the in-house developed software (freely available here) assignment of the pattern of bands to a genotype is standardized and straight forward. DNA extraction is simple (boiling prep), setting-up of the reactions is easy and they can be run on any standard PCR machine. PCR cycling is common except prolonged ramping and elongation times. Compared to spa typing and Multi Locus Sequence Typing (MLST), RS-PCR does not require DNA sequencing what simplifies the analysis considerably and allows a high throughput. Furthermore, the resolution for bovine strains of S. aureus is at least as good as spa typing and better than MLST or pulsed-field gel electrophoresis (PFGE). The RS-PCR data base includes presently a total of 141 genotypes and variants. The method is highly associated with the virulence gene pattern, contagiosity and pathogenicity of S. aureus strains involved in bovine mastitis. S. aureus genotype B (GTB) is contagious and causes herds problems causing large costs in the Switzerland and other European countries. All the other genotypes observed in Switzerland infect individual cows and quarters. Genotyping by RS-PCR allows the reliable prediction of the epidemiological and the pathogenic potential of S. aureus involved in bovine intramammary infection (IMI), two key factors for clinical veterinary medicine. Because of these beneficial properties together with moderate costs and a high sample throughput the goal of this publication is to give a detailed, step-by-step protocol for easily establishing and running RS-PCR for genotyping S. aureus in other laboratories.

