Name: a robotic platform for high-throughput protoplast isolation and transformation
Uploaded: 2016-09-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation at JoVE.com

This research was supported by Advanced Research Projects Agency - Energy (ARPA-E) Award No. DE-AR0000313.

1. הקמת תא תרבויות השעיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן נוזלי BY-2 מדיה ידי הוספת 4.43 גרם Linsmaier &amp; Skoog התקשורת בסל, 30 גרם של סוכרוז, 200 מ&quot;ג KH 2 PO 4, ו -200 מיקרוגרם של 2,4-dichlorophenoxyacetic חומצה (2,4-D) ל -900 מ&quot;ל של מזוקקים מי pH 5.8 עם 0.1 M KOH. לאחר תקנון pH, להתאים את עוצמת סופית 1,000 מיליליטר עם מים מזוקקים חיטוי. מדיה ניתן לאחסן עד 2 שבועות 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן בבקבוק 250 מ&quot;ל Erlenmeyer עם 100 מ&quot;ל של נוזל BY-2 התקשורת חתיכה אחת של יבלת BY-2 (&gt; 1 ס&quot;מ קוטר) גדל על BY-2 התקשורת מוצק (נוזל BY-2 מדיה בתוספת 1% אגר) ואת החותם עם רדיד אלומיניום. דגירת התרבות ב C 28-30 מעלות עם רעד במשך 5 ימים. הערה: BY-2 יבלת מתוחזק על תקשורת מוצקה עבור אחסון לטווח ארוך, כמו תרבויות נוזל תהיינה לגדול יותר במהירות. נפח תרבות יכול להיות מותאם לפי צורך, בדרך כלל תרבות 100 מיליליטר תהיה מסוגל טעינת שלושים ושלושה 6-wצלחות ell. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 2 מ&quot;ל של שלב יומן BY-2 תרבות 98 מ&quot;ל של התקשורת BY-2 טריים דגירה של 5-7 ימים ב 28-30 מעלות צלזיוס עם רעד. הערה: culturing-Sub של תרבויות נוזליות הוקמו יכולה להתבצע באמצעות בקביעות 1: 100 דילולים של תרבויות ישנות 5-7 יום, ולא חיסון עם יבלת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את התרבות ביסודיות, כמו תאים יישב במהירות, והעברת 6 מ&quot;ל של תרבית תאים לצינור צנטריפוגות התחתונה חרוטי 15 מ&quot;ל ולתת התאים להסתפק דקות 10 לפחות. התאם את נפח תא ארוז 50% מכלל נפח על ידי הסרת supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Shake צינור ידי היפוך ו pipet 500 μl לבאר כל צלחת 6-גם לעיכול. השתמש pipets רחב נשא להעביר את התאים בשלב זה, כפי שהם צפופים יסתום טיפים pipet סטנדרטי. </li></ol> 2. בידוד פרוטופלאסט <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את כל המרכיבים של מערכת רובוטית (איור 1A) ולפתוח את המשימה מניעת צלחת תזמון רךכלי. תכנית תזמון משימות משלבת את מניע microplate עם הציוד האחר כדי לאפשר העברת הצלחות בין כל חלקי ציוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני ניסויים, להגדיר את המפרט הטכני עבור מעבדתי (למשל, צלחות, מכסים) בשימוש בפרוטוקול, כמו גם התחלה ועמדות מסתיימות עבור כל פיסת מעבדתי, בתוכנה המניעה צלחת, כדלקמן: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על הגדרה מסרגל הכלים הראשי בתוכנה המניעה צלחת ובחר את פקודת סוגי מכולות ניהול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם סוג המכל מופיע בספריית הסוג מיכל הקיימת, ולאחר מכן בחר את המכל המתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם סוג המכל אינו רשום בספריית סוג המכל הקיימת ולאחר מכן לחץ על הוספה כדי לציין סוג מכל חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הוספת סוג מיכל חדש, הכנס את הממדים של המכל החדש (גובה, רוחב, מידות ערמה, ואת תפסן לקזז) לתוך הכרטיסיות רצויות ולחץ על שמור.<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם הממדים הנכונים אינם זמינים מהיצרן, אז לקבוע במדויק בכל הממדים עד המילימטר הקרוב באמצעות מחוגה. שגיאות במדידת הממדים מיכל תגרומנה לכישלון מניע הצלחת. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבי 2.2.2 דרך 2.2.4.1 לכל סוגים מיכל שמניע הצלחת יפגוש. לאחר השלמת שלב זה עבור כל מעבדתי, יש צורך להגדיר את ההתחלה מיקום הסיום עבור כל מכולה (שלב 2.2.6). הערה: עבור פרוטוקול זה המעבד כוללת את 6-גם צלחת, צלחת העמוקה היטב, ואת 96-גם צלחת הקרנת ניאון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להגדיר את מיקום ההתחלה וסיום של כל מכולה, לחץ על כרטיסיית ההתחלה / סיום בפרוטוקול ספציפי. ראשית, בחר את מיקום ההתחלה של כל מכולה. בשלב הבא, סמן את התיבה עבור עפעפיים / Unlidded היא ברמה של ההתחלה וסיום המיקום. חזור על הפעולה עבור כל מכולה. הערה: אם המיכל יישאר על עוד פיסת סוסיםipment (במקום מניע הצלחת) המיקום סוף ניתן להשאיר ריק. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב זה באופן ידני לטעון את כל הצלחות לתוך למצב ההתחלתי עבור כל העבודה. טען את צלחות ההקרנה פלורסנט 96-היטב לתוך מלון 2, 6 צלחות היטב עם BY-2 תאים לתוך מלון 3, צלחת 96 עמוק היטב אשר ישמשו לטרנספורמציה על הקן מחמם צלחת / ילר 2, ו חרוטי 50 מ&quot;ל שפופרת המכילה את פתרון האנזים (ראה קובץ משלימה, סעיף 1.2.2) על מתקן המצב המרובה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם השינוי יתבצע בפרוטוקול, טרום לטעון 96 צלחת עמוקה היטב עם 10 μl של ה- DNA פלסמיד לכל טוב (1 מיקרוגרם / μl, A 260/280&gt; 1.8) המכיל את לבנות כתב OFP דגירה על הצלחת דוד / ילר ב 4 ° C.. כל טוב ישמש טרנספורמציה יחיד, ובכך הגיע מספר בארות מלא יהיה תלוי בהגדרת הניסוי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טענת את כל האספקה ​​והצלחות על האוטומציהלפלטפורמת טיפול ד נוזלי במקומות המיועדים ולהגדיר את המיקום של כל פריט ב תוכנות שליטה אוטומציה (איור 1B). