This work was supported by a grant from the National Health Research Institutes (03-A1 BNMP11-014).

הערה: עיצובי photomask עבור ייצור מכשיר microfluidic שלנו נמשכו באמצעות תוכנת מחשב תכנון בעזרת מחשב (CAD). העיצובים נוצלו אז לפברק photomasks כרום באמצעות שירות מסחרי. מכשירי PDMS נעשו באמצעות טכניקות ליתוגרפיה רכות. 11 ייצור 1. של תבניות הורים על ידי ליתוגרפיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני תהליך photolithography 12, השתמשו פרוסות סיליקון 4 אינץ &#39;כמו מצע מייבש את הפרוסות בתנור רגיל ב 120 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקו את פרוסות סיליקון מיובש באמצעות טיפול פלזמה חמצן ב 100 וואט למשך 30 שניות בתוך שואב פלזמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחמם שתי כיריים על 65 מעלות צלזיוס ו -95 מעלות צלזיוס, בהתאמה, עבור תהליך האפייה הבאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעיל 5 גרם של photoresist שלילית (PR) על פרוסות סיליקון ניקה ידי coater ספין; ספין ב -1,200 סל&quot;ד (SU-8 50) למשך 30 שניות כדי לייצר את שכבת microchannel. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את PRמצופה רקיק על פלטה חמה שחוממה מראש ב 65 מעלות צלזיוס למשך 12 דקות ולהעביר אותו למקום אחר פלטה חשמלית שחוממה מראש ב 95 מעלות צלזיוס במשך 33 דקות (עבור 100 מיקרומטר דפוסים עבים) לבצע תהליך לאפות רך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר אפייה, מניחים את פרוסות סיליקון מצופה PR על בעל aligner מסכת חצי אוטומטי וליישר אותו photomask שקיפות ברזולוציה 25,400 dpi. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף את פרוסות סיליקון מצופה PR לאור UV (365 ננומטר) במינון של 500 mJ / 2 ס&quot;מ כדי ליצור את דפוס יחסי ציבור על פרוסות סיליקון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את אפיפית aligner ומניח אותו על פלטה חמה עבור שלאחר אפייה על 95 מעלות צלזיוס למשך 12 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משרה את הפרוסות ב מפתח SU-8 (יצטט אתר monomethyl פרופילן גליקול, PGMEA) פתרון לשטוף PR uncrosslinked במשך 12 דקות ויבשות בעדינות באמצעות גז חנקן כדי לחשוף את סימני היישור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוב, מעיל 5 גרם של photoresist שלילית על ופלים ידי coater ספין; ספין ב 700 סל&quot;ד (SU-8 100) למשך 30 שניות ו -1,200 סל&quot;ד (SU-8 10) למשך 30 שניות ב -300 &amp;# 181; דפוס מ &#39;עובי ו -27 מיקרומטר דפוס עבה בהתאמה להפוך את שכבת microwell. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את פרוסות PR מצופה על פלטה חמה על 65 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות ב 95 מעלות צלזיוס למשך 8 דקות (עבור 27 מיקרומטר שכבה ללכוד היטב עמוק); ו ב 65 מעלות צלזיוס במשך 40 דקות ו 95 מעלות צלזיוס למשך 110 דקות (עבור 300 מיקרומטר שכבת התרבות-באר עמוקה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הקירור, מניחים את פרוסות סיליקון מצופה PR על aligner מסכה מצויד אור UV. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף את פרוסות סיליקון מצופה PR אל אור UV (365 ננומטר) במינון של 250 mJ / 2 ס&quot;מ (עבור 27 מיקרומטר דפוס עבה) ו -700 mJ / 2 ס&quot;מ (עבור 300 מיקרומטר דפוס עבה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופים את פרוסות על 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות (27 מיקרומטר דפוס עבה) ו -30 דקות (300 מיקרומטר דפוס עבה), בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את ה- PR uncrosslinked ידי PGMEA במשך 6 דקות (27 מיקרומטר דפוס עבה) ו -25 דקות (300 מיקרומטר דפוס עבה), בהתאמה, ולאחר מכן לייבש אותם עם גז חנקן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד את גובהם של דפוס תכונותרקיק עם profilometer לייזר סריקה על ידי הנחת פרוסות על-הבמה XY של profilometer לייזר סריקה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את מישור המוקד כדי מראים בבירור את התבנית כולל על פרוסות סיליקון באמצעות &quot;תצוגת המצלמה&quot; מצב תצפית תחת עדשה אובייקטיבי 20X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור את מצב התצפית מן &quot;תצוגת מצלמה&quot; ל &quot;נוף ליזר&quot;, ולהגדיר את העמדות העליונות ותחתונות של התכונות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת מצב המדידה, שטח, איכות, ו- Z-המגרש עד (למעלה) שקופים, 1 הקו (1,024 x 1), דיוק גבוה ו -0.5 מיקרומטר, בהתאמה, ולאחר מכן לחץ על החלקה התחתונה כדי להתחיל את המדידה. </li></ol></li></ol> 2. הכנת התקני PDMS עבור בידוד תא בודד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני ליהוק PDMS, silanize תבניות ההורים עם trichlorosilane כדי ליצור משטח הידרופובי, מה שהופך אותו קל יותר לקלף את העתקי PDMS מן תבניות ההורים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את תבניות הורים וסירה שקלול המכיל200 μl של trichlorosilane ייבוש, ולהחיל ואקום (-85 kPa) במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עצור את הוואקום ולאחר מכן לעזוב את תבניות ההורים בבית הייבוש silanize התבניות מאסטר בטמפרטורת חדר למשך שעה 1 לפחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את תבניות הורים מתא הייבוש ומקום כל עובש אמן בצלחת 10 ס&quot;מ פטרי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים בסכום כולל של ערכת פולימר PDMS 17.6 גרם המכיל בסיס ואת סוכן ריפוי ביחס של 10: 1, ואז לשפוך את PDMS על עובש אמן בצלחת פטרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צלחת פטרי ייבוש ולהחיל ואקום (-85 kPa) במשך שעה 1 כדי להסיר בועות אוויר בתוך PDMS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את צלחת פטרי מן הייבוש ומניח אותו בתנור רגיל על 65 מעלות צלזיוס למשך 3 - 6 שעות כדי לרפא את PDMS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת העותקים המשוכפלים PDMS נרפא מן תבניות הורים ומחייג שני חורים כמו מפרצון ולשקע על שני הקצוות של microchannel על העתק PDMS מערך היטב ללכוד ידי אגרופן עם קוטר פנימי של 0.75 מ&quot;מ עבור ערוץ fluidic (איור 2 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש קלטת לניקוי המשטח של העתקי PDMS, ולאחר מכן למקם את העתקי PDMS בתוך שואב פלזמה לטיפול פלזמת חמצן קצר (100 ואט במשך 14 שניות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת העותקים המשוכפלת PDMS ממכונת פלזמת חמצן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יישר עליון (המכיל את microwells הלכידה) וכן PDMS תחתונה (המכיל את microwells התרבות) העתק ביד תחת סטראו ולהביאם במגע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את העתקי PDMS מיושרים בתנור על 65 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות כדי להשיג זוגיות קבועה בין העתקי PDMS כדי ליצור את המכשיר הסופי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משרים את המכשיר PDMS בתוך deionized (DI) -water מיכל מלא ומניחים את המיכל ייבוש תחת ואקום (-85 kPa) במשך 15 דקות כדי להסיר אוויר מן microchannel של המכשיר PDMS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את המכשיר PDMS מלא מים DI במנדף בתרבית רקמה ולהשתמש אור UV (אורך הגל של האור: 254 ננומטר) לעקר של המכשיר עבור 30 מילn. