עבודה זו נתמכה על ידי צמח הגנום תוכנית מחקר של הקרן הלאומית למדע (NSF-PGRP-IOS-1339388).

1. הגידול של הצמחים
<ol><li>לזרוע זרעי סויה 5-10 (82 וויליאמס) בתוך סיר 13 ס מ בחממה בתנאים היום (16 h אור 1,500 µmol m s-2 -1) 25 ° c-תערובת אדמה מותאם אישית עבור סויה (1:1:1 יחס של חול אדמה, פרליט, טורפדו).</li>
</ol>2. הכנת פלסמיד דנ א
<ol><li>באמצעות פיפטה סטרילי עצה או קיסם, בחר שמושבה בודדת או גליצרול קפואים מלאי של e. coli נושאת את פלסמיד המכיל את הגן עניין, לחסן אותו 20 מ"ל לוריא-Bertani (LB) בינוני נוזלי באנטיביוטיקה המתאימה בבקבוקון 50 מ.</li>
	<li>דגירה. הבקבוק ב- 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה על מטרף. לאסוף את החיידקים על ידי צריך שתוציאו את המתלים ב g x 12,000 בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות ומחיקת את תגובת שיקוע. תמצית ולטהר את פלסמיד הליך של היצרן של ערכת ההכנה פלסמיד.</li>
</ol>3. פרוטופלאסט בידוד
<ol><li>חותכים את העלים unifoliate שהורחבו זה מכבר מן סויה 10 - בן יום שתילים (איור 1). הערה: מבחר עלים בשלב ההתפתחותי המתאים הוא המפתח להצלחת להכנה פרוטופלאסט סויה. השתמש רק עלים רק מורחב בשלבים התפתחותיים מוקדם. עלים בוגרים, קירות התא להיות קשה יותר לעיכול.</li>
	<li>עם סכין גילוח טריים, הסר את midrib עלה unifoliate ולאחר מכן לחתוך השאריות לתוך 0.5-1 מ מ רצועות. הערה: שני עלים unifoliate מתעכל 10 מ ל תמיסת האנזים ייתן protoplasts מספיק להמרות יותר מ-10.</li>
	<li>העלה באמצעות זוג מלקחיים, העברת רצועות מיידית ובעדינות לתוך 10 מ"ל של אנזים הטרי פתרון (טבלה 1) צינור 15 מ"ל. לחדור ואקום העלה רצועות למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>דגירה את רצועות עלה בהפתרון האנזים עם עצבנות עדין (40 סל ד) תחת אור נמוכה עבור 4-6 שעות בטמפרטורת החדר. ודא כי הפתרון האנזים הופך צהוב, ירוק כמו protoplasts משתחררים. בדוק את הפתרון אנזים/protoplasts תחת המיקרוסקופ (X10). הערה: protoplasts שפורסמו הם כדורי בצורת, בעוד תאי מעוכל בצורה לא סדירה או אליפסה.</li>
	<li>להעביר את 10 מ ל אנזים/פרוטופלאסט פתרון בשפופרת 50 מ על ידי לשפוך בעדינות ולהוסיף 10 מ"ל של W5 פתרון (טבלה 1) בטמפרטורת החדר כדי לעצור את העיכול. בעדינות היפוך הצינור כמה פעמים. יוצקים בעדינות את הפתרון אנזים/protoplasts על רשת ניילון נקייה 75 מיקרומטר להציב על גבי צינור 50 מ ל להסיר רקמות עלים מעוכל.</li>
	<li>Centrifuge הפתרון זרימה דרך האנזים/protoplasts ב g x 100 לשפופרת 50 מ ל 1-2 דקות בטמפרטורת החדר. הסר בעדינות את תגובת שיקוע באמצעות פיפטה סרולוגית 10 מ ל מבלי להפריע בגדר פרוטופלאסט.</li>
	<li>Resuspend את protoplasts ו לדלל את ריכוז של 2 x 105 מ ל-1 בפתרון W5 צוננת ב 4 ° C על ידי ספירת מספר פרוטופלאסט hemacytometer תחת המיקרוסקופ (x10). שמור את protoplasts על קרח למשך 30 דקות.</li>
	<li>Centrifuge את המתלים ב g x 100 למשך 1-2 דקות בטמפרטורת החדר ולהסיר בעדינות את הפתרון W5 באמצעות פיפטה 1 מ"ל מבלי להפריע בגדר פרוטופלאסט. Resuspend את protoplasts בתמיסה MMG (טבלה 1)-ריכוז של 2 x 105 מ ל-1 בטמפרטורת החדר.</li>
</ol>4. פרוטופלאסט טרנספורמציה
<ol><li>להפוך 100 aliquots µL של protoplasts (protoplasts4 עונה 2 פרק 10-2 x 105 מ ל-1) 1.5 מ ל נמוכה אדהזיה microcentrifuge צינורות באמצעות טיפים פיפטה µL 200 נימולים. לשים אחד aliquot הצידה כדי לשמש בקרה שלילית. להוסיף 10 µL של פלסמיד (10-20 µg) לתוך כל אחד aliquot יתר של protoplasts.</li>
	<li>לאט לאט להוסיף µL 110 של פג הטרי פתרון (טבלה 1) על הקיר הפנימי של הצינור microcentrifuge 1.5 mL, ואז בעדינות היפוך, סובב את הצינורית עד הפתרון הופכת הומוגנית.</li>
	<li>דגירה התערובת שינוי בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.</li>
	<li>כדי לעצור את השינוי, לאט להוסיף 400 µL של פתרון W5 הצינור 1.5 mL בטמפרטורת החדר, היפוך בעדינות את הצינורית עד הפתרון הופך הומוגנית. Centrifuge את הצינור ב- 100 גרם עבור 1-2 דקות בטמפרטורת החדר וזורקים את תגובת שיקוע באמצעות פיפטה.</li>
	<li>להוסיף 1 מ"ל של פתרון אינטרנט (טבלה 1) הצינור, resuspend על ידי בעדינות pipetting 1 - 2 פעמים. להוסיף 1 מ"ל של נסיוב עגל סטרילי (vol/כרך) 5% כל טוב של צלחת תרביות רקמה 6-ובכן מעיל השטח ולמנוע את protoplasts מפני לצלחת.</li>
	<li>לאחר מספר שניות, למחוק את הנסיוב עגל באמצעות פיפטה. להעביר את protoplasts resuspended לבאר של צלחת תרבות. מכסים את הצלחת עם מכסה.</li>
</ol>5. פרוטופלאסט הדגירה והקציר
<ol><li>תקופת דגירה של protoplasts בטמפרטורת החדר של 1-2 ימים בחושך. הערה: מצאנו כי שני ימי דגירה התשואות באופן כללי לעומת יום אחד הדגירה האות החזק של חלבון פלואורסצנטי, כי האות חלבון פלואורסצנטי עשוי להימשך עד 3-4 ימים.</li>
	<li>להעביר את הפתרון פרוטופלאסט צינור microcentrifuge 1.5 mL אדהזיה נמוכה. Centrifuge את הצינור ב g x 100 למשך 1-2 דקות בטמפרטורת החדר למסוק protoplasts. הסר את תגובת שיקוע באמצעות פיפטה ולהעביר protoplasts 10 µL על זכוכית.</li>
	<li>להתבונן אות ניאון תחת זריחה או מיקרוסקופיה קונפוקלית. להשתמש protoplasts הפך ללא שליטה שלילי (אין אות להתייחס).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Melchers, G., Labib, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+hybridisation+of+plants+by+fusion+of+protoplasts.">Somatic hybridisation of plants by fusion of protoplasts.</a> Mol. Gen. Genet. 135 (4), 277-294 (1974).</li><li>Gresshoff, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+culture+of+white+clover:+callus,+suspension,+protoplast+culture,+and+plant+regeneration.">In vitro culture of white clover: callus, suspension, protoplast culture, and plant regeneration.</a> Bot. Gaz. 141 (2), 157-164 (1980).</li><li>L&#246;rz, H., Baker, B., Schell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+to+cereal+cells+mediated+by+protoplast+transformation.">Gene transfer to cereal cells mediated by protoplast transformation.</a> Mol. Gen. Genet. 199 (2), 178-182 (1985).</li><li>Hayashimoto, A., Li, Z., Murai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+polyethylene+glycol-mediated+protoplast+transformation+system+for+production+of+fertile+transgenic+rice+plants.">A polyethylene glycol-mediated protoplast transformation system for production of fertile transgenic rice plants.</a> Plant Physiol. 93 (3), 857-863 (1990).