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען צלחת 96-היטב מראש עם 200 μl של PEG 40% ב MMG (0.4 M מניטול, 100 מ&quot;מ MgCl 2, 4 מ&quot;מ MES, pH 5.7) בטור 1, 200 μl של יודיד propidium (PI, 1 מיקרוגרם / מ&quot;ל) בטור 2, ו -200 μl של אתנול בעמודה 3 (הקן 2), וקופסת טיפים פיפטה בקן 8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להגדיר את מיקומו של מעבדתי בתוכנה של פלטפורמת טיפול הנוזל אוטומטית, כלים מהתפריט ולחץ עורך Labware. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את סוג מעבדתי מהתפריט הנפתח או להגדיר סוג מעבדי חדש באמצעות הלחצן Labware החדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את המיקום של כל פיסת המעבדת שנבחרה על ידי בחירת הכרטיסייה ראש הפרוטוקול ולחיצת Labware Configure. ודא כי כל פיסת מעבדתי להוסיף על פלטפורמת טיפול נוזל אוטומטית היאכהגדרתו ערב הפעלת הפרוטוקול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לעורר את הפרוטוקולים האוטומטיים, לחץ על חלון פרופיל Explorer ובחר את שמו של הפרוטוקול שיופעל (בידוד פרוטופלאסט, ספירת תאים, וטרנספורמציה בתיווך PEG). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על הפעל כדי לאתחל את כל ההתקנים אשר ישמשו בפרוטוקול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבסוף, בחלון העבודה Explorer, לחץ על הוסף יחידת עבודה כדי לאמת את כל המכולות / מעבדתי במערכת ולהתחיל הפרוטוקול האוטומטי. הערה: תיאור מלא של הפרוטוקולים האוטומטיים מוכלים קובץ המשלימה. </li></ol></li></ol> 3. יקבע תקן Curve עבור ספירת תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ידנית להתרכז פרוטופלאסט בריכוז של 1 x 10 6 פרוטופלאסט / מ&quot;ל בנפח של 1 מ&quot;ל. צנטריפוגה פרוטופלאסט XG ב 1000 למשך 10 דקות, ולהסיר supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספה ידנית של 900 μl של אתנול 70% (שמרו על 4 מעלות צלזיוס) כדי גלולה פרוטופלאסטמחדש להשעות גלולה. דגירה במשך 10 דקות על קרח כדי לתקן תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 100 μl של PI (1 מיקרוגרם / מ&quot;ל) אל פרוטופלאסט לתייג את הגרעינים ולאפשר זיהוי על ידי הקורא צלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען 80 μl של נוזל BY-2 מדיה לתוך כל שורה ועמודה של צלחת הקרנת פלורסנט 96-היטב החל עמודת 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטור 1 של צלחת ההקרנה פלורסנט 96-היטב, להוסיף 70 μl של פרוטופלאסט ו -50 μl BY-2 התקשורת היטב כל בעמודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את צלחת קן 6 של פלטפורמת טיפול נוזל אוטומטית, ולהפעיל דילול סדר פי 2. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לערוך דילול סדר על פלטפורמת טיפול נוזל אוטומטית, לחץ הפעל אשף דילול סדר ולהתאים את עוצמת קול ההעברה (60 μl), מספר תערובות ונפח (2, 70 μl), בארות ראשוניות (טור 1, שורות AF), דילול בארות (עמודות 2-11, שורות AF), ואת לשאוב ומאפיינים לוותר (0.5 מ&quot;מ היטב למטה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הגדרת הפרמטרים, לשמורd להריץ את הפרוטוקול. הערה: מכיוון שכל פרוטופלאסט מסומן עם PI (בשל קיבעון של תאים), הקרינה היא מידתית לריכוז פרוטופלאסט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דילול סדרתי יושלם, הסר את הצלחת מן הקן 9 ולהכניס לתוך קורא הצלחת ולהפעיל את הפרוטוקול העקום הסטנדרט בתוכנה קוראת צלחת. הערה: עקומת סטנדרט אז תופק על ידי השוואת הקרינה מן PI (עירור 536 ננומטר / פליטה 620 ננומטר) בכל טוב עם ריכוז פרוטופלאסט ידוע. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם השלמת הפרוטוקול הקורא הצלחת, להסיר את הצלחת לאסוף את כל תאים מהונדסים עבור מעוקר או נהלי דה-חִיוּן נוספים שנקבעו פרוטוקולי בטיחות ביולוגיים &quot;. </li></ol> 4. ניתוח מיקרוסקופי של טרנספורמציה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הצלחת עם פרוטופלאסט טרנספורמציה (התוצר של אוטומט פרוטוקול 3, קובץ משלימה) ממלון 1 של מערכת רובוטית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפנותעל מיקרוסקופ הפוכה, מצלמה, ואת מנורת פלורסנט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את המטרה 10X עבור היין הראשי התמקדות פרוטופלאסט, להדליק את מנורת הלוגן, ולסגור את התריס על מנורת פלורסנט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת טען גבי מערכת מיקרוסקופית ולהתמקד פרוטופלאסט באמצעות brightfield. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר התמקדות פרוטופלאסט, לכבות את נורת הלוגן ולפתוח את התריס על מנורת פלורסנט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את מסנן CY3 / TRITC להגדיר להדמיה של חלבון pporRFP שהביע פרוטופלאסט המהונדס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סרוק היטב כל כדי לקבוע את מספר פרוטופלאסט להביע pporRFP סמן ניאון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשב את יעילות השינוי כמספר הכולל של פרוטופלאסט המבטא את בסמן פלורסנטי המספר הכולל של פרוטופלאסט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף כל צלחות המכילות תאים מהונדסים בשקיות בטיחות ביולוגיות שאושרו מעוקר או נהלי דה-חִיוּן נוספים שנקבעו פרוטוקולי בטיחות ביולוגיים &quot;. </li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרס כלכלי מתחרים.

