Name: a robotic platform for high-throughput protoplast isolation and transformation
Uploaded: 2016-09-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
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This research was supported by Advanced Research Projects Agency - Energy (ARPA-E) Award No. DE-AR0000313.

1. Istituzione di sospensione culture cellulari <ol><li> Preparare liquido BY-2 supporti aggiungendo 4,43 g Linsmaier &amp; Skoog supporti basali, 30 g di saccarosio, 200 mg KH 2 PO 4, e 200 mg di 2,4-diclorofenossiacetico acido (2,4-D) a 900 ml di acqua distillata l&#39;acqua e il pH a 5,8 con 0,1 M KOH. Dopo la regolazione del pH, regolare il volume finale a 1000 ml con acqua distillata e autoclave. I supporti possono essere memorizzati fino a 2 settimane a 4 ° C. </li><li> Seminare un pallone da 250 ml Erlenmeyer con 100 ml di liquido BY-2 media e un pezzo unico di BY-2 callo (&gt; 1 cm di diametro) coltivati ​​in solidi supporti BY-2 (liquido BY-2 supporti con l&#39;aggiunta di 1% agar) e sigillare con un foglio di alluminio. Incubare cultura a 28-30 ° C con agitazione per 5 giorni. NOTA: BY-2 callo è mantenuto sul solido supporto per l&#39;archiviazione a lungo termine, come colture liquide saranno rapidamente invadere. volume di cultura può essere regolata se necessario, tipicamente una cultura 100 ml sarà in grado di caricare trentatré 6-wPiastre ELL. </li><li> Trasferimento 2 ml di fase registro BY-2 cultura a 98 ml di fresca media da parte-2 e incubare per 5-7 giorni a 28-30 ° C con agitazione. NOTA: Sub-coltura delle colture liquide stabiliti può essere effettuata regolarmente con 1: 100 diluizioni di vecchie culture 5-7 giorno, piuttosto che l&#39;inoculazione con callo. </li><li> Mescolare accuratamente la cultura, le cellule saranno rapidamente stabilirsi, e il trasferimento di 6 ml di coltura cellulare in una provetta da fondo centrifuga 15 ml conica e lasciare che le cellule riposare per almeno 10 minuti. Regolare l&#39;ematocrito al 50% del volume totale rimuovendo surnatante. </li><li> Agitare il tubo invertendo e pipetta 500 microlitri in ciascun pozzetto di una piastra da 6 pozzetti per la digestione. Utilizzare pipette ampio tunnel per trasferire le cellule in questa fase, in quanto sono densi e intasare puntali standard. </li></ol> 2. Isolamento Protoplast <ol><li> Accendere tutti i componenti del sistema robotico (Figura 1A) e aprire l&#39;attività targa motore pianificazione morbidoware. Il programma di pianificazione delle attività integra il motore micropiastra con le altre apparecchiature per consentire il trasferimento di piastre tra ogni pezzo di equipaggiamento. </li><li> Prima di sperimentazione, di definire le specifiche tecniche per mediche di laboratorio (ad esempio, piatti, coperchi) utilizzati nel protocollo, così come posizioni di inizio e fine per ogni pezzo di articoli da laboratorio, nel software piastra di motore, come segue: <ol><li> Fare clic su Imposta dalla barra degli strumenti principale del software piastra di motore e selezionare il comando Gestisci tipi di container. </li><li> Se il tipo di contenitore è elencato nella libreria dei tipi contenitore esistente, quindi selezionare il contenitore appropriato. </li><li> Se il tipo di contenitore non è elencato nella libreria dei tipi contenitore esistente quindi fare clic su Aggiungi per specificare un nuovo tipo di contenitore. </li><li> Dopo aver aggiunto un nuovo tipo di contenitore, inserire le dimensioni del nuovo contenitore (altezza, larghezza, dimensioni accatastamento, e di presa di offset) nelle schede appropriate e fare clic su Salva.<ol><li> Se le dimensioni corrette non sono disponibili presso il produttore, quindi determinare con precisione tutte le dimensioni al millimetro con le pinze. Gli errori nella misurazione delle dimensioni del contenitore si tradurrà in un fallimento del motore piatto. </li></ol></li><li> Ripetere i passaggi 2.2.2 attraverso 2.2.4.1 per tutti i tipi di contenitori che il motore piatto incontrerà. Dopo il completamento di questa fase per tutti da laboratorio, è necessario definire l&#39;inizio e la posizione di fine per ciascun contenitore (fase 2.2.6). NOTA: per questo protocollo il labware comprende la 6-pozzetti, il piatto profondo bene, e la piastra di screening a 96 pozzetti fluorescenti. </li><li> Per definire la posizione di inizio e la fine di ogni contenitore, fare clic sulla scheda Start / End in un protocollo specifico. In primo luogo, selezionare la posizione di partenza di ogni contenitore. Avanti, selezionare la casella per Lidded / Unlidded sia l&#39;inizio e la posizione finale. Ripetere l&#39;operazione per tutti i contenitori. NOTA: Se il contenitore sarà lasciato su un altro pezzo di equipment (al posto del motore piatto) la posizione finale può essere lasciato vuoto. </li></ol></li><li> In questa fase caricare manualmente tutte le piastre nella posizione di partenza per l&#39;intero flusso di lavoro. Caricare le piastre di screening fluorescenti-ben 96 in hotel 2, 6 pozzetti con by-2 cellule in hotel 3, una piastra 96 ​​profondo bene che verrà utilizzato per la trasformazione sul riscaldamento piatto / chiller nido 2, ed una conica da 50 ml provetta contenente la soluzione enzimatica (vedi file supplementare, sezione 1.2.2) al dispenser multi-mode. <ol><li> Se trasformazione sarà effettuata nel protocollo, pre-caricare la piastra profondo bene 96 con 10 ml di DNA plasmidico per pozzo (1 mg / mL, A 260/280&gt; 1.8) contenente il reporter costrutto OFP e incubare sul piatto riscaldamento / raffreddamento a 4 ° C. Ogni pozzetto sarà utilizzato per una singola trasformazione, quindi il numero di pozzetti