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את המים DI במכשיר PDMS עם אלבומין 5% שור (BSA) בתמיסה 1x PBS ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות כדי למנוע מתאי יידבקו אל פני השטח PDMS. הערה: ציפוי BSA הוא קריטי כדי לשפר את יעילות העברת תאים מבודדים מתפיסה-היטב-היטב בתרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את פתרון BSA 5% במכשיר PDMS עם פתרון 1x PBS מעוקר. </li></ol> 3. הכנת ההשעיה תא בודד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עצבי תרבות בתאי גזע KT98, ו A549 תאי קרצינומה אדם מד&quot;א- MB-435 אנחנו בצלחת פטרי תרבית תאי חממה קונבנציונלית (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, ו -95% לחות) להכין תאים לניסוי תא מכשיר PDMS . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סר וזורק את מדיום תרבות בילו (בינוני הבזליים DMEM מסופק עם 10% בסרום שור עובריים 1% אנטיביוטיקה) מצלחת התרבות עם תאים שגודלו עד 70 - 80% מפגש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף בעדינות את התאים עם פעמים מעוקרות שלושה PBS. &lt;/ Li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> סר וזורק את PBS, ולהוסיף 2 מיליליטר של תערובת אנזים רקומביננטי עם פרוטאוליטים, collagenolytic, ופעילויות DNase (עיין הרשימה חומר המידע המפורט). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את מנת התרבות בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות, ולאחר מכן קש על מנת התרבות להקל ניתוק תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 4 מ&quot;ל של עיקור PBS לפזר תאים, ולאחר מכן להעביר את ההשעיה לתא צינור חרוטי 15 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה הצינור ב XG 300 במשך 3 דקות ולהסיר את supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות resuspend התא גלולה ב 1 מ&quot;ל מעוקר PBS ולספור את מספר תא חי בשיטת הרחקה Trypan כחול תקן 13. הערה: צעד resuspension זה הוא קריטי עבור הכנת השעית תא בודד ניתקת גם כדי לשפר את יעילות בידוד התא הבודד. </li></ol> 4. בידוד תא בודד ותרבות משובטת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען 50 μl של השעית תא בריכוז של 2.2 - 2.5 x10 <sup&gt; 6 תאים / מ&quot;ל לתוך microchannel של המכשיר PDMS דרך החור לשקע של המכשיר עם טפטפת כף יד. הערה: פיפטה טעינת תא ההשעיה שחייבת להיפסק והחזיק במיקום התחנה הראשון כדי למנוע החדרת בועות אוויר לתוך microchannel. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען עוד 50 μl של השעית תא דרך חור המפרצון כדי למלא את microchannel כולו באופן שווה עם תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאטום את החור לשקע עם תקע (ארוך 3 מ&quot;מ, 1 מ&quot;מ חוט חכת ניילון לחתוך קוטר), כדי למנוע זרימת מושרה על ידי לחץ ההידרוסטטי מן הטיפין על חורי כניסה ויציאה. הערה: התקעים היו UV עיקור בתוך ברדס בתרבית רקמה לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו את מזרק סטרילי 1 מ&quot;ל עם המדיום תרבות, להוציא בועות אוויר ממנו, ולהגדיר אותו על משאבת מזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חברו את המזרק טעון בינוני עד החור מפרצון של המכשיר PDMS באמצעות מחט 23 G בוטה בצינור פולי-tetrafluoroethene (PTFE). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את התקע לשקע חור וכלow מרווח זמן של 2 דקות כדי לאפשר לתאים להתיישב לתוך בארות לכידת תא בודד על ידי כוח הכבידה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים שלא נלכדו עם 300 μl של מדיום התרבות בקצב זרימה של 600 μl / min מונע על ידי משאבת המזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חכה 2 דקות כדי לייצב את המכשיר, ולאטום את חורי מפרצון ו לשקע עם אטמים כדי ליצור מערכת תרבות סגורה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תהפוך את המכשיר ביד להעביר את חד תאים שנתפסו על microwells התרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את המכשיר PDMS בצלחת בתרבית רקמה 100 מ&quot;מ, ולהוסיף 10 מ&quot;ל של PBS מעוקרים סביב המכשיר כדי למנוע אידוי תרבות בינוני מן microchannel. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזז את מנת תרבות חממת תרבית תאים קונבנציונלית (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, ו -95% לחות) לתרבות המשובטת של-תאים הבודדים. </li></ol> 5. רענון בינוני תרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 1 ד תרבות, להחליף את מדיום תרבות מכשיר PDMS עם מדיום חדש לשיפור יחסי ציבור תאoliferation. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח שתי טיפות של מדיום תרבות על גבי מכשיר PDMS ליד אזורי חורי כניסה ויציאה כדי למנוע החדרת בועות אוויר לתוך microchannel בעת ביצוע השלב הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פאנץ שני חורים מהחלק העליון של המכשיר PDMS ליד שני הקצוות של microchannel כקובץ מפרצון ולשקע עבור microchannel. הערה: אל אגרוף דרך שתי שכבות שלמות של המכשיר PDMS; במקום, רק אגרוף דרך השכבה העליונה של PDMS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר מזרק פלסטיק 1 מ&quot;ל המכיל מדיום חדש אל מפרצון באמצעות מחט 23 G בוטה צינורות PTFE. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרימה בינונית טרי 120 μl לתוך המכשיר למשך 5 דקות כדי להחליף את המדיום הישן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס שני תקעים לאטום את הכניסה ויציאה חורה, ולהחזיר את המכשיר אל האינקובטור תרבית תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רענן את מדיום התרבות כל 2 ד בתקופת התרבות ידי הסרת תקעי איטום, ואחריו חזרה על שלבי 5.4 עד 5.5. </li></ol>