הפרוטוקול המתואר לעיל יאומת בהצלחה לבידוד פרוטופלאסט, ספירה, וטרנספורמציה באמצעות תרבית תאי השעית טבק BY-2; עם זאת, הפרוטוקול יכול בקלות להיות מורחב על כל תרבות השעית צמח. נכון לעכשיו, בידוד וטרנספורמציה פרוטופלאסט הושגה בצמחים רבים, כולל תירס (Zea Mays) 10, גזר <em...

בשנים האחרונות חלה תנופה משמעותית דגש על העיצוב של יבולים מהונדסים להתגבר מחלות שונות 1, מעניק עמידות עשבים 2, להעניק בצורת 3,4 וסובלנות מלח 5, למנוע herbivory 6, להגדיל את התשואה ביומסה 7, ולהקטין סרבנות דופן תא 8. מגמה זו כבר שנעזר בפיתוח כלים מולקולריים חדשים להפקת צמחי מהונדס, כולל הגנום עריכה באמצעות CRISPR ו TALENs 9, ואת הגן השתקה דרך dsRNA 10, מירנה 11, ו siRNA 12. בעוד הטכנולוגיות הללו יש לפשט את הדור של צמחים מהונדסים, הם גם יצרו צוואר בקבוק, שבו המספר העצום של צמחים מהונדסים שנוצר לא יכול להיות מוקרן באמצעות מערכות מסורתיות המסתמכות על התחדשות צמח. הקשורים צוואר הבקבוק הזה, תוך השתקה בונה לעריכת הגנום יכול להיות מוכנס לתוך במהירות צמחים, רבים שלתכונות ממוקדות מצליחות לייצר את האפקט הרצוי, אשר לעתים קרובות ומתגלה רק צמחים מנותחים בחממה. בעבודה זו, פיתחנו שיטה מהירה, אוטומטית, הקרנת תפוקה גבוהה של פרוטופלאסט צמח, במיוחד כדי לענות על צוואר הבקבוק הנוכחי להקרנה מוקדמת של מספר גדול של עריכת-הגנום הגן השתקה מטרות. השימוש פרוטופלאסט, בניגוד בתאי צמח שלם, יש מספר יתרונות לפיתוח פלטפורמה אוטומטית. ראשית, פרוטופלאסט מבודד לאחר העיכול של דופן תא צמח, ועם המחסום הזה כבר לא קיים, יעילות שינוי היא גדלה 13. בתאי צמח שלמים יש רק שתי שיטות ותיקות לטרנספורמציה, biolistics 14 ו Agrobacterium בתיווך טרנספורמציה 15. אף אחת מהשיטות הללו יכולים להיות מתורגמים בקלות לפלטפורמות טיפול נוזל, כמו biolistics דורש ציוד מיוחד עבור transformation, ואילו Agrobacterium טרנספורמציה בתיווך דורשת שיתוף תרבות והסרה הבאה של החיידקים. לא ניתנים עבור שיטות תפוקה גבוהות. במקרה של פרוטופלאסט, שינוי מתבצע באמצעות פוליאתילן גליקול שיגרתי (PEG) transfection בתיווך 16, מחייב חילוף פתרון מספר בלבד, והוא אידיאלי עבור פלטפורמות טיפול נוזל. שנית, פרוטופלאסט, מעצם הגדרתו, תרבויות תא בודד, ובכך הבעיות קשורות היווצרות בצעדים כבדה שרשרת בתרביות תאי צמח, אינם שנצפה פרוטופלאסט. מבחינת לסינון מהיר באמצעות ספקטרופוטומטר מבוסס-צלחת, התקבצות של תאים, או תאים במטוסים מרובים יובילו קושי ברכישת מדידות עקביות. מאז פרוטופלאסט צפוף גם מאשר התקשורת והתרבות שלהם, הם משקעים לתחתית בארות, ויצרו בשכבה, שהיא תורמת spectrophotometry מבוסס צלחת. לבסוף, בעוד תרבויות השעית תא צמח הם primarily נגזר יבלת 17, ניתן לקצור פרוטופלאסט ממספר רקמות הצמח, מה שמוביל את היכולת לזהות ביטוי רקמות ספציפיות. לדוגמא, היכולת לנתח root- או ביטוי ספציפי עלים של גן יכול להיות חשוב מאוד לניבוי הפנוטיפ. מסיבות אלה, פרוטוקולים שפותחו בעבודה זו אומתו באמצעות פרוטופלאסט מבודד טבק-בשימוש נרחב (Nicotiana tabacum L.) &#39;צהוב בוהק&#39; 2 (BY-2) תרבות ההשעיה. תרבות ההשעיה BY-2 תוארה תא &quot;הלה&quot; של צמחים גבוהים יותר, בשל השימוש הנפוץ שלה באנליזה מולקולרית של בתאי צמח 18. לאחרונה, BY-2 תאים שמשו כדי לחקור את ההשפעות של צמח לחצי 19-22, לוקליזציה חלבון תאית 23,24, ביולוגיה של תא בסיסי 25-27 הוכחת השירות הרחב של תרבויות אלה בביולוגית צמח. יתרון נוסף של תרבויות BY-2 הואהיכולת לסנכרן התרבויות עם aphidicolin, מה שעלול להוביל שחזור משופר עבור ביטוי גנים שלומד 28. יתר על כן, שיטות פותחו עבור החילוץ של BY-2 פרוטופלאסט באמצעות אנזימים בעלות נמוך 29,30, כמו אנזימים מסורתיים המשמשים לייצור פרוטופלאסט הם עלות גבוהה למערכות תפוקה גבוהה. ככזה, הפרוטוקול המתואר להלן יאומת באמצעות תרבות השעית BY-2, אבל זה צריך להיות amendable לכל תרבות השעית תא צמח. הוכחה של קונספט ניסויים מבוצעים באמצעות חלבון פלואורסצנטי כתום (OFP) גן כתב (pporRFP) מן Porites האלמוגים הקשה porites 31 תחת השליטה של אמרגן 35S CAMV.