riempiti dipenderà dalla configurazione sperimentale. </li></ol></li><li> Caricare tutte le forniture e le piastre sul automatizzared piattaforma di gestione dei liquidi nei luoghi designati e definire la posizione di ogni elemento del software di controllo di automazione (Figura 1B). <ol><li> Caricare una piastra a 96 pozzetti precaricato con 200 ml di 40% PEG in MMg (0,4 M mannitolo, 100 mM MgCl 2, 4 MM MES, pH 5.7) nella colonna 1, 200 ml di ioduro di propidio (PI, 1 mg / ml) nella colonna 2, e 200 ml di etanolo nella colonna 3 (nido 2), e una scatola di punte della pipetta in nido 8. </li><li> Per definire la posizione del labware nel software della piattaforma di gestione dei liquidi automatizzato, selezionare Strumenti dal menu e fare clic mediche di laboratorio Editor. </li><li> Selezionare il tipo di materiale da laboratorio dal menu a tendina o definire un nuovo tipo di materiale da laboratorio utilizzando il pulsante Nuovo mediche di laboratorio. </li><li> Definire la posizione di ogni pezzo di labware selezionato selezionando la scheda protocollo principale e facendo clic su Configura mediche di laboratorio. Assicurarsi che ogni pezzo di labware posto sulla piattaforma di gestione dei liquidi automatizzato èdefinito prima di eseguire il protocollo. </li><li> Per attivare i protocolli automatici, fare clic sulla finestra di Explorer profilo e selezionare il nome del protocollo da eseguire (Isolamento Protoplast, Cell Count, e trasformazione PEG-mediata). </li><li> Fare clic su Esegui per inizializzare tutti i dispositivi che verranno utilizzati nel protocollo. </li><li> Infine, nella finestra di lavoro Explorer, fare clic su Aggiungi unità di lavoro per verificare tutti i contenitori / labware nel sistema e iniziare il protocollo automatizzato. NOTA: le descrizioni complete dei protocolli automatizzati sono contenuti nel file supplementare. </li></ol></li></ol> 3. Stabilire curva standard per conteggio delle cellule <ol><li> Concentrarsi manualmente protoplasti ad una concentrazione di 1 x 10 6 protoplasti / ml in un volume di 1 ml. Centrifuga protoplasti a 1.000 xg per 10 minuti e rimuovere il surnatante. </li><li> Aggiungere manualmente 900 ml di etanolo al 70% (mantenuto a 4 ° C) al pellet protoplastie risospendere il pellet. Incubare per 10 minuti in ghiaccio per riparare le cellule. </li><li> Aggiungere 100 ml di PI (1 mg / ml) per i protoplasti di etichettare i nuclei e consentire il rilevamento da parte del lettore di piastre. </li><li> Carico 80 ml di liquido BY-2 supporti in ogni colonna e riga della piastra di screening a 96 pozzetti fluorescenti a partire da colonna 2. </li><li> Nella colonna 1 di una piastra di screening a 96 pozzetti fluorescenti, aggiungere 70 ml di protoplasti e 50 ml BY-2 media per ciascun bene nella colonna. </li><li> Porre la piastra in nido 6 della piattaforma di gestione dei liquidi automatizzato, ed eseguire una diluizione seriale a 2 volte. <ol><li> Per condurre una diluizione di serie sulla piattaforma di gestione dei liquidi automatizzato, fare clic su Avvia procedura guidata diluizione seriale e regolare il volume di trasferimento (60 ml), numero di miscele e di volume (2, 70 ml), pozzi iniziali (colonna 1, righe AF), la diluizione Wells (Colonne 2-11, righe AF), e aspirare e dispensare proprietà (0,5 mm dalla ben inferiore). </li><li> Dopo aver impostato i parametri, salvare und eseguire il protocollo. NOTA: Dal momento che tutti i protoplasti sono etichettati con PI (a causa della fissazione delle cellule), la fluorescenza è proporzionale alla concentrazione protoplasti. </li><li> Dopo la diluizione di serie è completata, rimuovere la piastra dal nido 9 e inserire nel lettore di piastre ed eseguire il protocollo curva standard nel software lettore di piastre. NOTA: Una curva standard verrà generato confrontando la fluorescenza da PI (eccitazione 536 nm / emissione 620 nm) in ciascun pozzetto con la concentrazione protoplasti noto. </li></ol></li><li> Al termine del protocollo lettore di piastre, rimuovere la piastra e raccogliere eventuali cellule transgeniche per la sterilizzazione in autoclave o altre procedure di de-vitalizzazione come definite nei protocolli di biosicurezza &#39;. </li></ol> 4. Analisi microscopica di Trasformazione <ol><li> Rimuovere la piastra con protoplasti trasformati (il prodotto di Automated protocollo 3, File supplementare) dall&#39;Hotel 1 del sistema robotico. </li><li> Giroil microscopio invertito, la macchina fotografica, e lampada fluorescente. </li><li> Selezionare l&#39;obiettivo 10X per iniziale concentrandosi sui protoplasti, accendere la lampada alogena, e chiudere l&#39;otturatore per la lampada fluorescente. </li><li> Piatto di carico sul sistema microscopico e focus sulle protoplasti con campo chiaro. </li><li> Dopo concentrandosi su protoplasti, spegnere la lampada alogena e aprire l&#39;otturatore per la lampada fluorescente. </li><li> Selezionare il filtro CY3 / TRITC set per la visualizzazione della proteina pporRFP espressa dai protoplasti transgenici. </li><li> La scansione di ogni bene per determinare il numero di protoplasti esprimere il marcatore pporRFP fluorescente. </li><li> Calcolare l&#39;efficienza di trasformazione come il numero totale di protoplasti esprimere il marcatore fluorescente il numero totale di protoplasti. </li><li> Raccogliere tutte le piastre contenenti cellule transgeniche in sacchetti di biosicurezza approvati per la sterilizzazione in autoclave o altre procedure di de-vitalizzazione come definite nei protocolli di biosicurezza &#39;. </li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere alcun interesse finanziario in competizione.