</li><li>Koop, H. -. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+foreign+sequences+into+the+tobacco+plastome+via+polyethylene+glycol-mediated+protoplast+transformation.">Integration of foreign sequences into the tobacco plastome via polyethylene glycol-mediated protoplast transformation.</a> Planta. 199 (2), 193-201 (1996).</li><li>Hrazdina, G., Wagner, G. J., Siegelman, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+localization+of+enzymes+of+anthocyanin+biosynthesis+in+protoplasts.">Subcellular localization of enzymes of anthocyanin biosynthesis in protoplasts.</a> Phytochemistry. 17 (1), 53-56 (1978).</li><li>Lin, W., Wittenbach, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+localization+of+proteases+in+wheat+and+corn+mesophyll+protoplasts.">Subcellular localization of proteases in wheat and corn mesophyll protoplasts.</a> Plant Physiol. 67 (5), 969-972 (1981).</li><li>V&#246;geli-Lange, R., Wagner, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+localization+of+cadmium+and+cadmium-binding+peptides+in+tobacco+leaves.">Subcellular localization of cadmium and cadmium-binding peptides in tobacco leaves.</a> Plant Physiol. 92 (4), 1086-1093 (1990).</li><li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+efficient+transient+protoplast+system+for+analyzing+defence+gene+expression+and+protein-protein+interactions+in+rice.">A highly efficient transient protoplast system for analyzing defence gene expression and protein-protein interactions in rice.</a> Mol. Plant Pathol. 7 (5), 417-427 (2006).</li><li>Wu, F. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tape-Arabidopsis+Sandwich-a+simpler+Arabidopsis+protoplast+isolation+method.">Tape-Arabidopsis Sandwich-a simpler Arabidopsis protoplast isolation method.</a> Plant methods. 5 (1), 16 (2009).</li><li>Christensen, A. H., Sharrock, R. A., Quail, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maize+polyubiquitin+genes:+structure,+thermal+perturbation+of+expression+and+transcript+splicing,+and+promoter+activity+following+transfer+to+protoplasts+by+electroporation.">Maize polyubiquitin genes: structure, thermal perturbation of expression and transcript splicing, and promoter activity following transfer to protoplasts by electroporation.</a> Plant Mol. Biol. 18 (4), 675-689 (1992).</li><li>Marcotte, W. R., Bayley, C. C., Quatrano, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+a+wheat+promoter+by+abscisic+acid+in+rice+protoplasts.">Regulation of a wheat promoter by abscisic acid in rice protoplasts.</a> Nature. 335 (6189), 454-457 (1988).</li><li>Dron, M., Clouse, S. D., Dixon, R. A., Lawton, M. A., Lamb, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutathione+and+fungal+elicitor+regulation+of+a+plant+defense+gene+promoter+in+electroporated+protoplasts.">Glutathione and fungal elicitor regulation of a plant defense gene promoter in electroporated protoplasts.</a> P. Natl. A. Sci. USA. 85 (18), 6738-6742 (1988).</li><li>Cocking, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+isolation+of+plant+protoplasts+and+vacuoles.">A method for the isolation of plant protoplasts and vacuoles.</a> Nature. 187 (4741), 962-963 (1960).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+rice+plants+produced+by+electroporation-mediated+plasmid+uptake+into+protoplasts.">Transgenic rice plants produced by electroporation-mediated plasmid uptake into protoplasts.</a> Plant Cell Rep. 7 (6), 379-384 (1988).</li><li>Fromm, M., Taylor, L. P., Walbot, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+genes+transferred+into+monocot+and+dicot+plant+cells+by+electroporation.">Expression of genes transferred into monocot and dicot plant cells by electroporation.</a> P. Natl. A. Sci. USA. 82 (17), 5824-5828 (1985).</li><li>Crossway, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+foreign+DNA+following+microinjection+of+tobacco+mesophyll+protoplasts.">Integration of foreign DNA following microinjection of tobacco mesophyll protoplasts.</a> Mol. Gen. Genet. 202 (2), 179-185 (1986).</li><li>Holm, P. B., Olsen, O., Schnorf, M., Brinch-Pedersen, H., Knudsen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+barley+by+microinjection+into+isolated+zygote+protoplasts.">Transformation of barley by microinjection into isolated zygote protoplasts.</a> Transgenic Res. 9 (1), 21-32 (2000).</li><li>Schapire, A. L., Lois, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+and+rapid+method+for+the+isolation+and+transfection+of+Arabidopsis+leaf+mesophyll+protoplasts+for+large-scale+applications.">A simplified and rapid method for the isolation and transfection of Arabidopsis leaf mesophyll protoplasts for large-scale applications.</a> Plant Signal Transduction: Methods and Protocols. 1363, 79-88 (2016).</li><li>Niedz, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+somatic+embryos+from+sweet+orange+(C.+sinensis)+protoplasts+using+semi-permeable+membranes.">Regeneration of somatic embryos from sweet orange (C. sinensis) protoplasts using semi-permeable membranes.</a> Plant Cell Tiss. Org. Cult. 84 (3), 353-357 (2006).</li><li>Sheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protoplast+isolation+and+plant+regeneration+of+different+doubled+haploid+lines+of+cauliflower+(Brassica+oleracea+var.+botrytis).">Protoplast isolation and plant regeneration of different doubled haploid lines of cauliflower (Brassica oleracea var. botrytis).</a> Plant Cell Tiss. Org. 107 (3), 513-520 (2011).</li><li>Grun, P., Chu, L. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+plants+from+protoplasts+of+Solanum+(Solanaceae).">Development of plants from protoplasts of Solanum (Solanaceae).</a> Am. J. Bot. 65 (5), 538-543 (1978).