<table><tbody><tr><td>Orbitor RS Microplate mover</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bravo Liquid Handler</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Synergy H1 Multi-mode Reader</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MultiFlo FX Multi-mode Dispenser</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Teleshake</td><td>Inheco</td><td>3800048</td><td></td></tr><tr><td>CPAC Ultraflat Heater/cooler</td><td>Inheco</td><td>7000190</td><td></td></tr><tr><td>Vworks Automation Software</td><td>Agilent</td><td></td><td>Software used to control and write protocols for Agilent Bravo</td></tr><tr><td>Momentum Software</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Task scheduling software for controlling Orbiter RS</td></tr><tr><td>Liquid Handling Control 2.17 Software</td><td>Biotek</td><td></td><td>Software used to control and write protocols for MultiFlo FX</td></tr><tr><td>IX81 Inverted Microscope</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zyla 3-Tap microscope camera</td><td>Andor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ET-CY3/TRITC Filter Set</td><td>Chroma Technology Corp</td><td>49004</td><td></td></tr><tr><td>Rohament CL</td><td>AB Enzymes</td><td>sample bottle</td><td>low-cost cellulase</td></tr><tr><td>Rohapect UF</td><td>AB Enzymes</td><td>sample bottle</td><td>low-cost pectinase</td></tr><tr><td>Rohapect 10L</td><td>AB Enzymes</td><td>sample bottle</td><td>low-cost pectinase/arabinase</td></tr><tr><td>Linsmaier &amp;amp; Skoog Basal Medium</td><td>Phytotechnology Laboratories</td><td>L689</td><td></td></tr><tr><td>2,4-dichlorophenoxyacetic acid</td><td>Phytotechnology Laboratories</td><td>D295</td><td></td></tr><tr><td>propidium iodide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4170</td><td></td></tr><tr><td>Poly(ethylene glycol) 4000</td><td>Sigma Aldrich</td><td>95904-250G-F</td><td>Formerly Fluka PEG</td></tr><tr><td>Propidium Iodide</td><td>Fisher Scientific</td><td>25535-16-4</td><td>Acros Organics</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7902-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Acetate</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP333-500</td><td></td></tr><tr><td>Mannitol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1902-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Fisher Scientific</td><td>S5-3</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC424205000</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1767</td><td></td></tr><tr><td>Gelzan CM</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1910-250G</td><td></td></tr><tr><td>6-well plate</td><td>Thermo Scientific</td><td>103184</td><td></td></tr><tr><td>96-well 1.2 ml deep well plate</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-0564</td><td></td></tr><tr><td>96 well optical bottom plate</td><td>Thermo Scientific</td><td>165305</td><td></td></tr><tr><td>Finntip 1000 Wide bore Pipet tips</td><td>Thermo Scientific</td><td>9405 163</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-10</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4504-1KG</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC17259-5000</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>M33-500</td><td></td></tr></tbody></table>