Il protocollo sopra descritto è stato convalidato con successo per l&#39;isolamento di protoplasti, l&#39;enumerazione e la trasformazione utilizzando il tabacco coltura cellulare sospensione BY-2; Tuttavia, il protocollo potrebbe facilmente essere esteso a qualsiasi coltura in sospensione pianta. Allo stato attuale, l&#39;isolamento di protoplasti e trasformazione è stato raggiunto in numerose piante, tra cui il mais (Zea mays) 10, carota (Daucus carota) 32, il pioppo (Popu...

Negli ultimi anni vi è stato significativo impulso posto sulla progettazione delle colture transgeniche per superare le varie malattie 1, dotare resistenza agli erbicidi 2, conferiscono alla siccità e 3,4 tolleranza al sale 5, prevenire erbivori 6, aumento della biomassa resa 7, e diminuire recalcitrance parete cellulare 8. Questa tendenza è stata aiutata dallo sviluppo di nuovi strumenti molecolari per la generazione di piante transgeniche, tra cui genoma di modifica utilizzando CRISPR e Talens 9, e silenziamento genico attraverso dsRNA 10, miRNA 11, e siRNA 12. Mentre queste tecnologie hanno semplificato la generazione di piante transgeniche, hanno anche creato un collo di bottiglia, dove il gran numero di piante transgeniche generate non possono essere sottoposti a screening con sistemi tradizionali che si basano sulla rigenerazione delle piante. In relazione a questo collo di bottiglia, mentre il silenziamento e del genoma di modifica costrutti possono essere rapidamente inseriti nelle piante, molte delletratti mirati riescono a produrre l&#39;effetto desiderato, che spesso non è scoperto fino piante sono analizzati nella serra. In questo lavoro, abbiamo messo a punto un metodo per la rapida automatizzato, lo screening, high-throughput di protoplasti vegetali, in particolare per affrontare il collo di bottiglia attuale screening precoce di un gran numero di genoma-editing e silenziamento genico obiettivi. L&#39;uso di protoplasti, al contrario di cellule vegetali intatte, ha diversi vantaggi per lo sviluppo di una piattaforma automatizzata. Innanzitutto, protoplasti sono isolati dopo la digestione della parete cellulare, e questo non è più presente barriera, efficienza di trasformazione è aumentato 13. In cellule vegetali intatte ci sono solo due metodi consolidati per la trasformazione, biolistics 14 e Agrobacterium mediata trasformazione 15. Nessuno di questi metodi può essere facilmente tradotto per piattaforme gestione di liquidi, come biolistics richiede attrezzature specializzate per Transformazioni, mentre Agrobacterium trasformazione mediata richiede co-cultura e la successiva rimozione dei batteri. Né sono suscettibili di metodi di high throughput. Nel caso di protoplasti, trasformazione viene normalmente condotta utilizzando polietilene glicole (PEG) trasfezione mediata 16, che richiede solo alcuni scambi soluzione, ed è particolarmente adatto per le piattaforme gestione dei liquidi. In secondo luogo, protoplasti, per definizione, sono culture monocellulari e quindi i problemi associati con formazione di grumi e catena di formazione in colture cellulari vegetali, non sono osservati in protoplasti. In termini di screening rapido utilizzando uno spettrofotometro piatto a base di aggregazione delle cellule, o cellule in piani multipli porterà a difficoltà di acquisire misurazioni coerenti. Poiché protoplasti sono anche più densa loro terreni di coltura, essi sedimentare sul fondo dei pozzetti, formando un monostrato, che è favorevole per spettrofotometria piastra base. Infine, mentre colture in sospensione di cellule vegetali sono Primarily derivati da callo 17, protoplasti possono essere raccolte da un certo numero di tessuti vegetali, portando alla capacità di identificare l&#39;espressione tessuto-specifica. Ad esempio, la capacità di analizzare root- o-specifico espressione foglia di un gene può essere molto importante fenotipo previsione. Per queste ragioni, i protocolli sviluppati in questo lavoro sono stati convalidati usando protoplasti isolati dal tabacco diffuso (Nicotiana tabacum L.) &#39;Bright Yellow&#39; 2 (BY-2) cultura sospensione. La coltura in sospensione BY-2 è stato descritto come la cella &quot;HeLa&quot; di piante superiori, grazie al suo uso diffuso in analisi molecolare di cellule vegetali 18. Recentemente, BY-2 le cellule sono state usate per studiare