</li><li>Davey, M. R., Anthony, P., Power, J. B., Lowe, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+protoplasts:+status+and+biotechnological+perspectives.">Plant protoplasts: status and biotechnological perspectives.</a> Biotechnol. Adv. 23 (2), 131-171 (2005).</li><li>Pitzschke, A., Persak, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poinsettia+protoplasts-a+simple,+robust+and+efficient+system+for+transient+gene+expression+studies.">Poinsettia protoplasts-a simple, robust and efficient system for transient gene expression studies.</a> Plant methods. 8 (1), 14 (2012).</li><li>Yoo, S. -. D., Cho, Y. -. H., Sheen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+mesophyll+protoplasts:+a+versatile+cell+system+for+transient+gene+expression+analysis.">Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis.</a> Nat. Protoc. 2 (7), 1565 (2007).</li><li>Sedivy, E. J., Wu, F., Hanzawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soybean+domestication:+the+origin,+genetic+architecture+and+molecular+bases.">Soybean domestication: the origin, genetic architecture and molecular bases.</a> New Phytol. 214 (2), 539-553 (2017).</li><li>Yang, Y., Li, R., Qi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+analysis+of+plant+promoters+and+transcription+factors+by+agroinfiltration+of+tobacco+leaves.">In vivo analysis of plant promoters and transcription factors by agroinfiltration of tobacco leaves.</a> Plant J. 22 (6), 543-551 (2000).</li><li>Marion, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+analysis+of+protein+subcellular+localization+and+interaction+using+high-throughput+transient+transformation+of+Arabidopsis+seedlings.">Systematic analysis of protein subcellular localization and interaction using high-throughput transient transformation of Arabidopsis seedlings.</a> Plant J. 56 (1), 169-179 (2008).</li><li>Wu, H. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AGROBEST:+an+efficient+Agrobacterium-mediated+transient+expression+method+for+versatile+gene+function+analyses+in+Arabidopsis+seedlings.">AGROBEST: an efficient Agrobacterium-mediated transient expression method for versatile gene function analyses in Arabidopsis seedlings.</a> Plant methods. 10 (1), 19 (2014).</li><li>Govindarajulu, M., Elmore, J. M., Fester, T., Taylor, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+constitutive+viral+promoters+in+transgenic+soybean+roots+and+nodules.">Evaluation of constitutive viral promoters in transgenic soybean roots and nodules.</a> Mol Plant Pathol. 21 (8), 1027-1035 (2008).</li><li>Nagamatsu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+soybean+genes+involved+in+flavonoid+biosynthesis+by+virus-induced+gene+silencing.">Functional analysis of soybean genes involved in flavonoid biosynthesis by virus-induced gene silencing.</a> Plant Biotechnol. J. 5 (6), 778-790 (2007).</li><li>Juvale, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+and+spatial+Bean+pod+mottle+virus-induced+gene+silencing+in+soybean.">Temporal and spatial Bean pod mottle virus-induced gene silencing in soybean.</a> Mol. Plant Pathol. 13 (9), 1140-1148 (2012).</li><li>Zhang, C., Bradshaw, J. D., Whitham, S. A., Hill, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+an+efficient+multipurpose+bean+pod+mottle+virus+viral+vector+set+for+foreign+gene+expression+and+RNA+silencing.">The development of an efficient multipurpose bean pod mottle virus viral vector set for foreign gene expression and RNA silencing.</a> Plant Physiol. 153 (1), 52-65 (2010).</li><li>Lin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mesophyll+protoplasts+from+mature+leaves+of+soybeans.">Isolation of mesophyll protoplasts from mature leaves of soybeans.</a> Plant Physiol. 73 (4), 1067-1069 (1983).</li><li>Yi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-repeat+MYB+transcription+factor,+GmMYB176,+regulates+CHS8+gene+expression+and+affects+isoflavonoid+biosynthesis+in+soybean.">A single-repeat MYB transcription factor, GmMYB176, regulates CHS8 gene expression and affects isoflavonoid biosynthesis in soybean.</a> Plant J. 62 (6), 1019-1034 (2010).</li><li>Faria, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NAC+domain-containing+protein,+GmNAC6,+is+a+downstream+component+of+the+ER+stress-and+osmotic+stress-induced+NRP-mediated+cell-death+signaling+pathway.">The NAC domain-containing protein, GmNAC6, is a downstream component of the ER stress-and osmotic stress-induced NRP-mediated cell-death signaling pathway.</a> BMC Plant Biol. 11 (1), 129 (2011).</li><li>Kidokoro, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soybean+DREB1/CBF-type+transcription+factors+function+in+heat+and+drought+as+well+as+cold+stress-responsive+gene+expression.">Soybean DREB1/CBF-type transcription factors function in heat and drought as well as cold stress-responsive gene expression.</a> Plant J. 81 (3), 505-518 (2015).</li><li>Sun, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+mutagenesis+in+soybean+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Targeted mutagenesis in soybean using the CRISPR-Cas9 system.</a> Sci Rep-UK. 5, 10342 (2015).</li><li>Karimi, M., Inz&#233;, D., Depicker, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GATEWAY&#8482;+vectors+for+Agrobacterium-mediated+plant+transformation.">GATEWAY&#8482; vectors for Agrobacterium-mediated plant transformation.</a> Trends Plant Sci. 7 (5), 193-195 (2002).</li><li>Xia, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positional+cloning+and+characterization+reveal+the+molecular+basis+for+soybean+maturity+locus+E1+that+regulates+photoperiodic+flowering.">Positional cloning and characterization reveal the molecular basis for soybean maturity locus E1 that regulates photoperiodic flowering.</a> P. Natl. A. Sci. USA. 109 (32), E2155-E2164 (2012).</li></ol>