a robotic platform for high-throughput protoplast isolation and transformation

בעשור האחרון חלה התעוררות מחודשת השימוש פרוטופלאסט צמח נעים בין מיני מודל לחתוך מינים, לניתוח של מסלולי העברת אותות, רשתות רגולטוריות תעתיק, ביטוי גנים, הגנום עריכה-להשתקת גנים. יתר על כן, התקדמות משמעותית נעשתה ההתחדשות של צמחים מפני פרוטופלאסט, אשר יצרה עניין עוד יותר את השימוש במערכות אלה עבור הגנומיקה צמח. בעבודה זו, פרוטוקול פותח לאוטומציה של בידוד פרוטופלאסט וטרנספורמציה מתרבה השעית טבק 2 &#39;צהובה בוהק &quot;(BY-2) באמצעות פלטפורמה רובוטית. נהלי טרנספורמציה אומתו באמצעות חלבון פלואורסצנטי כתום גן כתב (OFP) (pporRFP) תחת השליטה של ​​אמרגן 35S וירוס פסיפס הכרובית (35S). ביטוי OFP ב פרוטופלאסט אושר על ידי מיקרוסקופ epifluorescence. ניתוח כלל גם שיטות יעילות הייצור פרוטופלאסט באמצעות propidiuיודיד מטר. לבסוף, אנזימי כיתת מזון בעלות נמוכה שמשו הליך בידוד פרוטופלאסט, עקיפת הצורך אנזימי מעבדת כיתה כי הם עלות אוסרני ב תפוקה גבוהה אוטומטי בידוד פרוטופלאסט וניתוח. בהתבסס על הפרוטוקול שפותח בעבודה זו, הנוהל במלואו מבידוד פרוטופלאסט לטרנספורמציה יכול להתנהל תחת 4 שעות, ללא כל קלט מהמפעיל. בעוד פרוטוקול שפותח בעבודה זו קיבלה תוקף עם תרבית תאים BY-2, נהלים ושיטות צריכה להיות לתרגום לכל ההשעיה צמח תרבות / מערכת פרוטופלאסט, מה שאמור לאפשר האצה של מחקר הגנום היבול.

במחקר הנוכחי, שיעור ההכפלה של BY-2 נע בין 14-18 שעות תלויות בטמפרטורה שבה התרבויות הודגרו, עולה בקנה אחד עם דיווחים קודמים של אורך מחזור התא ממוצע של 15 שעות. עם שיעור הכפלה זו, ביחס של 1: בידוד החל 100 שמש ליזום תרבויות, מה שמוביל תרבויות עם נפח תא ארוז (PCV) של 5...

Watch this Scientific Journal Video about A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation at JoVE.com

A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation

A-תפוקה גבוהה, אוטומטית, מתודולוגיה ייצור וטרנספורמציה טבק פרוטופלאסט מתוארת. המערכת הרובוטית מאפשרת ביטוי גנים מקביל מסיבי וגילוי במודל BY-2 המערכת שאמורה להיות לתרגום לגידולים שאינם מודל.

פלטפורמה רובוטית עבור תפוקה גבוהה בידוד פרוטופלאסט וההשנאה

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal ...

a-robotic-platform-for-high-throughput-protoplast-isolation

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Genetics

14.2K Views.  University of Tennessee, Knoxville.  A-תפוקה גבוהה, אוטומטית, מתודולוגיה ייצור וטרנספורמציה טבק פרוטופלאסט מתוארת. המערכת הרובוטית מאפשרת ביטוי גנים מקביל מסיבי וגילוי במודל BY-2 המערכת שאמורה להיות לתרגום לגידולים שאינם מודל. 