gli effetti delle piante di stress 19-22, la localizzazione della proteina intracellulare 23,24, e biologia cellulare di base 25-27 dimostrare l&#39;ampio programma di utilità di queste culture in biologia vegetale. Un ulteriore vantaggio di BY-2 culture è ilpossibilità di sincronizzare le culture con afidicolina, che può portare ad una maggiore riproducibilità per l&#39;espressione genica studia 28. Inoltre, sono stati sviluppati metodi per l&#39;estrazione di BY-2 protoplasti utilizzando enzimi basso costo 29,30, come enzimi tradizionalmente utilizzati per generare protoplasti sono costi proibitivi per i sistemi ad elevata capacità. Come tale, il protocollo descritto di seguito è stato convalidato utilizzando la coltura in sospensione BY-2, ma dovrebbe essere modificabile a qualsiasi coltura in sospensione delle cellule vegetali. Proof-of-concept esperimenti vengono eseguiti utilizzando un arancio proteina a fluorescenza (OFP) gene reporter (pporRFP) dalle Porites di corallo duro Porites 31 sotto il controllo del promotore CaMV 35S.

<table><tbody><tr><td>Orbitor RS Microplate mover</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bravo Liquid Handler</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Synergy H1 Multi-mode Reader</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MultiFlo FX Multi-mode Dispenser</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Teleshake</td><td>Inheco</td><td>3800048</td><td></td></tr><tr><td>CPAC Ultraflat Heater/cooler</td><td>Inheco</td><td>7000190</td><td></td></tr><tr><td>Vworks Automation Software</td><td>Agilent</td><td></td><td>Software used to control and write protocols for Agilent Bravo</td></tr><tr><td>Momentum Software</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Task scheduling software for controlling Orbiter RS</td></tr><tr><td>Liquid Handling Control 2.17 Software</td><td>Biotek</td><td></td><td>Software used to control and write protocols for MultiFlo FX</td></tr><tr><td>IX81 Inverted Microscope</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zyla 3-Tap microscope camera</td><td>Andor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ET-CY3/TRITC Filter Set</td><td>Chroma Technology Corp</td><td>49004</td><td></td></tr><tr><td>Rohament CL</td><td>AB Enzymes</td><td>sample bottle</td><td>low-cost cellulase</td></tr><tr><td>Rohapect UF</td><td>AB Enzymes</td><td>sample bottle</td><td>low-cost pectinase</td></tr><tr><td>Rohapect 10L</td><td>AB Enzymes</td><td>sample bottle</td><td>low-cost pectinase/arabinase</td></tr><tr><td>Linsmaier &amp;amp; Skoog Basal Medium</td><td>Phytotechnology Laboratories</td><td>L689</td><td></td></tr><tr><td>2,4-dichlorophenoxyacetic acid</td><td>Phytotechnology Laboratories</td><td>D295</td><td></td></tr><tr><td>propidium iodide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4170</td><td></td></tr><tr><td>Poly(ethylene glycol) 4000</td><td>Sigma Aldrich</td><td>95904-250G-F</td><td>Formerly Fluka PEG</td></tr><tr><td>Propidium Iodide</td><td>Fisher Scientific</td><td>25535-16-4</td><td>Acros Organics</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7902-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Acetate</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP333-500</td><td></td></tr><tr><td>Mannitol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1902-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Fisher Scientific</td><td>S5-3</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC424205000</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1767</td><td></td></tr><tr><td>Gelzan CM</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1910-250G</td><td></td></tr><tr><td>6-well plate</td><td>Thermo Scientific</td><td>103184</td><td></td></tr><tr><td>96-well 1.2 ml deep well plate</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-0564</td><td></td></tr><tr><td>96 well optical bottom plate</td><td>Thermo Scientific</td><td>165305</td><td></td></tr><tr><td>Finntip 1000 Wide bore Pipet tips</td><td>Thermo Scientific</td><td>9405 163</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-10</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4504-1KG</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC17259-5000</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>M33-500</td><td></td></tr></tbody></table>