<ol>
	<li>Meacham, C. E., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+heterogeneity+and+cancer+cell+plasticity.">Tumour heterogeneity and cancer cell plasticity.</a> Nature. 501 (7467), 328-337 (2013).</li><li>Vermeulen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+cloning+of+colon+cancer+stem+cells+reveals+a+multi-lineage+differentiation+capacity.">Single-cell cloning of colon cancer stem cells reveals a multi-lineage differentiation capacity.</a> P Natl Acad Sci USA. 105 (36), 13427-13432 (2008).</li><li>Shapiro, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Practical flow cytometry. , (2005).</li><li>Leong, K. G., Wang, B. E., Johnson, L., Gao, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+prostate+from+a+single+adult+stem+cell.">Generation of a prostate from a single adult stem cell.</a> Nature. 456 (7223), 804-808 (2008).</li><li>Shapiro, E., Biezuner, T., Linnarsson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+sequencing-based+technologies+will+revolutionize+whole-organism+science.">Single-cell sequencing-based technologies will revolutionize whole-organism science.</a> Nat Rev Genet. 14 (9), 618-630 (2013).</li><li>Rettig, J. R., Folch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+single-cell+trapping+and+imaging+using+microwell+arrays.">Large-scale single-cell trapping and imaging using microwell arrays.</a> Anal. Chem. 77 (17), 5628-5634 (2005).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+fibrin+gels+promote+selection+and+growth+of+tumorigenic+cells.">Soft fibrin gels promote selection and growth of tumorigenic cells.</a> Nat Mater. 11 (8), 734-741 (2012).</li><li>Charnley, M., Textor, M., Khademhosseini, A., Lutolf, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+column:+microwell+arrays+for+mammalian+cell+culture.">Integration column: microwell arrays for mammalian cell culture.</a> Integr. Biol. 1 (11-12), 11-12 (2009).</li><li>Lindstrom, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-density+microwell+chip+for+culture+and+analysis+of+stem+cells.">High-density microwell chip for culture and analysis of stem cells.</a> PloS one. 4 (9), e6997 (2009).</li><li>Lin, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+dual-well+device+for+high-throughput+single-cell+capture+and+culture.">A microfluidic dual-well device for high-throughput single-cell capture and culture.</a> Lab Chip. 15 (14), 2928-2938 (2015).</li><li>Xia, Y. N., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+lithography.">Soft lithography.</a> Angew Chem Int Edit. 37 (5), 550-575 (1998).</li><li>Shin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+assay+for+simultaneous+culture+of+multiple+cell+types+on+surfaces+or+within+hydrogels.">Microfluidic assay for simultaneous culture of multiple cell types on surfaces or within hydrogels.</a> Nat Protoc. 7 (7), 1247-1259 (2012).</li><li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability.">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Curr. Protoc. Immunol. Appendix 3 (Appendix 3B), (2001).</li><li>Lindstrom, S., Andersson-Svahn, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Miniaturization+of+biological+assays+-+Overview+on+microwell+devices+for+single-cell+analyses.">Miniaturization of biological assays - Overview on microwell devices for single-cell analyses.</a> Bba-Gen Subjects. 1810 (3), 308-316 (2011).</li><li>Lecault, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+analysis+of+single+hematopoietic+stem+cell+proliferation+in+microfluidic+cell+culture+arrays.">High-throughput analysis of single hematopoietic stem cell proliferation in microfluidic cell culture arrays.</a> Nat Methods. 8 (7), 581-593 (2011).</li><li>Park, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+trapping+in+larger+microwells+capable+of+supporting+cell+spreading+and+proliferation.">Single cell trapping in larger microwells capable of supporting cell spreading and proliferation.</a> Microfluid Nanofluid. 8 (2), 263-268 (2010).</li><li>Tirino, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells+in+solid+tumors:+an+overview+and+new+approaches+for+their+isolation+and+characterization.">Cancer stem cells in solid tumors: an overview and new approaches for their isolation and characterization.</a> FASEB J. 27 (1), 13-24 (2013).</li><li>Chen, P. C., Huang, Y. Y., Juang, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MEMS+microwell+and+microcolumn+arrays:+novel+methods+for+high-throughput+cell-based+assays.">MEMS microwell and microcolumn arrays: novel methods for high-throughput cell-based assays.</a> Lab Chip. 11 (21), 3619-3625 (2011).</li><li>Liang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+Screening+Using+a+Library+of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocytes+Reveals+Disease-Specific+Patterns+of+Cardiotoxicity.">Drug Screening Using a Library of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes Reveals Disease-Specific Patterns of Cardiotoxicity.</a> Circulation. 127 (16), 1677-1691 (2013).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