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

פרוטוקול זה עבור בידודו של סויה protoplasts לבין היישום ללימודים ביטוי ארעית נבדק ביסודיות, עובד טוב מאוד במעבדה שלנו. ההליכים הם פשוט וקל, דורשת ציוד רגיל, עלות מינימלית. פרוטוקול שלנו מניב כמויות גדולות של protoplasts איכותי אחיד לעומת שיטות שדווחה בעבר34,35,36,37,38. עם זאת, מאז, ישנם גורמים רבים המשפיעים על התשואות פרוטופלאסט וקצבי טרנספורמציה מומלץ לחוקרים למטב את התנאים לפי תנאי הניסוי שלהם, רצוי תוצאות החומרים שנעשה בהם שימוש. בעוד מערכת זו הוא מאוד שימושי עבור בחינת תקינה מיידית ואירועים הביוכימי בתאי צמח, היא לא מתאימה להשגחה של תהליכים תאיים לטווח ארוך ואת האירועים המתרחשים רקמות או רמות organismal.
מצאנו כי הבחירה נמרצות גידול צמח חומרי בשלב התפתחותי אידיאלי היה הגורם המכריע ביותר בהכנת פרוטופלאסט סויה. היא קובעת לא רק תשואות של protoplasts, אבל איכות המשפיעה על שינוי ה-DNA עוקבות. חשוב תמיד לגדל צמחים סויה בסביבה קבוע מן הלחץ, כגון הבצורת, הצפה, טמפרטורות קיצוניות או מזיקים. הגבוהה פרוטופלאסט התשואה וטרנספורמציה היעילות יכולה להיות מושגת באמצעות עלים unifoliate רק המורחב של השתילים. למתחילים, הוא הציע להשתמש עלים unifoliate בשלבים התפתחותיים שונים ולעשות השוואה כדי להשיג את התוצאות הטובות ביותר.
פרוטופלאסט/DNA יחס הוא גורם חשוב עבור יעילות אופטימלית טרנספורמציה. מומלץ בדרך כלל להתחיל עם היחס של 2 x 104 protoplasts/10-20 µg ה-DNA, אבל אופטימיזציה של היחס על מבנים בודדים מומלצת25. השימוש באיכות גבוהה DNA מתקבל על ידי ערכת טיהור DNA מומלץ מאוד.
הבחירה של וקטורים להבעה ארעית protoplasts, מספר גבוה-העתק ווקטורים בגודל קטן עדיפים בדרך כלל. למרות בינארי המומנט עבור Agrobacterium tumefaciens-שינוי בתיווך של צמחים יכול לשמש לשינוי פרוטופלאסט, גודלו של וקטורים אלה עלול לגרום פחות יעילות אופטימלית טרנספורמציה. ביטוי חלבון ה-GFP-fusion, אנו משתמשים בדרך כלל הווקטורים לא ניחנת סמן הבחירה ובכך קטן יחסית צמחים והם (6-7 קילו), כגון p2GWF7 ו- p2FGW739 (https://gateway.psb.ugent.be).
וקטורים מרובים יכול לשמש כדי להפוך protoplasts בו זמנית. . הייתה לנו הצלחה לבטא BiFC וקטורים לבדיקת אינטראקציות חלבון-חלבון, כמו גם מספר חלבונים פלורסנט אברון, תיוג subcellular ב protoplasts סויה... יתר על כן, פשטות, תשואות גדולות בשיטה שלנו מציעה מערכת אידיאלית עבור בחינת רגולטוריות ואירועים הביוכימי, פילוח ג'ין עיצוב וקטור, בידוד של transiently ביטוי החלבונים, החלבונים, ולטיהור ספציפי אברון כמו גרעינים, הפעלת יישומים נוספים המתעוררים גנומית, פרוטיאומיה מבנית מתקרב.

Protoplasts הם תאי הצמח יש קירות התא הוסר. ככל שישמרו על רוב תכונות ופעילויות של תאי צמחים, protoplasts הם מערכת מודל טוב להתבונן ולהעריך מגוון אירועים הסלולר, הם כלי רב ערך מחקר סומאטית hybridisation1 ולשתול התחדשות2. Protoplasts כבר נעזרו גם נרחב צמח טרנספורמציה3,4,5, שכן קירות התא אחרת לחסום את המעבר של ה-DNA בתא. Protoplasts מחזיקים חלק התגובות הפיזיולוגיות, תהליכים תאיים של צמחים שלמים, ולכן מציע ערך יסוד במחקר בסיסי ללמוד חלבון subcellular לוקליזציה6,7,8, 9,אינטראקציות חלבון-חלבון10ויזם פעילות11,12,13 חיים תאים.
בידודו של צמח protoplasts דווחה לראשונה בשנת 196014 , הפרוטוקולים עבור בידוד והן טרנספורמציה של protoplasts יש פותחה, אופטימיזציה. תהליך סטנדרטי של בידוד פרוטופלאסט כרוך החיתוך של עלים עיכול אנזימטי של קירות התא, ולאחריה הפרדת protoplasts המשוחררים פסולת רקמות שאינו מתעכל. אסטרטגיות שינוי כולל אלקטרופורציה15,16,17,microinjection18ושיטות מבוסס-פוליאתילן גליקול (PEG)4,5,19 . מגוון רחב של מינים דווחו מוצלחת פרוטופלאסט בידוד, כולל הדרים20, כרוב21, סולניים22 ו23,משפחות אחרות צמח נוי24. בעוד סוגי רקמות מגוונות משמשים במינים שונים, מערכת של ביטוי ארעי תודרנית פרוטופלאסט mesophyll (TEAMP) מבודד מן העלים של צמח מודל תודרנית לבנה כבר וותיקה25 אומץ באופן נרחב ליישומים מגוונים.
סויה (מקסימום גליצין (ל') עליזה משחק.) הוא אחד של חלבון חשוב ביותר, שמן גידולי26. בניגוד תודרנית , אורז, קבלת הצמחים הטרנסגניים סויה ידועה להיות קשה למדי ויעילות הנמוכה. Agrobacterium tumefaciens-חדירה בתיווך העממי שימש במשך הלימודים ביטוי גנים ארעי התאים באפידרמיס טבק27 שתילים תודרנית28,29, ואילו Agrobacterium rhizogenes שימש במשך טרנספורמציה של שורשים שעירים סויה30. גישות שתיקה הנוצרות על-ידי וירוס הגן כבר נעזרו downregulation של היעד גנים31,32 ו ארעי ביטוי33 באופן מערכתי. Protoplasts לספק אלטרנטיבה יקר ופסיביות הגישות האלה. Protoplasts ניתן להשיג חומרים מעל פני הקרקע של סויה ומאפשרים ביטוי transgene מהירה ומסונכרן. עם זאת, הבידוד מוצלח הראשונית של סויה protoplasts בשנת 198334, מאז דוחות מוגבלת על היישום של protoplasts ב סויה35,36,37, 38, בעיקר בשל תפוקה נמוכה יחסית של סויה protoplasts.
כאן, אנו מתארים פרוטוקול פשוט ויעיל עבור בידוד של סויה protoplasts ויישומו ללימודי ביטוי גנים ארעית. באמצעות צעיר עוזב unifoliate של סויה שתילים, הצלחנו להשיג כמויות גדולות של protoplasts חיוני תוך מספר שעות. בנוסף, אנו יש אופטימיזציה שיטה טרנספורמציה פג סידן-בתיווך פשוט וניתן בעלות נמוכה כדי לספק את ה-DNA לתוך protoplasts סויה עם יעילות גבוהה.