a robotic platform for high-throughput protoplast isolation and transformation

Negli ultimi dieci anni c&#39;è stata una recrudescenza nell&#39;uso dei protoplasti vegetali che vanno da specie modello per ritagliare le specie, per l&#39;analisi di trasduzione del segnale, reti di regolazione trascrizionale, l&#39;espressione genica, del genoma-editing, e Gene-silenziamento. Inoltre, sono stati compiuti progressi significativi nella rigenerazione di piante da protoplasti, che ha generato ancor più interesse per l&#39;uso di tali sistemi per genomica vegetale. In questo lavoro, un protocollo è stato sviluppato per l&#39;automazione di isolamento protoplasti e trasformazione da 2 (BY-2) coltura in sospensione tabacco un &#39;giallo brillante&#39; utilizzando una piattaforma robotica. Le procedure di trasformazione sono stati convalidati usando un gene reporter proteina fluorescente arancione (OFP) (pporRFP) sotto il controllo del promotore cavolfiore mosaic virus 35S (35S). espressione OFP in protoplasti stata confermata mediante microscopia in epifluorescenza. Le analisi inclusi anche i metodi di efficienza di produzione di protoplasti utilizzando propidium ioduro. Infine, a basso costo enzimi per alimenti sono stati utilizzati per la procedura di isolamento di protoplasti, eludendo la necessità di enzimi di laboratorio di grado che sono un costo proibitivo in high-throughput automatizzato isolamento di protoplasti e di analisi. Basato sul protocollo sviluppato in questo lavoro, la procedura completa dall&#39;isolamento protoplasti di trasformazione può essere effettuata in meno di 4 ore, senza alcun intervento da parte dell&#39;operatore. Mentre il protocollo sviluppato in questo lavoro è stato convalidato con la coltura cellulare BY-2, le procedure ei metodi dovrebbero essere traducibile a qualsiasi / sistema di coltura in sospensione di protoplasti impianto, che dovrebbe consentire l&#39;accelerazione della ricerca genomica nel grano.

In questo studio, il tasso di raddoppio BY-2 varia dai 14-18 hr dipendente dalla temperatura alla quale sono stati incubati le culture, coerente con le precedenti relazioni di media durata del ciclo cellulare delle 15 ore. Con questo tasso raddoppio, 1: 100 inoculo di partenza è stato usato per iniziare culture, portando a culture con un volume imballato cellulare (PCV) del 50% in 5-7 giorni. Nel protocollo attuale, in cui le culture sono state coltivate in 200 ml di mezzi di comunicazi...

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A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation

Una metodologia high-throughput, la produzione di protoplasti di tabacco automatizzata e la trasformazione è descritto. Il sistema robotico consente l&#39;espressione genica massicciamente parallelo e la scoperta nel sistema modello BY-2 che dovrebbe essere traducibile di colture non-modello.

Una piattaforma robotica per high-throughput Protoplast Isolamento e Trasformazione

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Genetics

14.2K Views.  University of Tennessee, Knoxville.  Una metodologia high-throughput, la produzione di protoplasti di tabacco automatizzata e la trasformazione è descritto. Il sistema robotico consente l'espressione genica massicciamente parallelo e la scoperta nel sistema modello BY-2 che dovrebbe essere traducibile di colture non-modello. 