מערכות מכשירות מבוסס microwell 6,14 כבר נוצלו עבור מניפולצית תא בודד וניתוח, כגון תא בודד בקנה מידה גדולה השמן 6 ובחלוקה של תאי גזע hematopoietic יחיד 15. למרות גודל היטב, מספר, וצורה יכולה להיות מותאם עבור יישומים ספציפיים, את יעילות בידוד התא היחיד נפגעה תמיד כאשר הגודל של הבאר הוא גדל. 9,15 כדי להתגבר על מגבלה זו, פרק et al. דיווח על שבב microfluidic עם microwells המשולש בעלות שיעור השמנה גבוהה תא בודד (58.34%), ואילו גודל microwell מוגדל כדי לאפשר תא מתפשט וצמיחה. עם זאת, microwells (עם האורך של צד ~ 50 מיקרומטר) יכול לתמוך התפשטות תאים רק עד 2 ד. 16 באסטרטגיה דואלית היטב שלנו מאפשרת טעינת תא בודד ב microwells הגדול כדי לא להיות מוגבלת על ידי ההסתברות של פואסון הפצה נתקל בהגבלת diluשיטות tion ומערכות גם פתוחות 3, כפי שהוכח על ידי מתן יעילות בידוד תא בודד גבוהה (יותר מ -75%) ב microwells הגדול שגודל היה מספיק עבור התפשטות תאים עבור digit 7 לפחות (איור 4 א). בשל יכולתו ביעילות מאוד לבצע בידוד תא בודד ותרבות משובטת עם הליך מכשיר והפעלה פשוט, אנו צופים כי פלטפורמת microfluidic שלנו יכולה להוות כלי שימושי עבור מגוון רחב של יישומים, כוללים בחירה של תא גזע סרטני על ידי assay clonogenic 17 והקרנת קרדיאלית תפוקה גבוהה של תרופות 18,19. מגבלה עיקרית של פלטפורמת הבידוד והתרבות התא הבודד שלנו היא שזה לא יוצר בנפרד סגורות בארות תרבות כדי למנוע crosstalk בין התאים בתרבית-בארות התרבות. לכן, ההתנהגות של התאים עשויה להיות מושפעי הפרשת paracrine של תאים בודדים מבודדים אחרים במכשיר microfluidic. בשטחיםהמגבלה שלה הפלטפורמה שלנו היא הצורך להכין השעית תא צפיפות גבוהה יחסית עבור בידוד תא בודד יעילות גבוהה. צריכת תא גבוהה זה יכול להגביל את היישומים של בידוד תאים נדיר ותרבות, כגון תאי הומור מימיים. לפני פעולת המכשיר, חשוב להזריק מים די מחור הכניסה למלא את microchannel ובזהירות מבחינה בהתנהגות כלשהי דליפה נוזל ממכשיר PDMS המלוכדת. דליפת מים משפיעה על מצב זרימת microchannel ובכך עלול להשפיע לרעה על ללכוד תאים ותוצאת העברה. בנוסף, למרות תוצאות המחקר יעילות טעינת תא הבודד שלנו להראות אובדן תא נמוך מאוד לאחר העברת התאים המבודדים מן-בארות ללכוד-בארות תרבות, המציין כי רוב התאים ניתן להעביר באופן יעיל על ידי הפיכת המכשיר, יעילות ההעברה יורדת אם צעד חסימת BSA (2.12) לא מבוצע כהלכה. משתמשים יכולים לשנות את פרוטוקול חסימת BSA או להשתמש אלשיטות שינוי פני שטח ternative לצרכי ניסוי תאים הספציפיים שלהם (למשל, הגדלת זמן ריכוז או ציפוי BSA כאשר סוג תא חסיד יותר משמש). הממדים של לכידת-בארות סלולריים הם הגורמים הדומיננטיים, אשר צריך להיות מותאם במיוחד יעילות טעינת תא בודד ביותר-בארות ללכוד, תלוי בגודל של סוג תא מסוים של עניין. גבוהים מרובים תאים-ב-א-היטב ללכוד אירועים הם בגלל שיש בגודל היטב צילום גדול מדי עבור סוג ריבית התא, ואילו יעילות טעינת תא נמוכה בבאר ללכוד היא אינדיקציה לגודל ללכוד ורווחה קטן מדי. כמו כן, חשוב למזער צבירי תאי השעית התא הבודדה המוכנה, כאשכולות תא יכולים להקטין את היעילות של טעינת תא הבודד ב-הבארות ללכוד.