<table><tbody><tr><td>MES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8250-100G</td><td></td></tr><tr><td>Cellulase CELF</td><td>Worthington Biological Corporation</td><td>LS002611</td><td></td></tr><tr><td>Pectolyase Y-23</td><td>BioWorld</td><td>9033-35-6</td><td></td></tr><tr><td>CELLULASE &quot;ONOZUKA&quot; R-10</td><td>yakult</td><td>10g</td><td></td></tr><tr><td>MACEROZYME R-10</td><td>yakult</td><td>10g</td><td></td></tr><tr><td>Mannitol</td><td>ICN Biomedicals</td><td>152540</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher</td><td>C79-500g</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>NEB</td><td>R3535S</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5545-5G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653-1kg</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher</td><td>P217-500g</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8266-100g</td><td></td></tr><tr><td>PEG4000</td><td>Fluka</td><td>81240</td><td></td></tr><tr><td>nylon mesh</td><td>carolina</td><td>652222N</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Culture Plates</td><td>USA Scientific</td><td>CC7682-7506</td><td></td></tr><tr><td>Razor Blades</td><td>Fisher</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>hemacytometer</td><td>hausserscientific</td><td>1483</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>EZNA plasmid miniprep kit</td><td>Omega</td><td>D6942-01</td><td></td></tr><tr><td>GeneJET Plasmid Miniprep Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>K0502</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5810</td><td>eppendorf</td><td>5811000827</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5424</td><td>eppendorf</td><td>22620401</td><td></td></tr><tr><td>Jencons Powerpette Plus Pipet Controller</td><td>Jencons</td><td>14526-202</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss 710 Confocal Microscope</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL</td><td>Ambion</td><td>AM12450</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Centrifuge Tubes</td><td>Denville</td><td>C1018-P</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Centrifuge Tubes</td><td>Denville</td><td>C1060-P</td><td></td></tr><tr><td>Newborn Calf Serum</td><td>Thermo Scientific</td><td>16010159</td><td></td></tr><tr><td>Soil</td><td>Ingram&#039;s Nursery</td><td></td><td></td></tr><tr><td>perlite</td><td>Vigoro</td><td>100521091</td><td></td></tr><tr><td>Torpedo Sand</td><td>JKS Ventures</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB Broth, Lennox (Powder)</td><td>Fisher</td><td>BP1427-500</td><td></td></tr></tbody></table>

a simple method for isolation of soybean protoplasts and application to transient gene expression analyses

סויה (מקסימום גליצין (ל') עליזה משחק.) הוא מין חשוב חיתוך, הפך למודל קטניות המחקרים של מסלולים גנטי וביוכימי. לכן, חשוב להקים מערכת ביטוי גנים ארעי יעיל סויה. כאן, אנו מדווחים פרוטוקול פשוט להכנת protoplasts סויה ויישומו עבור ניתוחים פונקציונליים ארעית. מצאנו כי צעיר עוזב unifoliate של סויה שתילים, גרמו כמויות גדולות של protoplasts באיכות גבוהה. על-ידי מיטוב שיטה פג סידן-בתיווך טרנספורמציה, השגנו יעילות המרה גבוהה באמצעות protoplasts unifoliate סויה. מערכת זו מספקת מודל רב תכליתי ויעיל לבדיקה של מנגנונים מורכבים איתות ולניהולו בתאים חיים סויה, עזרה טוב יותר להבין תהליכים מגוונים הסלולר, התפתחותית, פיזיולוגיים של קטניות.