Video: A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

Systematic identification and characterization of genetic perturbations have proven useful to decipher gene function and cellular pathways. However, the conventional approaches of permanent gene deletion cannot be applied to essential genes. We have pioneered a unique collection of ~70 temperature-sensitive (ts) lethal mutants for studying cell cycle regulation in the unicellular green algae Chlamydomonas reinhardtii1. These mutations identify essential genes, and the ts alleles can be conditionally inactivated by temperature shift, providing valuable tools to identify and analyze essential functions. Mutant collections are much more valuable if they are close to comprehensive, since scattershot collections can miss important components. However, this requires the efficient collection of a large number of mutants, especially in a wide-target screen. Here, we describe a robotics-based pipeline for generating ts lethal mutants and analyzing their phenotype in Chlamydomonas. This technique can be applied to any microorganism that grows on agar. We have collected over 3000 ts mutants, probably including mutations in most or all cell-essential pathways, including about 200 new candidate cell cycle mutations. Subsequent molecular and cellular characterization of these mutants should provide new insights in plant cell biology; a comprehensive mutant collection is an essential prerequisite to ensure coverage of a broad range of biological pathways. These methods are integrated with downstream genetics and bioinformatics procedures for efficient mapping and identification of the causative mutations that are beyond the scope of this manuscript.

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

Temperature-sensitive (ts) lethal mutants are valuable tools to identify and analyze essential functions. Here we describe methods to generate and classify ts lethal mutants in high throughput.

תפוקה גבוהה בידוד Assisted רובוטית של מוטאנטים קטלניים רגישים-טמפרטורה<em&gt; Chlamydomonas reinhardtii</em

Systematic identification and characterization of genetic perturbations have proven useful to decipher gene function and cellular pathways. However, the ...

A High-throughput Automated Platform for the Development of Manufacturing Cell Lines for Protein Therapeutics

The fast-growing biopharmaceutical industry demands speedy development of highly efficient and reliable production systems to meet the increasing requirement for drug supplies. The generation of production cell lines has traditionally involved manual operations that are labor-intensive, low-throughput and vulnerable to human errors. We report here an integrated high-throughput and automated platform for development of manufacturing cell lines for the production of protein therapeutics.
The combination of BD FACS Aria Cell Sorter, CloneSelect Imager and TECAN Freedom EVO liquid handling system has enabled a high-throughput and more efficient cell line development process. In this operation, production host cells are first transfected with an expression vector carrying the gene of interest 1, followed by the treatment with a selection agent. The stably-transfected cells are then stained with fluorescence-labeled anti-human IgG antibody, and are subsequently subject to flow cytometry analysis 2-4. Highly productive cells are selected based on fluorescence intensity and are isolated by single-cell sorting on a BD FACSAria. Colony formation from single-cell stage was detected microscopically and a series of time-laps digital images are taken by CloneSelect Imager for the documentation of cell line history. After single clones have formed, these clones were screened for productivity by ELISA performed on a TECAN Freedom EVO liquid handling system. Approximately 2,000 - 10,000 clones can be screened per operation cycle with the current system setup.
This integrated approach has been used to generate high producing Chinese hamster ovary (CHO) cell lines for the production of therapeutic monoclonal antibody (mAb) as well as their fusion proteins. With the aid of different types of detecting probes, the method can be used for developing other protein therapeutics or be applied to other production host systems. Comparing to the traditional manual procedure, this automated platform demonstrated advantages of significantly increased capacity, ensured clonality, traceability in cell line history with electronic documentation and much reduced opportunity in operator error.

A high-throughput, automated platform of manufacturing cell line development for producing protein therapeutics is described. Implementation of BD FACS Aria Cell Sorter, CloneSelect Imager and TECAN Freedom EVO liquid handling system has demonstrated significantly increased processing capacity in cell line development with improved cell line quality and high reproducibility.

פלטפורמה תפוקה גבוהה אוטומטיות לפיתוח קווי ייצור עבור Cell Therapeutics חלבון

The fast-growing biopharmaceutical industry demands speedy development of highly efficient and reliable production systems to meet the increasing ...

Medicine

Studying Protein Import into Chloroplasts Using Protoplasts

The chloroplast is an essential organelle that is responsible for various cellular processes in plants, such as photosynthesis and the production of many secondary metabolites and lipids. Chloroplasts require a large number of proteins for these various physiological processes. Over 95% of chloroplast proteins are nucleus-encoded and imported into chloroplasts from the cytosol after translation on cytosolic ribosomes. Thus, the proper import or targeting of these nucleus-encoded chloroplast proteins to chloroplasts is essential for the proper functioning of chloroplasts as well as the plant cell. Nucleus-encoded chloroplast proteins contain signal sequences for specific targeting to chloroplasts. Molecular machinery localized to the chloroplast or cytosol recognize these signals and carry out the import process. To investigate the mechanisms of protein import or targeting to chloroplasts in vivo, we developed a rapid, efficient protoplast-based method to analyze protein import into chloroplasts of Arabidopsis. In this method, we use protoplasts isolated from leaf tissues of Arabidopsis. Here, we provide a detailed protocol for using protoplasts to investigate the mechanism by which proteins are imported into chloroplasts.