Definition eines Genotyp und seine Varianten Eine elektrophoretische Profil in mehr als ein Band aus allen identifizierten Genotypen unterschiedlichen wird als neuer Genotyp betrachtet. Neue Genotypen werden nach Fournier et al genannt und erweitert. 5 mit den Genotypen GTA GTZ führt, die von den Genotypen GTAA zu GTAZ gefolgt, und GTBA zu GTBZ und GTCA zu AVB derzeit. Variation in nur einem Band als genotypische Variante angesehen. Es ist hochgestellt , nach dem Namen des Genotyps (zB GTRI, GTRII) mit römischen Ziffern angegeben. Insgesamt gibt es derzeit 141 Genotypen und Varianten in der Referenzdatenbank. Unter den oben angegebenen Bedingungen, RS-PCR von Fournier et al. 5 ist in hohem Maße reproduzierbar Stämme von S. Genotyp aureus. Definitive Identifizierung einesbekannten Genotyps oder Variante ist immer dann möglich, wenn technische Probleme ausgeschlossen werden können. Ein typisches Ergebnis ist in Abbildung 1 zeigt die Elektrophorese von 12 RS-PCR - Produkte und präsentiert in dem Pseudo - Gel - Modus durch die Bioanalyzer Software dargestellt. Jede Spur wird durch ein Muster von zwei oder mehreren PCR-Banden und einem Markierungsband vor und ein Markierungsband am Ende gekennzeichnet. Ein Doppelklick in eine Gasse öffnet die entsprechenden, tatsächlich gemessene elektrophoretische Profil in einem separaten Fenster. Die Bioanalyzer Software ermöglicht, unter anderen Möglichkeiten, die beobachteten Peaks als Größe wie Fluoreszenzeinheiten FU (Figur 2) oder in bp (3) gelesen wird , wodurch eine Spitze genau einem Band in der pseudo-Gel - Modus entspricht. Spitzenwert in FU wird zur Ableitung des Genotyps für die Auswertung der relevanten Peaks eines Profils in der Mahal Software (Abbildung 4), das Lesen in bp erforderlich. Irrelevant Spitzen sind in der Mahal Software als kleine Erbse definiertks deren beobachtete Fluoreszenz FU unter 40% des geometrischen Mittels der 4 (3) Peaks mit dem höchsten Fluoreszenz. Sie werden üblicherweise beobachtet wird, wenn es einen Überschuss von DNA in RS-PCR (&gt; 30 ng reine DNA / assay) 2. Als Beispiel wird der Genotyp der Probe 211 , die in Abbildung 1 zu entnehmen. Visuelle Analyse des elektrophoretischen Profils in 2 (Bioanalyzer Software) und Analyse mit dem Mahal Software das Werkzeug für irrelevant Peaks zu testen unter Verwendung ergab 6 entsprechenden Peaks mit Spitzengrößen von 395 bp, 432 bp, 453 bp, 505 bp, 567 bp, und 622 bp (Abbildung 3). Diese Werte werden ausgefüllt und durch Komma in der Textbox &quot;Input Peaks (bp)&quot; der Mahal Software (Abbildung 4) getrennt. Zur Korrektur Laufspezifischen Abweichungen wurde der Wert 415 in das Textfeld eingefügt &quot; , beobachtete Peak (bp)&quot; (Abbildung 4). Nach dem &quot;C gedrückt habenalculate &quot;Taste wird eine Liste geordnet präsentiert von Genotyp zusammen mit dem Quadrat Mahalanobisdistanz d2m zwischen dem abgefragt und angezeigt genotypische Profil. in der Liste blättern für minimal d2m suchen. Im vorliegenden Fall minimal d2m ist gleich 4,499 (Abbildung 4) mit ein Wert von P ≥0.05, dass der abgefragte Profil nicht wesentlich von der eines der GTB unterscheidet sich bedeutend. Varianten von Genotypen als _I in der angegebenen Mahal Software _XV. Im Fall von Genotyp B gibt es die drei Varianten GBT I, GBT II und III als GBT B_I angegeben, B_II und B_III in der Software (Abbildung 4). Ein Chip des MED-Kit ermöglicht die Analyse der Erzeugnisse von 12 RS-PCR zu einem Zeitpunkt. Wenn weniger Produkte verfügbar sind, müssen die übrigen Vertiefungen mit entsalztem Wasser geladen werden. Die Ergebnisse können nur dann, wenn die Kontrollen interpretiert werden included in RS-PCR geeignet sind. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54623/54623fig1.jpg" /> Abbildung 1. Pseudo-Gel repräsentieren 12 RS-PCR - Produkte und deren abgeleiteten Genotypen. Zwölf verschiedene Stämme von S. aureus wurden durch RS-PCR unter Verwendung des MED - Kit zusammen mit einem Bioanalyzer und der mitgelieferten Software analysiert. Die Spur auf der linken Seite zeigt den Marker oder &quot;Leiter&quot; für die Größe Kalibrierung des Systems in bp. Auf der Oberseite der Grafik werden die Probennamen und die entsprechenden Genotypen angeklagt, die von der Software Mahal erhalten wurden. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54623/54623fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54623/54623fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54623/54623fig2.jpg" /> Abbildung 2. Die elektrophoretische Profil sample 161 in Abbildung 1. Oben auf den Gipfeln der gemessene Fluoreszenz in FU angedeutet ist. Optisch unterscheiden Spitzen , die nicht von der Bioanalyzer Software Notwendigkeit erkannt wurden durch das Lesen sie vom Grundstück geschätzt werden wie für die Spitze mit einem geschätzten Fluoreszenzwert von 113 FU (in blau) durchgeführt. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54623/54623fig2large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54623/54623fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version davon zu sehen Zahl.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54623/54623fig3.jpg" /> Abbildung 3. Die elektrophoretische Profil der Probe 211 in Abbildung 1. Oben auf dem Gipfel ihrer Größe in bp angegeben. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54623/54623fig3large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54623/54623fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" src = &quot;/ files / ftp_upload / 54623 / 54623fig4.jpg&quot; /&gt; Abbildung 4. Screenshot der Software Mahal. Im Textfeld &quot;Input Peaks (bp)&quot; die Spitzengrößen der Probe 211 aus 3 sind ausgefüllt. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54623/54623fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54623/54623fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR RS-PCR

Here, ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is used together with a miniaturized electrophoresis system as a fast and high resolution method for genotyping S. aureus at moderate costs allowing a high throughput.

Genotypisierung<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Durch ribosomalen Spacer PCR (RS-PCR)

The ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is a highly resolving and robust genotyping method for S. aureus that allows a high throughput at moderate costs and is, ...

genotyping-of-staphylococcus-aureus-by-ribosomal-spacer-pcr-rs-pcr

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR (RS-PCR)

9.6K Aufrufe.  Agroscope. Here, ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is used together with a miniaturized electrophoresis system as a fast and high resolution method for genotyping S. aureus at moderate costs allowing a high throughput.