כרגע הצבת תאים בודדים בנפרד בחלל תרבות מושגת בדרך כלל באמצעות דילול מגביל או תא מופעל קרינת מיון (FACS). למעבדות רבות, הגבלת דילול היא שיטה נוחה, כמו זה רק דורש צלחות תרבות פיפטה ורקמות, אשר זמינות. במקרה זה, השעית תא הוא מדולל סדרתי צפיפות תאים מתאימה, ולאחר מכן להציב לתוך בארות תרבות באמצעות פיפטה ידנית. תאים בודדים המחולקים אלה משמשים לניתוח תא, כגון מגוון גנטי הקרנת היווצרות 1 ו מושבת 2. עם זאת, שיטה זו היא נמוכה תפוקה ועבודה אינטנסיבית, ללא ניצול זרוע רובוטית עבור סיוע, כי טבעו התפלגות פואסון של שיטת הדילול המגבילה מגביל אירועים-תא בודד כדי הסתברות מקסימלית של 37% 3. מכונית FACS עם זרוע רובוטית משולבת יכול להתגבר על המגבלה של התפלגות פואסון ידי במדויק Placing מתא בודד אחד בתרבות היטב בכל פעם 4. עם זאת, לחץ הגזירה המכאני הגבוה (ובכך, הוריד כדאיויות תא) 5 ורכישת מכונית ועלויות תפעול מוגבלות השימוש שלה במעבדות רבות. כדי להתגבר על המגבלות לעיל, התקנים microscale פותחו כדי מאוד ביעילות לטעון תאים בודדים לתוך microwells 6. עם זאת, microwells אינו מספק מרחב מספיק עבור התאים הטעונים להתרבות, בשל הצורך של עשייה את הגודל של כל microwell קרוב לזה של תא בודד כדי להגביר את סיכוי טעינת תא הבודד. כמו מבחני תרבות נדרשים ביישומים רבים מבוסס תאים (למשל, clonogenic assay 7), microwells הגדול (מ 90 - 650 מיקרומטר בקוטר או באורך צד) גם כבר נוצל כדי לאפשר בתרביות תאים מורחבות. עם זאת, כמו שיטת הדילול המגבילה, הם גם בעלי יעילות טעינת תא בודדת נמוכה, הנעים בין 10 -. 30% 8, 9 בעבר, פיתחנו פלטפורמה microfluidic תפוקה גבוהה לבודד תאים בודדים microwells הפרט להפגין היישום שלה assay clonogenic של תאים בודדים. 10 המכשיר נעשתה עם פולי-dimethylsiloxane (PDMS), ונחלק לשני סטים של מערכים microwell עם גדלי microwell שונים, אשר יכול לשפר את היעילות בעיקר בטעינת תא בודד בתוך microwell שגודל הוא גדול יותר באופן משמעותי מאשר התא. יש לציין, זה &quot;כפול גם&quot; המושג מאפשר גודל השטח תרבות להיות מותאם באופן גמיש מבלי להשפיע על יעילות לכידת תא בודד, מה שהופך אותו פשוט כדי להתאים את העיצוב של המכשיר כדי להתאים סוגים ויישומים סלולריים שונים. שיטת יעילות גבוהה זה צריכה להיות שימושי עבור ניסויים בתרביות תאים לטווח ארוכים ללימודי ההטרוגניות תא הקמת קו סלולארי חד שבטית.