Here we describe a protocol to express proteins into protoplasts by using PEG-mediated transformation method. The method provides easy expression of proteins of interest, and efficient investigation of protein localization and the import process for various experimental conditions in vivo.

לומד חלבון לייבא לתוך מהכלורופלסט באמצעות Protoplasts

The chloroplast is an essential organelle that is responsible for various cellular processes in plants, such as photosynthesis and the production of many ...

Biochemistry

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental stimuli in any multicellular organism. In situ hybridization and reporter gene visualization can to a limited extent be used to this end but for high resolution quantitative RT-PCR or high-throughput transcriptome-wide analysis the isolation of RNA from particular cell types is requisite. Cellular dissociation of tissue expressing a fluorescent protein marker in a specific cell type and subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) makes it possible to collect sufficient amounts of material for RNA extraction, cDNA synthesis/amplification and microarray analysis.
An extensive set of cell type-specific fluorescent reporter lines is available to the plant research community. In this case, two marker lines of the Arabidopsis thaliana root are used: PSCR::GFP (endodermis and quiescent center) and PWOX5::GFP (quiescent center). Large numbers (thousands) of seedlings are grown hydroponically or on agar plates and harvested to obtain enough root material for further analysis. Cellular dissociation of plant material is achieved by enzymatic digestion of the cell wall. This procedure makes use of high osmolarity-induced plasmolysis and commercially available cellulases, pectinases and hemicellulases to release protoplasts into solution.
FACS of GFP-positive cells makes use of the visualization of the green versus the red emission spectra of protoplasts excited by a 488 nm laser. GFP-positive protoplasts can be distinguished by their increased ratio of green to red emission. Protoplasts are typically sorted directly into RNA extraction buffer and stored for further processing at a later time.
This technique is revealed to be straightforward and practicable. Furthermore, it is shown that it can be used without difficulty to isolate sufficient numbers of cells for transcriptome analysis, even for very scarce cell types (e.g. quiescent center cells). Lastly, a growth setup for Arabidopsis seedlings is demonstrated that enables uncomplicated treatment of the plants prior to cell sorting (e.g. for the cell type-specific analysis of biotic or abiotic stress responses). Potential supplementary uses for FACS of plant protoplasts are discussed.

A method for isolating specific cell types from plant material is demonstrated. This technique employs transgenic marker lines expressing fluorescent proteins in particular cell types, cellular dissociation and Fluorescence Activated Cell Sorting. Additionally, a growth setup is established here that facilitates treatment of Arabidopsis thaliana seedlings prior to cell sorting.

מיון פלואורסצנטי תא פעיל של Protoplasts הצמח

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

Biology

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.

Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.

פלטפורמת Microfluidic עבור בידוד תפוקה גבוהה מתא בודד ותרבות

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Bioengineering

Automated Robotic Liquid Handling Assembly of Modular DNA Devices

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; represented by &#34;devices&#34; created as combinations of individual genetic components. However, manual assembly of such large numbers of devices is time-intensive, error-prone, and costly. The increasing sophistication and scale of synthetic biology research necessitates an efficient, reproducible way to accommodate large-scale, complex, and high throughput device construction.
Here, a DNA assembly protocol using the Type-IIS restriction endonuclease based Modular Cloning (MoClo) technique is automated on two liquid-handling robotic platforms. Automated liquid-handling robots require careful, often times tedious optimization of pipetting parameters for liquids of different viscosities (e.g. enzymes, DNA, water, buffers), as well as explicit programming to ensure correct aspiration and dispensing of DNA parts and reagents. This makes manual script writing for complex assemblies just as problematic as manual DNA assembly, and necessitates a software tool that can automate script generation. To this end, we have developed a web-based software tool, http://mocloassembly.com, for generating combinatorial DNA device libraries from basic DNA parts uploaded as Genbank files. We provide access to the tool, and an export file from our liquid handler software which includes optimized liquid classes, labware parameters, and deck layout. All DNA parts used are available through Addgene, and their digital maps can be accessed via the Boston University BDC ICE Registry. Together, these elements provide a foundation for other organizations to automate modular cloning experiments and similar protocols.
The automated DNA assembly workflow presented here enables the repeatable, automated, high-throughput production of DNA devices, and reduces the risk of human error arising from repetitive manual pipetting. Sequencing data show the automated DNA assembly reactions generated from this workflow are ~95% correct and require as little as 4% as much hands-on time, compared to manual reaction preparation.

Here, an automated workflow to perform modular DNA &#34;device&#34; assembly using a modular cloning DNA assembly method on liquid-handling robots is presented. The protocol uses an intuitive software tool for generating liquid handler picklists for combinatorial DNA device library generation, which we demonstrate using two liquid handling platforms.

אוטומטית רובוטית טיפול בנוזלים הרכבה של התקנים DNA מודולרי

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; ...