Serie: Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR RS-PCR

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in which the gene of interest has been disrupted. A gene-disruption DNA construct containing a suitable antibiotic resistance marker gene is useful for the generation of gene-disrupted strains in bacteria. However, conventional construction methods, which require gene cloning steps, involve complex and time-consuming protocols. Here, a relatively facile, rapid, and cost-effective method for targeted gene disruption in Streptococcus mutans is described. The method utilizes a 2-step fusion polymerase chain reaction (PCR) to generate the disruption construct and electroporation for genetic transformation. This method does not require an enzymatic reaction, other than PCR, and additionally offers greater flexibility in terms of the design of the disruption construct. Employment of electroporation facilitates the preparation of competent cells and improves the transformation efficiency. The present method may be adapted for the generation of gene-disrupted strains of various species.

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

We describe a facile, rapid, and relatively inexpensive method for the generation of gene-disrupted Streptococcus mutans strains; this technique may be adapted for the generation of gene-disrupted strains of various species.

Generation von einem Gen gestört Streptococcus Mutans Belastung ohne Gene Klonen

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in ...

Forschung

Genetik

One-day Workflow Scheme for Bacterial Pathogen Detection and Antimicrobial Resistance Testing from Blood Cultures

Bloodstream infections are associated with high mortality rates because of the probable manifestation of sepsis, severe sepsis and septic shock1. Therefore, rapid administration of adequate antibiotic therapy is of foremost importance in the treatment of bloodstream infections. The critical element in this process is timing, heavily dependent on the results of bacterial identification and antibiotic susceptibility testing. Both of these parameters are routinely obtained by culture-based testing, which is time-consuming and takes on average 24-48 hours2, 4. The aim of the study was to develop DNA-based assays for rapid identification of bloodstream infections, as well as rapid antimicrobial susceptibility testing. The first assay is a eubacterial 16S rDNA-based real-time PCR assay complemented with species- or genus-specific probes5. Using these probes, Gram-negative bacteria including Pseudomonas spp., Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli as well as Gram-positive bacteria including Staphylococcus spp., Staphylococcus aureus, Enterococcus spp., Streptococcus spp., and Streptococcus pneumoniae could be distinguished. Using this multiprobe assay, a first identification of the causative micro-organism was given after 2 h.
Secondly, we developed a semi-molecular assay for antibiotic susceptibility testing of S. aureus, Enterococcus spp. and (facultative) aerobe Gram-negative rods6. This assay was based on a study in which PCR was used to measure the growth of bacteria7. Bacteria harvested directly from blood cultures are incubated for 6 h with a selection of antibiotics, and following a Sybr Green-based real-time PCR assay determines inhibition of growth. The combination of these two methods could direct the choice of a suitable antibiotic therapy on the same day (Figure 1). In conclusion, molecular analysis of both identification and antibiotic susceptibility offers a faster alternative for pathogen detection and could improve the diagnosis of bloodstream infections.

The design of a straightforward one-day workflow scheme for bacterial pathogen diagnostics enables the rapid recognition of bloodstream infections. The inclusion of eight clinically relevant bacterial targets and their antibiotic resistance profiles offers the clinician an initial insight on the same day, which can lead to more adequate therapy.

Ein-Tages-Workflow-Schema für bakterielles Pathogen-Erkennung und Resistenz gegen antimikrobielle Tests aus Blutkulturen

Bloodstream infections are associated with high mortality rates because of the probable manifestation of sepsis, severe sepsis and septic shock1. ...

Immunologie und Infektion

Biosensor for Detection of Antibiotic Resistant Staphylococcus Bacteria

A structurally transformed lytic bacteriophage having a broad host range of Staphylococcus aureus strains and a penicillin-binding protein (PBP 2a) antibody conjugated latex beads have been utilized to create a biosensor designed for discrimination of methicillin resistant (MRSA) and sensitive (MSSA) S. aureus species 1,2. The lytic phages have been converted into phage spheroids by contact with water-chloroform interface. Phage spheroid monolayers have been moved onto a biosensor surface by Langmuir-Blodgett (LB) technique 3. The created biosensors have been examined by a quartz crystal microbalance with dissipation tracking (QCM-D) to evaluate bacteria-phage interactions. Bacteria-spheroid interactions led to reduced resonance frequency and a rise in dissipation energy for both MRSA and MSSA strains. After the bacterial binding, these sensors have been further exposed to the penicillin-binding protein antibody latex beads. Sensors analyzed with MRSA responded to PBP 2a antibody beads; although sensors inspected with MSSA gave no response. This experimental distinction determines an unambiguous discrimination between methicillin resistant and sensitive S. aureus strains. Equally bound and unbound bacteriophages suppress bacterial growth on surfaces and in water suspensions. Once lytic phages are changed into spheroids, they retain their strong lytic activity and show high bacterial capture capability. The phage and phage spheroids can be utilized for testing and sterilization of antibiotic resistant microorganisms. Other applications may include use in bacteriophage therapy and antimicrobial surfaces.