<table><tbody><tr><td>AutoCAD software</td><td>Autodesk</td><td>AutoCAD LT 2011</td><td>Part No. 057C1-74A111-1001</td></tr><tr><td>Silicon wafer&amp;nbsp;</td><td>Eltech corperation</td><td>SPE0039</td><td></td></tr><tr><td>Conventional oven</td><td>YEONG-SHIN company</td><td>ovp45</td><td></td></tr><tr><td>Plasma cleaner</td><td>Nordson</td><td>AP-300</td><td>Bench-Top Plasma Treatment System</td></tr><tr><td>SU-8 50 negative photoresist</td><td>MicroChem</td><td>Y131269</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 100 negative photoresist</td><td>MicroChem</td><td>Y131273</td><td></td></tr><tr><td>Spin coater</td><td>Synrex Co., Ltd.</td><td>SC-HMI 2&quot; ~ 6&quot;</td><td></td></tr><tr><td>Hotplate</td><td>YOTEC company</td><td>YS-300S</td><td></td></tr><tr><td>Msak aligner</td><td>Deya Optronic CO.</td><td>A1K-5-MDA</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 developer</td><td>Grand Chemical Companies</td><td>GP5002-000000-72GC</td><td>Propylene glycol monomethyl ether acetate</td></tr><tr><td>Scanning laser profilometer</td><td>KEYENCE</td><td>VK-X 100</td><td></td></tr><tr><td>Trichlorosilane</td><td>Gelest, Inc</td><td>SIT8174.0</td><td>Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl. Hazardous. Corrosive to the respiratory tract, reacts violently with water.</td></tr><tr><td>Desiccator</td><td>Bel-Art Products</td><td>F42020-0000</td><td>Space saver vacuum desiccator 190&amp;nbsp;mm white base</td></tr><tr><td>Polydimethylsiloxane (PDMS) kit</td><td>Dow corning</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>Harris Uni-Core puncher</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>15072</td><td>with 0.75 mm inner-diameter</td></tr><tr><td>Removable tape</td><td>3M Company</td><td>Scotch Removable Tape 811</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Leica Microsystems</td><td>Leica E24</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA)</td><td>Bersing Technology</td><td>ALB001.500</td><td></td></tr><tr><td>DMEM basal medium</td><td>Gibco</td><td>12800-017</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Thermo Hyclone</td><td>SH30071.03HI</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotics</td><td>Biowest</td><td>L0014-100</td><td>Glutamine-Penicillin-Streptomycin</td></tr><tr><td>Recombinant enzyme mixture</td><td>Innovative cell technology</td><td>AM-105</td><td>Accumax</td></tr><tr><td>DiIC12(3) cell membrane dye</td><td>BD Biosciences</td><td>354218</td><td>Used as a cell tracker</td></tr><tr><td>Syringe pump</td><td>Harvard Apparatus</td><td>703007</td><td></td></tr><tr><td>Plastic syringe (1 ml)</td><td>BD Biosciences</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>23 gauge blunt needles</td><td>Ever Sharp Technology, Inc.</td><td>TD21</td><td></td></tr><tr><td>Poly-tetrafluoroethene (PTFE) tubing</td><td>Ever Sharp Technology, Inc.</td><td>TFT-23T</td><td>inner diameter, 0.51&amp;nbsp;mm; outer diameter, 0.82&amp;nbsp;mm</td></tr></tbody></table>

a microfluidic platform for high-throughput single-cell isolation and culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.