איברים שונים של פולי סויה 10 - בן יום נבדקו עבור פרוטופלאסט הכנה (איור 1), התשואות נצפו תחת המיקרוסקופ (איור 2). קירות התא hypocotyl, epicotyl היו בקושי מתעכל, ונשאר כמה תאים המחוברים אחד לשני (איור 2B, 2 ג). Cotyledon (דמות 2D), שורש (איור 2 א), קירות התא הוסרו רק בחלק קטן של התאים. לעומת זאת, נצפו מספר רב של protoplasts unifoliate היה בשימוש (איור 2E-G). עלים unifoliate בשלבים התפתחותיים שונים היו נוספים שנבדקו (איור 2 H). בעוד שני מבקשה ומורחבת רק unifoliate העלים, גרמו תפוקה גבוהה של protoplasts, גודל protoplasts מ המורחב רק unifoliate היו יותר אחיד (איור 2F) מאשר מבקשה unifoliate (2E איור). עבור המורחב באופן מלא unifoliate, קירות התא היו עדיין שלם ברוב התאים (איור 2G). נבדק אנזימים לעיכול דופן התא של שלושה יצרנים שונים ואנו השיגו תוצאות דומות כמתואר לעיל. על סמך תצפיות אלה, הגענו למסקנה כי בחירה של חומרים צמח היה גורם מכריע וכי רק מורחב unifoliate עלים של שתילים צעירים סויה הבד הטוב ביותר עבור פרוטופלאסט הכנה.
מגוון של כמויות שונות של פלסמיד ה-DNA (0.1 µg, 1 µg, 5 µg, 20 µg) נבדקה יעילות אופטימלית טרנספורמציה protoplasts unifoliate סויה (איור 3 א-ד). 20 µg פלסמיד דנ א מעיד על יעילות טרנספורמציה הגבוהה ביותר עם יותר מ- 50% שינוי קצב (דמות תלת-ממד), בעוד 0.1 µg הראה הנמוך ביותר (פחות מ 1%) (איור 3 א). אנו להשיג יעילות דומה טרנספורמציה באמצעות ערכות טיהור DNA שונים מיצרנים שלוש. תוצאה זו עולה כי כמויות גדולות יותר של פלסמיד DNA יסייעו רבות כדי להגביר את היעילות טרנספורמציה.
איור 4 הוא תמונות קונאפוקלית של protoplasts סויה הפך עם לבנות p2GWF7-E1, אשר מבטא GFP דבוקה הגן הספציפי קטניות E1 (Glyma.06G207800), מונע על ידי האמרגן 35S CaMV ב p2GWF7 וקטור 39. חלבון כימרי E1-GFP מציג לוקליזציה גרעיני סויה protoplasts, אשר עולה בקנה אחד עם מחקר קודם באמצעות מערכת פרוטופלאסט תודרנית40. בהתחשב בכך E1 הוא גן ספציפי קטניות, תוצאה שלנו באמצעות מערכת פרוטופלאסט סויה מספק של תובנה חד משמעי בלוקליזציה subcellular לחלבון E1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57258/57258fig1.jpg"> איור 1. איור המציג את האיברים של נבט סויה נבדקים להכנה פרוטופלאסט במחקר זה, כולל בסיס, hypocotyl, cotyledon, epicotyl, unifoliate. לאחר זוג עלים unifoliate, סויה שתילים לפתח עלים trifoliate. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57258/57258fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57258/57258fig2.jpg"> באיור 2. פרוטופלאסט תאים מקריסטלים של איברים שונים, בשלבים התפתחותיים של סויה שתילים. (י-ם) תאים מקריסטלים של איברים שונים של 10 - בן יום שתילים סויה: שורש (א), hypocotyl (B), epicotyl (ג), cotyledon (ד). (E-G) פרוטופלאסט תאים שהוכנו עלים unifoliate בשלבים התפתחותיים שונים: לא מורחב (E), התרחב (נ) ולאחר מורחבת במלואה (G) unifoliate, התואם השתילים סויה ב (H) בצד ימין, התיכון וגם נכון, בהתאמה. סרגל קנה מידה הוא 25 מיקרומטר (A-G) או 25 מ מ (H). <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57258/57258fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57258/57258fig3.jpg"> איור 3. תמונות קונאפוקלית מראה יעילות טרנספורמציה של סויה protoplasts unifoliate עם כמויות שונות של פלסמיד ה-DNA. תמונות של ה-GFP (המיוצגת בירוק) ובאור שדה (אפור) ימוזגו. Protoplasts נהפכו עם כמויות שונות של פלסמיד p2GWF7-E1: 0.1 µg (א), 1 µg (B), 5 µg (ג) ו- µg 20 (ד). קרינה פלואורסצנטית אות של GFP היה פיקוח 24 שעות לאחר שינוי תחת מיקרוסקופ. הבר סולם שחור הוא 50 מיקרומטר. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57258/57258fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57258/57258fig4.jpg"> באיור 4. תמונות קונאפוקלית מציג לוקליזציה subcellular של E1-GFP בגרעין של סויה unifoliate protoplasts. P2GWF7-E1 פלסמיד שימש טרנספורמציה. תמונות של ה-GFP (המיוצגת בירוק) ובאור שדה (אפור) ימוזגו. קרינה פלואורסצנטית אות של GFP היה פיקוח 24 שעות לאחר השינוי. הבר סולם שחור הוא 5 מיקרומטר. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57258/57258fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">פתרון אנזים (הטרי)</td>
		</tr>
<tr>
<td>MES, pH 5.7</td>
			<td>20 מ מ</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cellulase CELF</td>
			<td>2% (w/v)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pectolyase Y-23</td>
			<td>0.1% (w/v)</td>
		</tr>
<tr>
<td>מניטול</td>
			<td>0.75 מ'</td>
		</tr>
<tr>
<td>CaCl2
</td>
			<td>0.2 מ מ</td>
		</tr>
<tr>
<td>BSA</td>
			<td>0.1% (w/v)</td>
		</tr>
<tr>
<td>DTT</td>
			<td>0.5 מ מ</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">פתרון W5</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaCl</td>
			<td>154 מ מ</td>
		</tr>
<tr>
<td>CaCl2
</td>
			<td>125 מ מ</td>
		</tr>
<tr>
<td>אשלגן כלורי</td>
			<td>5 מ מ</td>
		</tr>
<tr>
<td>MES, pH 5.7</td>
			<td>2 מ מ</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">MMg פתרון</td>
		</tr>
<tr>
<td>MES, pH 5.7</td>
			<td>4 מ מ</td>
		</tr>
<tr>
<td>מניטול</td>
			<td>400 מ</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgCl2
</td>
			<td>15 מ מ</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">פתרון פג (הטרי)</td>
		</tr>
<tr>
<td>PEG4000</td>
			<td>20% (w/v)</td>
		</tr>
<tr>
<td>מניטול</td>
			<td>200 מ מ</td>
		</tr>
<tr>
<td>CaCl2
</td>
			<td>100 מ מ</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">פתרון אינטרנט</td>
		</tr>
<tr>
<td>MES, pH 5.7</td>
			<td>4 מ מ</td>
		</tr>
<tr>
<td>מניטול</td>
			<td>0.5 מ'</td>
		</tr>
<tr>
<td>אשלגן כלורי</td>
			<td>20 מ מ</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1. פתרונות המשמש בידוד פרוטופלאסט סויה וטרנספורמציה.

Watch this Scientific Journal Video about A Simple Method for Isolation of Soybean Protoplasts and Application to Transient Gene Expression Analyses at JoVE.com

A Simple Method for Isolation of Soybean Protoplasts and Application to Transient Gene Expression Analyses

פיתחנו פרוטוקול פשוט ויעיל עבור הכנת כמויות גדולות של סויה protoplasts ללמוד מנגנוני איתות ולניהולו מורכבים בתאים חיים.

שיטה פשוטה עבור בידוד של סויה Protoplasts, ליישום ניתוחים ביטוי גנים ארעית

Soybean (Glycine max (L.) Merr.) is an important crop species and has become a legume model for the studies of genetic and biochemical pathways. ...

a-simple-method-for-isolation-soybean-protoplasts-application-to

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

24.7K Views.  California State University, Northridge. פיתחנו פרוטוקול פשוט ויעיל עבור הכנת כמויות גדולות של סויה protoplasts ללמוד מנגנוני איתות ולניהולו מורכבים בתאים חיים.

Video: A Simple Method for Isolation of Soybean Protoplasts and Application to Transient Gene Expression Analyses

A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal transduction pathways, transcriptional regulatory networks, gene expression, genome-editing, and gene-silencing. Furthermore, significant progress has been made in the regeneration of plants from protoplasts, which has generated even more interest in the use of these systems for plant genomics. In this work, a protocol has been developed for automation of protoplast isolation and transformation from a &#39;Bright Yellow&#39; 2 (BY-2) tobacco suspension culture using a robotic platform. The transformation procedures were validated using an orange fluorescent protein (OFP) reporter gene (pporRFP) under the control of the Cauliflower mosaic virus 35S promoter (35S). OFP expression in protoplasts was confirmed by epifluorescence microscopy. Analyses also included protoplast production efficiency methods using propidium iodide. Finally, low-cost food-grade enzymes were used for the protoplast isolation procedure, circumventing the need for lab-grade enzymes that are cost-prohibitive in high-throughput automated protoplast isolation and analysis. Based on the protocol developed in this work, the complete procedure from protoplast isolation to transformation can be conducted in under 4 hr, without any input from the operator. While the protocol developed in this work was validated with the BY-2 cell culture, the procedures and methods should be translatable to any plant suspension culture/protoplast system, which should enable acceleration of crop genomics research.

A high-throughput, automated, tobacco protoplast production and transformation methodology is described. The robotic system enables massively parallel gene expression and discovery in the model BY-2 system that should be translatable to non-model crops.

פלטפורמה רובוטית עבור תפוקה גבוהה בידוד פרוטופלאסט וההשנאה

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal ...