Lytic phage biosensors and antibody beads are able to discriminate between methicillin resistant (MRSA) and sensitive staphylococcus bacteria. The phages were immobilized by a Langmuir-Blodgett method onto a surface of a quartz crystal microbalance sensor and worked as broad range staphylococcus probes. Antibody beads recognize MRSA.

Biosensor zum Nachweis von Antibiotika-resistenten Staphylococcus Bakterien

A structurally transformed lytic bacteriophage having a broad host range of Staphylococcus aureus strains and a penicillin-binding protein (PBP 2a) ...

Biotechnik

Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec) typing is a very important molecular tool for understanding the epidemiology and clonal strain relatedness of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA), particularly with the emerging outbreaks of community-associated MRSA (CA-MRSA) occurring on a worldwide basis. Traditional PCR typing schemes classify SCCmec by targeting and identifying the individual mec and ccr gene complex types, but require the use of many primer sets and multiple individual PCR experiments. We designed and published a simple multiplex PCR assay for quick-screening of major SCCmec types and subtypes I to V, and later updated it as new sequence information became available. This simple assay targets individual SCCmec types in a single reaction, is easy to interpret and has been extensively used worldwide. However, due to the sophisticated nature of the assay and the large number of primers present in the reaction, there is the potential for difficulties while adapting this assay to individual laboratories. To facilitate the process of establishing a MRSA SCCmec assay, here we demonstrate how to set up our multiplex PCR assay, and discuss some of the vital steps and procedural nuances that make it successful.

Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

We demonstrate a simple multiplex PCR assay for quick-screening and typing of Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec) types I-V for methicillin-resistant Staphylococcus aureus, and provide some of the vital steps and procedural nuances that make it successful for adapting this assay to individual laboratories.

Multiplex PCR Assay f

Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec) typing  is a very important molecular tool for understanding the epidemiology and  clonal strain ...

MS2-Affinity Purification Coupled with RNA Sequencing in Gram-Positive Bacteria

Although small regulatory RNAs (sRNAs) are widespread among the bacterial domain of life, the functions of many of them remain poorly characterized notably due to the difficulty of identifying their mRNA targets. Here, we described a modified protocol of the MS2-Affinity Purification coupled with RNA Sequencing (MAPS) technology, aiming to reveal all RNA partners of a specific sRNA in vivo. Broadly, the MS2 aptamer is fused to the 5&#8217; extremity of the sRNA of interest. This construct is then expressed in vivo, allowing the MS2-sRNA to interact with its cellular partners. After bacterial harvesting, cells are mechanically lysed. The crude extract is loaded into an amylose-based chromatography column previously coated with the MS2 protein fused to the maltose binding protein. This enables the specific capture of MS2-sRNA and interacting RNAs. After elution, co-purified RNAs are identified by high-throughput RNA sequencing and subsequent bioinformatic analysis. The following protocol has been implemented in the Gram-positive human pathogen Staphylococcus aureus and is, in principle, transposable to any Gram-positive bacteria. To sum up, MAPS technology constitutes an efficient method to deeply explore the regulatory network of a particular sRNA, offering a snapshot of its whole targetome. However, it is important to keep in mind that putative targets identified by MAPS still need to be validated by complementary experimental approaches.

MAPS technology has been developed to scrutinize the targetome of a specific regulatory RNA in vivo. The sRNA of interest is tagged with a MS2 aptamer enabling the co-purification of its RNA partners and their identification by RNA sequencing. This modified protocol is particularly suited for Gram-positive bacteria.&#160;

MS2-Affinitätsreinigung gekoppelt mit RNA-Sequenzierung in grampositiven Bakterien

Although small regulatory RNAs (sRNAs) are widespread among the bacterial domain of life, the functions of many of them remain poorly characterized ...