פלטפורמת microfluidic לבידוד תא בודד והתרבות כוללת microchannel (200 מיקרומטר גובה) עם שני סטים של מערכי microwell (איור 2 א). שני סטים של מערכים microwell מכונים כמו-גם ללכוד (25 מיקרומטר בקוטר 27 מיקרומטר עומק) ו-גם תרבות (285 מיקרומטר בקוטר 300 מיקרומטר עומק) לבידוד תא בודד והתרבות, בהתאמה, וכל אחד לכידת היטב ממוקם במרכז א-היטב בתרבות כאשר הם מוצגים מתוך-מבט מלמעלה (תרשים 2B). עבור פעולת המכשיר (זרימת המבצע סכמטי מתוארת באיור 1), הציוד הנדרש (משאבת מזרק, החממה בתרבית רקמה, ומיקרוסקופים) ואספקה ​​(מזרק, טפטפת, צינורות) זמינים נפוץ במעבדות ביולוגיות. יתר על כן, את הטלטלות ושקיפות של הפלטפורמה אפשר לתאים כדי לקרוא אות בקלות ונותחו מכשיר עם convenמיקרוסקופ תזונתית במהלך ניסוי תרבית תאים. יעילות הלכידה של תאים בלכידה-הבארות לאחר טווחי כביסת צעד מ 67.80 ± 11.38% ל 85.16 ± 1.91% (תלוי בסוג התא) (איור 3 א). יתר על כן, רוב-הבארות ללכוד מכילים תא יחיד בלבד עבור כל שלושת סוגי התאים (89.89% - 92.98%), אשר אושרו על ידי ניתוח מספר התא העמוס-בארות התרבות (איור 3). יעילות בידוד התא בודד הסופית-בארות התרבות הייתה יותר מ -76% עבור KT98 ותאי מד&quot;א- MB-435, אבל רק 61% עבור תאי A549 בשל הבדלים בגודל תא בין סוגי התאים הנבדקים. לחקר הסרטן, assay clonogenic של תאים בודדים יכול להיות מנוצל כדי לבדוק עמידות לתרופות ושיעורי התפשטות של מושבות תאים בודדים. תרבות התא assay clonogenic של חד תאים המבודדים ב p שלנוlatform בוצע על ידי לרענן את מדיום התרבות כל 2 ד. הפגנה זה מדגישה את תחולתו של התקן זה ללימוד ההטרוגניות הסלולר ברמת התא הבודדה על ידי מדידת הבדלי הישרדות תא ושיעורי התפשטות של תאים בודדים. שיעור ההטרוגניות תרבות התאים של התאים המבודדים נותח מתמונות יומיומיות רכשו. התוצאות הראו כי תאים בודדים בודדים יכול להיות מתורבת עבור 7 ד והציג דפוסי צמיחה שונים. לדוגמא, 13% של התאים המבודדים לא היו חלוקת תא ונשארו כמו תא אחד בודד (האיור 4B), בעוד 17.5% מכלל התאים מחולקים יותר מ -15 תאי מושבות תאים נוצרים (איור 4 א) במהלך התרבות. ההטרוגניות סלולרית בין התאים מתרבים העידה גם על ידי דפוסי הצמיחה השונים שלהם להרכיב שני תאים (4.3%), שלושה תאים (2.5%), ו 4 - 14 תאים(15%) בניסוי תרבית תאים (איור 4C). תוצאות אלו הצביעו על כך הפלטפורמה יכול לשמש תרבית תאים לטווח ארוך, מבחני clonogenic, ומחקרים ההטרוגניות הסלולר. לאחר מספר רב של מושבות תאים בודדות גדלו באזור טביעת רגל קטן גם עושה ניתוח מיקרוסקופי של התאים קלים. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54105/54105fig1.jpg" /> . באיור 1. איור סכמטי של זרימת מבצע לבידוד תא בודד תפוקה גבוהה ותרבות במצע microfluidic הליך הפעולה לבידוד תא בודד ותרבות המשובטת כולל 4 שלבים: א) תאי עומס לתוך microchannel ידי טיפ פלסטיק פיפטה ידנית; ii) לשטוף את התאים שלא נלכדו עם מדיום תרבות טרי המופעל ע&quot;י משאבת מזרק; iii) לאחר איטום פתחי הכניסה והיציאה עם תקעים, את היאתאי olated הועברו-בארות ללכוד-בארות תרבות ידי הפיכת המכשיר; ו- IV) לבצע תרבות המשובטת (assay clonogenic) ב-בארות תרבות. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54105/54105fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54105/54105fig2.jpg" /> צילום איור 2. ותמונות SEM של פלטפורמת בידוד והתרבות תא בודד microfluidic. (א) פלטפורמת Microfluidic עמוסה צבע אדום שמראה המבנים microchannel ו microwell לתרבות תא בודד. (ב) תמונה מייצגת נלקח ממכשיר לחתוך, המציג את השקפת הצד של שלוש יחידות תא בודד בידוד המשובטים תרבות במצע microfluidic. סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר. SEM תמונות של תרבות תא בודד (C) ללכוד (D </sטרונג&gt;) מבנים (microwells בגדלים שונים). הגדלים של microwells יכולים להיות מותאמים עבור סוגי תאים מסוימים ואסטרטגיות תרבות. סרגל קנה מידה:. 1 מ&quot;מ <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54105/54105fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/54105/54105fig3.jpg" /> איור 3. KT98, A549, ו מד&quot;א- MB-435 יעילות בידוד תא בודד במצע microfluidic. (א) יעיל של KT98, A549, ו מד&quot;א- MB-435 תאים שנתפסו ללכוד-בארות לאחר שטיפת התאים בלתי הלכודים . יעילות לכידתו של תאים הייתה מן 67.80% ל 85.16% ב סוגי התאים השלושה. (ב) יחס התא הבודד ב-בארות תרבות כוללות (בר לוכסן) היה יותר מ -76% עבור KT98 ו מד&quot;א- MB-435, אבל 61.63% עבור A549. (C) תמונה מייצגת של חד תאי KT98 הפרט(אדום, מוכתם גשש תא) מבודד-בארות תרבות גדולות לתרבות משובטת. סרגל קנה מידה: 300 מיקרומטר. (ד) מספר תא ב-בארות תרבות כבושי תא של המודל הסלולרי KT98. היחס-בארות התרבות היה 77.3% עם תא בודד, 16.31% ללא תאים, 5.96% עם שני תאים, ו 0.43% עם יותר משלושה תאים. ברי שגיאה מיוצגים ± SD. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54105/54105fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/54105/54105fig4.jpg" /> איור 4. תרבית תאים, assay clonogenic, ולימוד ההטרוגניות הסלולר של תאי A549 מבודדים במצע microfluidic עבור 7 ד. (א) גדלו תא בודד מבודד התרבו כדי מושבת תא היטב בתרבות. (ב) שרד תא בודד ומבודד, אך לא לחלק, לאחר 7 דתרבות. סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר. (ג) יחיד תאים מבודדים הציג דפוסי צמיחה הטרוגנית לאחר בתרבית למשך 7 ד. ברי שגיאה מיוצגים ± SD. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54105/54105fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture at JoVE.com