Efficient Polyethylene Glycol (PEG) Mediated Transformation of the Moss Physcomitrella patens

A simple and efficient method to transform Physcomitrella pantens protoplasts is described. This method is adapted from protocols for Physocmitrella protonemal protoplast and Arabidopsis mesophyll protoplast transformation1. Due to its capacity to undergo efficient mitotic homologous recombination, Physcomitrella patens has emerged as an important model system in recent years2. This capacity allows high frequencies of gene targeting3-9, which is not seen in other model plants such as Arabidopsis. To take full advantage of this system, we need an effective and easy method to deliver DNA into moss cells. The most common ways to transform this moss are particle bombardment10 and PEG-mediated DNA uptake11. Although particle bombardment can produce a high transformation efficiency12, gene guns are not readily available to many laboratories and the protocol is difficult to standardize. On the other hand, PEG mediated transformation does not require specialized equipments, and can be performed in any laboratory with a sterile hood. Here, we show a simple and highly efficient method for transformation of moss protoplasts. This method can generate more than 120 transient transformants per microgram of DNA, which is an improvement from the most efficient protocol previously reported13. Because of its simplicity, efficiency, and reproducibility, this method can be applied to projects requiring large number of transformants as well as for routine transformation.

Efficient Polyethylene Glycol PEG Mediated Transformation of the Moss Physcomitrella patens

A simple and efficient method to transform Physcomitrella pantens protoplasts is described. This method is adapted from protocols for Physocmitrella protonemal protoplast and Arabidopsis mesophyll protoplast transformation1.

פוליאתילן גליקול יעיל (PEG) מתווכת טרנספורמציה של מוס Physcomitrella patens</em

A simple and efficient method to transform Physcomitrella pantens protoplasts is described. This method is adapted from protocols for Physocmitrella ...

High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, including those with direct relevance to human disease. Because of its short generation time and well-characterized genome, a major experimental advantage of the yeast model system is the ability to perform genetic screens to identify genes and pathways that are involved in a given process. Over the last thirty years such genetic screens have been used to elucidate the cell cycle, secretory pathway, and many more highly conserved aspects of eukaryotic cell biology 1-5. In the last few years, several genomewide libraries of yeast strains and plasmids have been generated 6-10. These collections now allow for the systematic interrogation of gene function using gain- and loss-of-function approaches 11-16. Here we provide a detailed protocol for the use of a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot to perform a plasmid overexpression screen, using an arrayed library of 5,500 yeast plasmids. We have been using these screens to identify genetic modifiers of toxicity associated with the accumulation of aggregation-prone human neurodegenerative disease proteins. The methods presented here are readily adaptable to the study of other cellular phenotypes of interest.

Here we describe a plasmid overexpression screen in Saccharomyces cerevisiae, using an arrayed plasmid library and a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot.

תפוקה גבוהה Overexpression פלסמיד שמרים מסך

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, ...

A Simple Method for Isolation of Soybean Protoplasts and Application to Transient Gene Expression Analyses

Soybean (Glycine max (L.) Merr.) is an important crop species and has become a legume model for the studies of genetic and biochemical pathways. Therefore, it is important to establish an efficient transient gene expression system in soybean. Here, we report a simple protocol for the preparation of soybean protoplasts and its application for transient functional analyses. We found that young unifoliate leaves from soybean seedlings resulted in large quantities of high quality protoplasts. By optimizing a PEG-calcium-mediated transformation method, we achieved high transformation efficiency using soybean unifoliate protoplasts. This system provides an efficient and versatile model for examination of complex regulatory and signaling mechanisms in live soybean cells and may help to better understand diverse cellular, developmental and physiological processes of legumes.

We developed a simple and efficient protocol for the preparation of large quantities of soybean protoplasts to study complex regulatory and signaling mechanisms in live cells.

שיטה פשוטה עבור בידוד של סויה Protoplasts, ליישום ניתוחים ביטוי גנים ארעית

Soybean (Glycine max (L.) Merr.) is an important crop species and has become a legume model for the studies of genetic and biochemical pathways. ...

Scalable Transfection of Maize Mesophyll Protoplasts

The transfection of maize mesophyll cells often involves digesting the plant cell walls to create protoplasts and then inserting DNA via electroporation or polyethylene glycol (PEG). Previous methods were developed to produce tens of thousands of transfected protoplasts at once. Here,&#160;we describe a straightforward method to isolate and transfect millions of leaf mesophyll protoplasts in maize (Zea mays L.). This streamlined process removes certain common protoplasting steps, such as washing in W5. Additionally, steps such as centrifugation, PEG-mediated transfection, and incubation have been modified to work with a greater number of protoplasts. The ability to express large libraries of plasmid constructs enables genome-scale experiments, such as massively parallel reporter assays in maize.

Here, we present a high-throughput protocol to transiently transfect millions of maize protoplasts for testing large libraries of plasmids in maize mesophyll cells.

טרנספקציה ניתנת להרחבה של פרוטופלסטים של מזופיל תירס

The transfection of maize mesophyll cells often involves digesting the plant cell walls to create protoplasts and then inserting DNA via electroporation ...

פלטפורמה רובוטית עבור תפוקה גבוהה בידוד פרוטופלאסט וההשנאה

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

תפוקה גבוהה בידוד Assisted רובוטית של מוטאנטים קטלניים רגישים-טמפרטורה