Genetics

Transient Gene Expression in Tobacco using Gibson Assembly and the Gene Gun

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately using complex regulatory strategies including differential promoters and/or signal sequences. Metabolic engineers and synthetic biologists interested in targeting enzymes to a particular organelle are faced with a challenge: For a protein that is to be localized to more than one organelle, the engineer must clone the same gene multiple times. This work presents a solution to this strategy: harnessing alternative splicing of mRNA. This technology takes advantage of established chloroplast and peroxisome targeting sequences and combines them into a single mRNA that is alternatively spliced. Some splice variants are sent to the chloroplast, some to the peroxisome, and some to the cytosol. Here the system is designed for multiple-organelle targeting with alternative splicing. In this work, GFP was expected to be expressed in the chloroplast, cytosol, and peroxisome by a series of rationally designed 5&#8217; mRNA tags. These tags have the potential to reduce the amount of cloning required when heterologous genes need to be expressed in multiple subcellular organelles. The constructs were designed in previous work11, and were cloned using Gibson assembly, a ligation independent cloning method that does not require restriction enzymes. The resultant plasmids were introduced into Nicotiana benthamiana epidermal leaf cells with a modified Gene Gun protocol. Finally, transformed leaves were observed with confocal microscopy.

This work describes a novel method for selectively targeting subcellular organelles in plants, assayed using the BioRad Gene Gun.

ביטוי גנים חולף בטבק באמצעות גיבסון הרכבה והאקדח הגן

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately ...

Environment

Transient Expression in Nicotiana Benthamiana Leaves for Triterpene Production at a Preparative Scale

The triterpenes are one of the largest and most structurally diverse families of plant natural products. Many triterpene derivatives have been shown to possess medicinally relevant biological activity. However, thus far this potential has not translated into a plethora of triterpene-derived drugs in the clinic. This is arguably (at least partially) a consequence of limited practical synthetic access to this class of compound, a problem that can stifle the exploration of structure-activity relationships and development of lead candidates by traditional medicinal chemistry workflows. Despite their immense diversity, triterpenes are all derived from a single linear precursor, 2,3-oxidosqualene. Transient heterologous expression of biosynthetic enzymes in N. benthamiana can divert endogenous supplies of 2,3-oxidosqualene towards the production of new high-value triterpene products that are not naturally produced by this host. Agro-infiltration is an efficient and simple means of achieving transient expression in N. benthamiana. The process involves infiltration of plant leaves with a suspension of Agrobacterium tumefaciens carrying the expression construct(s) of interest. Co-infiltration of an additional A. tumefaciens strain carrying an expression construct encoding an enzyme that boosts precursor supply significantly increases yields. After a period of five days, the infiltrated leaf material can be harvested and processed to extract and isolate the resulting triterpene product(s). This is a process that is linearly and reliably scalable, simply by increasing the number of plants used in the experiment. Herein is described a protocol for rapid preparative-scale production of triterpenes utilizing this plant-based platform. The protocol utilizes an easily replicable vacuum infiltration apparatus, which allows the simultaneous infiltration of up to four plants, enabling batch-wise infiltration of hundreds of plants in a short period of time.

Transient Expression in Nicotiana Benthamiana Leaves for Triterpene Production at a Preparative Scale

Transient heterologous expression of biosynthetic enzymes in Nicotiana benthamiana leaves can divert endogenous supplies of 2,3-oxidosqualene towards the production of new high-value triterpene products. Herein is described a detailed protocol for rapid (5 days) preparative-scale production of triterpenes and analogs utilizing this powerful plant-based platform.

ארעי ביטוי טבק Benthamiana משאיר לייצור טריטרפן בקנה מידה מפוח

The triterpenes are one of the largest and most structurally diverse families of plant natural products. Many triterpene derivatives have been shown to ...

Biochemistry

Isolation of Protoplasts from Tissues of 14-day-old Seedlings of Arabidopsis thaliana

Protoplasts are plant cells that have had their cell walls enzymatically removed. Isolation of protoplasts from different plant tissues was first reported more than 40 years ago 1 and has since been adapted to study a variety of cellular processes, such as subcellular localization of proteins, isolation of intact organelles and targeted gene-inactivation by double stranded RNA interference (RNAi) 2-5. Most of the protoplast isolation protocols use leaf tissues of mature Arabidopsis (e.g. 35-day-old plants) 2-4. We modified existing protocols by employing 14-day-old Arabidopsis seedlings. In this procedure, one gram of 14-day-old seedlings yielded 5 106-107 protoplasts that remain intact at least 96 hours. The yield of protoplasts from seedlings is comparable with preparations from leaves of mature Arabidopsis, but instead of 35-36 days, isolation of protoplasts is completed in 15 days. This allows decreasing the time and growth chamber space that are required for isolating protoplasts when mature plants are used, and expedites the downstream studies that require intact protoplasts.

Isolation of Protoplasts from Tissues of 14-day-old Seedlings of Arabidopsis thaliana

This video shows a procedure for isolating intact protoplasts from tissues of 14-day-old seedlings of Arabidopsis. Given that the isolated protoplasts remain intact for at least 96h and are isolated from seedlings instead of one-month-old mature plants, this procedure expedites assays requiring intact protoplasts.

בידוד של Protoplasts מרקמות של 14 יום בן שתילים של ארבידופסיס thaliana</em

Protoplasts are plant cells that have had their cell walls enzymatically removed. Isolation of protoplasts  from different plant tissues was first ...

Robotics and Dynamic Image Analysis for Studies of Gene Expression in Plant Tissues

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods presented here utilize the green fluorescent protein (gfp) gene for continual monitoring of gene expression in the same pieces of tissues, over time. The gfp gene was placed under regulatory control of different promoters and introduced into lima bean cotyledonary tissues via particle bombardment. Cotyledons were then placed on a robotic image collection system, which consisted of a fluorescence dissecting microscope with a digital camera and a 2-dimensional robotics platform custom-designed to allow secure attachment of culture dishes. Images were collected from cotyledonary tissues every hour for 100 hours to generate expression profiles for each promoter. Each collected series of 100 images was first subjected to manual image alignment using ImageReady to make certain that GFP-expressing foci were consistently retained within selected fields of analysis. Specific regions of the series measuring 300 x 400 pixels, were then selected for further analysis to provide GFP Intensity measurements using ImageJ software. Batch images were separated into the red, green and blue channels and GFP-expressing areas were identified using the threshold feature of ImageJ. After subtracting the background fluorescence (subtraction of gray values of non-expressing pixels from every pixel) in the respective red and green channels, GFP intensity was calculated by multiplying the mean grayscale value per pixel by the total number of GFP-expressing pixels in each channel, and then adding those values for both the red and green channels. GFP Intensity values were collected for all 100 time points to yield expression profiles. Variations in GFP expression profiles resulted from differences in factors such as promoter strength, presence of a silencing suppressor, or nature of the promoter. In addition to quantification of GFP intensity, the image series were also used to generate time-lapse animations using ImageReady. Time-lapse animations revealed that the clear majority of cells displayed a relatively rapid increase in GFP expression, followed by a slow decline. Some cells occasionally displayed a sudden loss of fluorescence, which may be associated with rapid cell death. Apparent transport of GFP across the membrane and cell wall to adjacent cells was also observed. Time lapse animations provided additional information that could not otherwise be obtained using GFP Intensity profiles or single time point image collections.