Biochemie

Identification of Rare Bacterial Pathogens by 16S rRNA Gene Sequencing and MALDI-TOF MS

There are a number of rare and, therefore, insufficiently described bacterial pathogens which are reported to cause severe infections especially in immunocompromised patients. In most cases only few data, mostly published as case reports, are available which investigate the role of such pathogens as an infectious agent. Therefore, in order to clarify the pathogenic character of such microorganisms, it is necessary to conduct epidemiologic studies which include large numbers of these bacteria. The methods used in such a surveillance study have to meet the following criteria: the identification of the strains has to be accurate according to the valid nomenclature, they should be easy to handle (robustness), economical in routine diagnostics and they have to generate comparable results among different laboratories. Generally, there are three strategies for identifying bacterial strains in a routine setting: 1) phenotypic identification characterizing the biochemical and metabolic properties of the bacteria, 2) molecular techniques such as 16S rRNA gene sequencing and 3) mass spectrometry as a novel proteome based approach. Since mass spectrometry and molecular approaches are the most promising tools for identifying a large variety of bacterial species, these two methods are described. Advances, limitations and potential problems when using these techniques are discussed.

Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) and molecular techniques (16S rRNA gene sequencing) permit the identification of rare bacterial pathogens in routine diagnostics. The goal of this protocol lies in the combination of both techniques which leads to more accurate and reliable data.

Identifizierung von Rare bakteriellen Erregern von 16S rRNA-Gen-Sequenzierung und MALDI-TOF-MS

There are a number of rare and, therefore, insufficiently described bacterial pathogens which are reported to cause severe infections especially in ...

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Transposon mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is less time consuming, less costly, and does not require completed genome information, there are two weaknesses in this method: (1) the possibility of a disparate mutants in the mixed mutant library that counter-selects mutants with decreased competition; and (2) the possibility of partial gene inactivation whereby genes do not entirely lose their function following the insertion of a transposon. Single-gene deletion analysis may compensate for the drawbacks associated with transposon mutagenesis. To improve the efficiency of genome-wide single gene deletion, we attempt to establish a high-throughput technique for genome-wide single gene deletion using Streptococcus sanguinis as a model organism. Each gene deletion construct in S. sanguinis genome is designed to comprise 1-kb upstream of the targeted gene, the aphA-3 gene, encoding kanamycin resistance protein, and 1-kb downstream of the targeted gene. Three sets of primers F1/R1, F2/R2, and F3/R3, respectively, are designed and synthesized in a 96-well plate format for PCR-amplifications of those three components of each deletion construct. Primers R1 and F3 contain 25-bp sequences that are complementary to regions of the aphA-3 gene at their 5' end. A large scale PCR amplification of the aphA-3 gene is performed once for creating all single-gene deletion constructs. The promoter of aphA-3 gene is initially excluded to minimize the potential polar effect of kanamycin cassette. To create the gene deletion constructs, high-throughput PCR amplification and purification are performed in a 96-well plate format. A linear recombinant PCR amplicon for each gene deletion will be made up through four PCR reactions using high-fidelity DNA polymerase. The initial exponential growth phase of S. sanguinis cultured in Todd Hewitt broth supplemented with 2.5% inactivated horse serum is used to increase competence for the transformation of PCR-recombinant constructs. Under this condition, up to 20% of S. sanguinis cells can be transformed using ~50 ng of DNA. Based on this approach, 2,048 mutants with single-gene deletion were ultimately obtained from the 2,270 genes in S. sanguinis excluding four gene ORFs contained entirely within other ORFs in S. sanguinis SK36 and 218 potential essential genes. The technique on creating gene deletion constructs is high throughput and could be easy to use in genome-wide single gene deletions for any transformable bacteria.

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

An efficient genome-wide single gene mutation method has been established using Streptococcus sanguinis as a model organism. This method has achieved via high throughput recombinant PCRs and transformations.