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High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

Systematic identification and characterization of genetic perturbations have proven useful to decipher gene function and cellular pathways. However, the conventional approaches of permanent gene deletion cannot be applied to essential genes. We have pioneered a unique collection of ~70 temperature-sensitive (ts) lethal mutants for studying cell cycle regulation in the unicellular green algae Chlamydomonas reinhardtii1. These mutations identify essential genes, and the ts alleles can be conditionally inactivated by temperature shift, providing valuable tools to identify and analyze essential functions. Mutant collections are much more valuable if they are close to comprehensive, since scattershot collections can miss important components. However, this requires the efficient collection of a large number of mutants, especially in a wide-target screen. Here, we describe a robotics-based pipeline for generating ts lethal mutants and analyzing their phenotype in Chlamydomonas. This technique can be applied to any microorganism that grows on agar. We have collected over 3000 ts mutants, probably including mutations in most or all cell-essential pathways, including about 200 new candidate cell cycle mutations. Subsequent molecular and cellular characterization of these mutants should provide new insights in plant cell biology; a comprehensive mutant collection is an essential prerequisite to ensure coverage of a broad range of biological pathways. These methods are integrated with downstream genetics and bioinformatics procedures for efficient mapping and identification of the causative mutations that are beyond the scope of this manuscript.

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

Temperature-sensitive (ts) lethal mutants are valuable tools to identify and analyze essential functions. Here we describe methods to generate and classify ts lethal mutants in high throughput.

High-throughput robotizzata Assisted Isolamento di sensibile alla temperatura letale Mutants in<em&gt; Reinhardtii Chlamydomonas</em

Systematic identification and characterization of genetic perturbations have proven useful to decipher gene function and cellular pathways. However, the ...

Ricerca

Genetica

A High-throughput Automated Platform for the Development of Manufacturing Cell Lines for Protein Therapeutics

The fast-growing biopharmaceutical industry demands speedy development of highly efficient and reliable production systems to meet the increasing requirement for drug supplies. The generation of production cell lines has traditionally involved manual operations that are labor-intensive, low-throughput and vulnerable to human errors. We report here an integrated high-throughput and automated platform for development of manufacturing cell lines for the production of protein therapeutics.
The combination of BD FACS Aria Cell Sorter, CloneSelect Imager and TECAN Freedom EVO liquid handling system has enabled a high-throughput and more efficient cell line development process. In this operation, production host cells are first transfected with an expression vector carrying the gene of interest 1, followed by the treatment with a selection agent. The stably-transfected cells are then stained with fluorescence-labeled anti-human IgG antibody, and are subsequently subject to flow cytometry analysis 2-4. Highly productive cells are selected based on fluorescence intensity and are isolated by single-cell sorting on a BD FACSAria. Colony formation from single-cell stage was detected microscopically and a series of time-laps digital images are taken by CloneSelect Imager for the documentation of cell line history. After single clones have formed, these clones were screened for productivity by ELISA performed on a TECAN Freedom EVO liquid handling system. Approximately 2,000 - 10,000 clones can be screened per operation cycle with the current system setup.
This integrated approach has been used to generate high producing Chinese hamster ovary (CHO) cell lines for the production of therapeutic monoclonal antibody (mAb) as well as their fusion proteins. With the aid of different types of detecting probes, the method can be used for developing other protein therapeutics or be applied to other production host systems. Comparing to the traditional manual procedure, this automated platform demonstrated advantages of significantly increased capacity, ensured clonality, traceability in cell line history with electronic documentation and much reduced opportunity in operator error.

A high-throughput, automated platform of manufacturing cell line development for producing protein therapeutics is described. Implementation of BD FACS Aria Cell Sorter, CloneSelect Imager and TECAN Freedom EVO liquid handling system has demonstrated significantly increased processing capacity in cell line development with improved cell line quality and high reproducibility.

A High-throughput piattaforma automatica per lo sviluppo di linee cellulari di produzione per Therapeutics Proteine

The fast-growing biopharmaceutical industry demands speedy development of highly efficient and reliable production systems to meet the increasing ...

Medicina

Studying Protein Import into Chloroplasts Using Protoplasts

The chloroplast is an essential organelle that is responsible for various cellular processes in plants, such as photosynthesis and the production of many secondary metabolites and lipids. Chloroplasts require a large number of proteins for these various physiological processes. Over 95% of chloroplast proteins are nucleus-encoded and imported into chloroplasts from the cytosol after translation on cytosolic ribosomes. Thus, the proper import or targeting of these nucleus-encoded chloroplast proteins to chloroplasts is essential for the proper functioning of chloroplasts as well as the plant cell. Nucleus-encoded chloroplast proteins contain signal sequences for specific targeting to chloroplasts. Molecular machinery localized to the chloroplast or cytosol recognize these signals and carry out the import process. To investigate the mechanisms of protein import or targeting to chloroplasts in vivo, we developed a rapid, efficient protoplast-based method to analyze protein import into chloroplasts of Arabidopsis. In this method, we use protoplasts isolated from leaf tissues of Arabidopsis. Here, we provide a detailed protocol for using protoplasts to investigate the mechanism by which proteins are imported into chloroplasts.

Here we describe a protocol to express proteins into protoplasts by using PEG-mediated transformation method. The method provides easy expression of proteins of interest, and efficient investigation of protein localization and the import process for various experimental conditions in vivo.