We report a method for introduction, tracking and quantitative analysis of GFP expression in plant cells. This method utilizes a custom-designed robotics system for semi-continuous image collection from large numbers of samples, over time. We also demonstrate the use of ImageJ and ImageReady for analysis of image series.

רובוטיקה ניתוח תמונה דינאמית ללימודים של ביטוי גנים ברקמות הצמח

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods ...

ייצור יעיל של שורשים שעירים מהונדסים, פולי סויה

Soybean Hairy Root Transformation for the Analysis of Gene Function

Soybean (Glycine max) is a valuable crop in agriculture that has thousands of industrial uses. Soybean roots are the primary site of interaction with soil-borne microbes that form symbiosis to fix nitrogen and pathogens, which makes research involving soybean root genetics of prime importance to improve its agricultural production. The genetic transformation of soybean hairy roots (HRs) is mediated by the Agrobacterium rhizogenes strain NCPPB2659 (K599) and is an efficient tool for studying gene function in soybean roots, taking only 2 months from start to finish. Here, we provide a detailed protocol that outlines the method for overexpressing and silencing a gene of interest in soybean HRs. This methodology includes soybean seed sterilization, infection of cotyledons with K599, and the selection and harvesting of genetically transformed HRs for RNA isolation and, if warranted, metabolite analyses. The throughput of the approach is sufficient to simultaneously study several genes or networks and could determine the optimal engineering strategies prior to committing to long-term stable transformation approaches.

מחבר זרקור: טרנספורמציה של שורש סויה שעיר לניתוח תפקוד גנים  

Here, we present a protocol for the high-efficiency production of transgenic soybean hairy roots.

טרנספורמציה של שורש סויה שעיר לניתוח תפקוד גנים

Soybean (Glycine max) is a valuable crop in agriculture that has thousands of industrial uses. Soybean roots are the primary site of interaction with ...

Bioengineering

Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing worldwide demand for pharmaceuticals due to its limited scalability and high cost. Plants have shown to be one of the most promising alternative pharmaceutical production platforms that are robust, scalable, low-cost and safe. The recent development of virus-based vectors has allowed rapid and high-level transient expression of recombinant proteins in plants. To further optimize the utility of the transient expression system, we demonstrate a simple, efficient and scalable methodology to introduce target-gene containing Agrobacterium into plant tissue in this study. Our results indicate that agroinfiltration with both syringe and vacuum methods have resulted in the efficient introduction of Agrobacterium into leaves and robust production of two fluorescent proteins; GFP and DsRed. Furthermore, we demonstrate the unique advantages offered by both methods. Syringe infiltration is simple and does not need expensive equipment. It also allows the flexibility to either infiltrate the entire leave with one target gene, or to introduce genes of multiple targets on one leaf. Thus, it can be used for laboratory scale expression of recombinant proteins as well as for comparing different proteins or vectors for yield or expression kinetics. The simplicity of syringe infiltration also suggests its utility in high school and college education for the subject of biotechnology. In contrast, vacuum infiltration is more robust and can be scaled-up for commercial manufacture of pharmaceutical proteins. It also offers the advantage of being able to agroinfiltrate plant species that are not amenable for syringe infiltration such as lettuce and Arabidopsis. Overall, the combination of syringe and vacuum agroinfiltration provides researchers and educators a simple, efficient, and robust methodology for transient protein expression. It will greatly facilitate the development of pharmaceutical proteins and promote science education.

Plants offer a novel system for the production of pharmaceutical proteins on a commercial scale that is more scalable, cost-efficient and safe than current expression paradigms. In this study, we report a simple and convenient, yet scalable approach to introduce target-gene containing Agrobacterium tumefaciens into plants for protein transient expression.

Agroinfiltration היעילה של צמחים לביטוי חולף ברמה גבוהה של חלבונים רקומביננטי

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

A Comparative Analysis of Recombinant Protein Expression in Different Biofactories: Bacteria, Insect Cells and Plant Systems

Plant-based systems are considered a valuable platform for the production of recombinant proteins as a result of their well-documented potential for the flexible, low-cost production of high-quality, bioactive products.
In this study, we compared the expression of a target human recombinant protein in traditional fermenter-based cell cultures (bacterial and insect) with plant-based expression systems, both transient and stable.
For each platform, we described the set-up, optimization and length of the production process, the final product quality and the yields and we evaluated provisional production costs, specific for the selected target recombinant protein.
Overall, our results indicate that bacteria are unsuitable for the production of the target protein due to its accumulation within insoluble inclusion bodies. On the other hand, plant-based systems are versatile platforms that allow the production of the selected protein at lower-costs than Baculovirus/insect cell system. In particular, stable transgenic lines displayed the highest-yield of the final product and transient expressing plants the fastest process development. However, not all recombinant proteins may benefit from plant-based systems but the best production platform should be determined empirically with a case-by-case approach, as described here.

In this study the expression of a target human recombinant protein in different production platforms was compared. We focused on traditional fermenter-based cultures and on plants, describing the set-up of each system and highlighting, on the basis of the reported results, the inherent limits and advantages for each platform.

ניתוח השוואתי של ביטוי חלבון רקומביננטי בBiofactories שונה: חיידקים, תאי חרקים וצמחי מערכות

Plant-based systems are considered a valuable platform for the production of recombinant proteins as a result of their well-documented potential for the ...

שיטה פשוטה עבור בידוד של סויה Protoplasts, ליישום ניתוחים ביטוי גנים ארעית

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

פלטפורמה רובוטית עבור תפוקה גבוהה בידוד פרוטופלאסט וההשנאה

ביטוי גנים חולף בטבק באמצעות גיבסון הרכבה והאקדח הגן

ארעי ביטוי טבק Benthamiana משאיר לייצור טריטרפן בקנה מידה מפוח

בידוד של Protoplasts מרקמות של 14 יום בן שתילים של ארבידופסיס thaliana

רובוטיקה ניתוח תמונה דינאמית ללימודים של ביטוי גנים ברקמות הצמח

טרנספורמציה של שורש סויה שעיר לניתוח תפקוד גנים

טרנספורמציה של שורש סויה שעיר לניתוח תפקוד גנים

טרנספורמציה של שורש סויה שעיר לניתוח תפקוד גנים

Agroinfiltration היעילה של צמחים לביטוי חולף ברמה גבוהה של חלבונים רקומביננטי

ניתוח השוואתי של ביטוי חלבון רקומביננטי בBiofactories שונה: חיידקים, תאי חרקים וצמחי מערכות