Genomweiten Gen-Deletionen in<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; Von High Throughput PCR

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

Biologie

Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the long-lasting gold standards is to sequence 16S ribosomal RNA (rRNA) gene amplicons generated by domain-level PCR reactions amplifying from genomic DNA. Traditionally, this was performed by cloning and Sanger (capillary electrophoresis) sequencing of PCR amplicons. The advent of next-generation sequencing has tremendously simplified and increased the sequencing depth for 16S rRNA gene sequencing. The introduction of benchtop sequencers now allows small labs to perform their 16S rRNA sequencing in-house in a matter of days. Here, an approach for 16S rRNA gene amplicon sequencing using a benchtop next-generation sequencer is detailed. The environmental DNA is first amplified by PCR using primers that contain sequencing adapters and barcodes. They are then coupled to spherical particles via emulsion PCR. The particles are loaded on a disposable chip and the chip is inserted in the sequencing machine after which the sequencing is performed. The sequences are retrieved in fastq format, filtered and the barcodes are used to establish the sample membership of the reads. The filtered and binned reads are then further analyzed using publically available tools. An example analysis where the reads were classified with a taxonomy-finding algorithm within the software package Mothur is given. The method outlined here is simple, inexpensive and straightforward and should help smaller labs to take advantage from the ongoing genomic revolution.

Characterizing microbial community has been a longstanding goal in environmental microbiology. Next-generation sequencing methods now allow for the characterization of microbial communities at an unprecedented depth with minimal cost and labor. We detail here our approach to sequence bacterial 16S ribosomal RNA genes using a benchtop sequencer.

Next-Generation-Sequenzierung der ribosomalen 16S-RNA Gene Amplikons

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the ...

Efficient Nucleic Acid Extraction and 16S rRNA Gene Sequencing for Bacterial Community Characterization

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing technologies have allowed for the rapid and efficient characterization of bacterial communities using 16S rRNA gene sequencing from a variety of sources. Although readily available tools for 16S rRNA sequence analysis have standardized computational workflows, sample processing for DNA extraction remains a continued source of variability across studies. Here we describe an efficient, robust, and cost effective method for extracting nucleic acid from swabs. We also delineate downstream methods for 16S rRNA gene sequencing, including generation of sequencing libraries, data quality control, and sequence analysis. The workflow can accommodate multiple samples types, including stool and swabs collected from a variety of anatomical locations and host species. Additionally, recovered DNA and RNA can be separated and used for other applications, including whole genome sequencing or RNA-seq. The method described allows for a common processing approach for multiple sample types and accommodates downstream analysis of genomic, metagenomic and transcriptional information.

We describe an efficient, robust, and cost effective method for extracting nucleic acid from swabs for characterization of bacterial communities using 16S rRNA gene amplicon sequencing. The method allows for a common processing approach for multiple sample types and accommodates a number of downstream analytic processes.

Effiziente Nukleinsäure-Extraktion und 16S rRNA Gen-Sequenzierung für bakterielle Gemeinschaft Charakterisierung

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing ...

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the immune system. Perturbation of the healthy gut microbiome has been suggested to play a role in the development of inflammatory diseases, including multiple sclerosis (MS). Environmental and genetic factors can influence the composition of the microbiome; therefore, identification of microbial communities linked with a disease phenotype has become the first step towards defining the microbiome&#8217;s role in health and disease. Use of 16S rRNA metagenomic sequencing for profiling bacterial community has helped in advancing microbiome research. Despite its wide use, there is no uniform protocol for 16S rRNA-based taxonomic profiling analysis. Another limitation is the low resolution of taxonomic assignment due to technical difficulties such as smaller sequencing reads, as well as use of only forward (R1) reads in the final analysis due to low quality of reverse (R2) reads. There is need for a simplified method with high resolution to characterize bacterial diversity in a given biospecimen. Advancements in sequencing technology with the ability to sequence longer reads at high resolution have helped to overcome some of these challenges. Present sequencing technology combined with a publicly available metagenomic analysis pipeline such as R-based Divisive Amplicon Denoising Algorithm-2 (DADA2) has helped advance microbial profiling at high resolution, as DADA2 can assign sequence at the genus and species levels. Described here is a guide for performing bacterial profiling using two-step amplification of the V3-V4 region of the 16S rRNA gene, followed by analysis using freely available analysis tools (i.e., DADA2, Phyloseq, and METAGENassist). It is believed that this simple and complete workflow will serve as an excellent tool for researchers interested in performing microbiome profiling studies.

Described here is a simplified standard operating procedure for microbiome profiling using 16S rRNA metagenomic sequencing and analysis using freely available tools. This protocol will help researchers who are new to the microbiome field as well as those requiring updates on methods to achieve bacterial profiling at a higher resolution.

Mikrobiota-Analyse mit zweistufiger PCR- und 16S-rRNA-Gensequenzierung der nächsten Generation

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...

Genotypisierung

Zusammenfassung

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