Lo studio di proteine importazione in cloroplasti utilizzando protoplasti

The chloroplast is an essential organelle that is responsible for various cellular processes in plants, such as photosynthesis and the production of many ...

Biochimica

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental stimuli in any multicellular organism. In situ hybridization and reporter gene visualization can to a limited extent be used to this end but for high resolution quantitative RT-PCR or high-throughput transcriptome-wide analysis the isolation of RNA from particular cell types is requisite. Cellular dissociation of tissue expressing a fluorescent protein marker in a specific cell type and subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) makes it possible to collect sufficient amounts of material for RNA extraction, cDNA synthesis/amplification and microarray analysis.
An extensive set of cell type-specific fluorescent reporter lines is available to the plant research community. In this case, two marker lines of the Arabidopsis thaliana root are used: PSCR::GFP (endodermis and quiescent center) and PWOX5::GFP (quiescent center). Large numbers (thousands) of seedlings are grown hydroponically or on agar plates and harvested to obtain enough root material for further analysis. Cellular dissociation of plant material is achieved by enzymatic digestion of the cell wall. This procedure makes use of high osmolarity-induced plasmolysis and commercially available cellulases, pectinases and hemicellulases to release protoplasts into solution.
FACS of GFP-positive cells makes use of the visualization of the green versus the red emission spectra of protoplasts excited by a 488 nm laser. GFP-positive protoplasts can be distinguished by their increased ratio of green to red emission. Protoplasts are typically sorted directly into RNA extraction buffer and stored for further processing at a later time.
This technique is revealed to be straightforward and practicable. Furthermore, it is shown that it can be used without difficulty to isolate sufficient numbers of cells for transcriptome analysis, even for very scarce cell types (e.g. quiescent center cells). Lastly, a growth setup for Arabidopsis seedlings is demonstrated that enables uncomplicated treatment of the plants prior to cell sorting (e.g. for the cell type-specific analysis of biotic or abiotic stress responses). Potential supplementary uses for FACS of plant protoplasts are discussed.

A method for isolating specific cell types from plant material is demonstrated. This technique employs transgenic marker lines expressing fluorescent proteins in particular cell types, cellular dissociation and Fluorescence Activated Cell Sorting. Additionally, a growth setup is established here that facilitates treatment of Arabidopsis thaliana seedlings prior to cell sorting.

Fluorescenza separazione delle cellule attivate delle protoplasti impianto

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

Biologia

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.

Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.

Una piattaforma Microfluidic per l&#39;isolamento Single-cell high-throughput e cultura

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Bioingegneria

Automated Robotic Liquid Handling Assembly of Modular DNA Devices

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; represented by &#34;devices&#34; created as combinations of individual genetic components. However, manual assembly of such large numbers of devices is time-intensive, error-prone, and costly. The increasing sophistication and scale of synthetic biology research necessitates an efficient, reproducible way to accommodate large-scale, complex, and high throughput device construction.
Here, a DNA assembly protocol using the Type-IIS restriction endonuclease based Modular Cloning (MoClo) technique is automated on two liquid-handling robotic platforms. Automated liquid-handling robots require careful, often times tedious optimization of pipetting parameters for liquids of different viscosities (e.g. enzymes, DNA, water, buffers), as well as explicit programming to ensure correct aspiration and dispensing of DNA parts and reagents. This makes manual script writing for complex assemblies just as problematic as manual DNA assembly, and necessitates a software tool that can automate script generation. To this end, we have developed a web-based software tool, http://mocloassembly.com, for generating combinatorial DNA device libraries from basic DNA parts uploaded as Genbank files. We provide access to the tool, and an export file from our liquid handler software which includes optimized liquid classes, labware parameters, and deck layout. All DNA parts used are available through Addgene, and their digital maps can be accessed via the Boston University BDC ICE Registry. Together, these elements provide a foundation for other organizations to automate modular cloning experiments and similar protocols.
The automated DNA assembly workflow presented here enables the repeatable, automated, high-throughput production of DNA devices, and reduces the risk of human error arising from repetitive manual pipetting. Sequencing data show the automated DNA assembly reactions generated from this workflow are ~95% correct and require as little as 4% as much hands-on time, compared to manual reaction preparation.

Here, an automated workflow to perform modular DNA &#34;device&#34; assembly using a modular cloning DNA assembly method on liquid-handling robots is presented. The protocol uses an intuitive software tool for generating liquid handler picklists for combinatorial DNA device library generation, which we demonstrate using two liquid handling platforms.

Automatizzato robot Liquid Handling Assembly di dispositivi modulari del DNA

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; ...

Efficient Polyethylene Glycol (PEG) Mediated Transformation of the Moss Physcomitrella patens

A simple and efficient method to transform Physcomitrella pantens protoplasts is described. This method is adapted from protocols for Physocmitrella protonemal protoplast and Arabidopsis mesophyll protoplast transformation1. Due to its capacity to undergo efficient mitotic homologous recombination, Physcomitrella patens has emerged as an important model system in recent years2. This capacity allows high frequencies of gene targeting3-9, which is not seen in other model plants such as Arabidopsis. To take full advantage of this system, we need an effective and easy method to deliver DNA into moss cells. The most common ways to transform this moss are particle bombardment10 and PEG-mediated DNA uptake11. Although particle bombardment can produce a high transformation efficiency12, gene guns are not readily available to many laboratories and the protocol is difficult to standardize. On the other hand, PEG mediated transformation does not require specialized equipments, and can be performed in any laboratory with a sterile hood. Here, we show a simple and highly efficient method for transformation of moss protoplasts. This method can generate more than 120 transient transformants per microgram of DNA, which is an improvement from the most efficient protocol previously reported13. Because of its simplicity, efficiency, and reproducibility, this method can be applied to projects requiring large number of transformants as well as for routine transformation.

Efficient Polyethylene Glycol PEG Mediated Transformation of the Moss Physcomitrella patens

A simple and efficient method to transform Physcomitrella pantens protoplasts is described. This method is adapted from protocols for Physocmitrella protonemal protoplast and Arabidopsis mesophyll protoplast transformation1.

Efficiente polietilene glicole (PEG) Trasformazione mediata della Moss Physcomitrella patene</em

A simple and efficient method to transform Physcomitrella pantens protoplasts is described. This method is adapted from protocols for Physocmitrella ...

High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, including those with direct relevance to human disease. Because of its short generation time and well-characterized genome, a major experimental advantage of the yeast model system is the ability to perform genetic screens to identify genes and pathways that are involved in a given process. Over the last thirty years such genetic screens have been used to elucidate the cell cycle, secretory pathway, and many more highly conserved aspects of eukaryotic cell biology 1-5. In the last few years, several genomewide libraries of yeast strains and plasmids have been generated 6-10. These collections now allow for the systematic interrogation of gene function using gain- and loss-of-function approaches 11-16. Here we provide a detailed protocol for the use of a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot to perform a plasmid overexpression screen, using an arrayed library of 5,500 yeast plasmids. We have been using these screens to identify genetic modifiers of toxicity associated with the accumulation of aggregation-prone human neurodegenerative disease proteins. The methods presented here are readily adaptable to the study of other cellular phenotypes of interest.

Here we describe a plasmid overexpression screen in Saccharomyces cerevisiae, using an arrayed plasmid library and a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot.

High-throughput iperespressione schermo lievito plasmidi

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, ...

A Simple Method for Isolation of Soybean Protoplasts and Application to Transient Gene Expression Analyses

Soybean (Glycine max (L.) Merr.) is an important crop species and has become a legume model for the studies of genetic and biochemical pathways. Therefore, it is important to establish an efficient transient gene expression system in soybean. Here, we report a simple protocol for the preparation of soybean protoplasts and its application for transient functional analyses. We found that young unifoliate leaves from soybean seedlings resulted in large quantities of high quality protoplasts. By optimizing a PEG-calcium-mediated transformation method, we achieved high transformation efficiency using soybean unifoliate protoplasts. This system provides an efficient and versatile model for examination of complex regulatory and signaling mechanisms in live soybean cells and may help to better understand diverse cellular, developmental and physiological processes of legumes.

We developed a simple and efficient protocol for the preparation of large quantities of soybean protoplasts to study complex regulatory and signaling mechanisms in live cells.

Un metodo semplice per l'isolamento di protoplasti di soia e l'applicazione di analisi di espressione genica transitoria

Soybean (Glycine max (L.) Merr.) is an important crop species and has become a legume model for the studies of genetic and biochemical pathways. ...

Scalable Transfection of Maize Mesophyll Protoplasts

The transfection of maize mesophyll cells often involves digesting the plant cell walls to create protoplasts and then inserting DNA via electroporation or polyethylene glycol (PEG). Previous methods were developed to produce tens of thousands of transfected protoplasts at once. Here,&#160;we describe a straightforward method to isolate and transfect millions of leaf mesophyll protoplasts in maize (Zea mays L.). This streamlined process removes certain common protoplasting steps, such as washing in W5. Additionally, steps such as centrifugation, PEG-mediated transfection, and incubation have been modified to work with a greater number of protoplasts. The ability to express large libraries of plasmid constructs enables genome-scale experiments, such as massively parallel reporter assays in maize.

Here, we present a high-throughput protocol to transiently transfect millions of maize protoplasts for testing large libraries of plasmids in maize mesophyll cells.

Trasfezione scalabile dei protoplasti mesofilli di mais

The transfection of maize mesophyll cells often involves digesting the plant cell walls to create protoplasts and then inserting DNA via electroporation ...

Una piattaforma robotica per high-throughput Protoplast Isolamento e Trasformazione

Riepilogo

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High-throughput robotizzata Assisted Isolamento di sensibile alla temperatura letale Mutants in