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.

פלטפורמת Microfluidic עבור בידוד תפוקה גבוהה מתא בודד ותרבות

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

a-microfluidic-platform-for-high-throughput-single-cell-isolation

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.2K Views.  National Health Research Institutes, Taiwan. Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture. 

Video: A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Microfluidic Picoliter Bioreactor for Microbial Single-cell Analysis: Fabrication, System Setup, and Operation

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described in detail. The PLBR can be utilized for the analysis of single bacteria and microcolonies to investigate biotechnological and microbiological related questions concerning, e.g.&#160;cell growth, morphology, stress response, and metabolite or protein production on single-cell level. The device features continuous media flow enabling constant environmental conditions for perturbation studies, but in addition allows fast medium changes as well as oscillating conditions to mimic any desired environmental situation. To fabricate the single use devices, a silicon wafer containing sub micrometer sized SU-8 structures served as the replication mold for rapid polydimethylsiloxane casting. Chips were cut, assembled, connected, and set up onto a high resolution and fully automated microscope suited for time-lapse imaging, a powerful tool for spatio-temporal cell analysis. Here, the biotechnological platform organism Corynebacterium glutamicum&#160;was seeded into the PLBR and cell growth and intracellular fluorescence were followed over several hours unraveling time dependent population heterogeneity on single-cell level, not possible with conventional analysis methods such as flow cytometry. Besides insights into device fabrication, furthermore, the preparation of the preculture, loading, trapping of bacteria, and the PLBR cultivation of single cells and colonies is demonstrated. These devices will add a new dimension in microbiological research to analyze time dependent phenomena of single bacteria under tight environmental control. Due to the simple and relatively short fabrication process the technology can be easily adapted at any microfluidics lab and simply tailored towards specific needs.

In this protocol the fabrication, setup and basic operation of a microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) for single-cell analysis of prokaryotic microorganisms is introduced. Industrially relevant microorganisms were analyzed as proof of principle allowing insights into growth rate, morphology, and phenotypic heterogeneity over certain time periods, hardly possible with conventional methods.

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described ...

A Versatile Automated Platform for Micro-scale Cell Stimulation Experiments

Study of cells in culture (in vitro analysis) has provided important insight into complex biological systems. Conventional methods and equipment for in vitro analysis are well suited to study of large numbers of cells (&ge;105) in milliliter-scale volumes (&ge;0.1 ml). However, there are many instances in which it is necessary or desirable to scale down culture size to reduce consumption of the cells of interest and/or reagents required for their culture, stimulation, or processing. Unfortunately, conventional approaches do not support precise and reproducible manipulation of micro-scale cultures, and the microfluidics-based automated systems currently available are too complex and specialized for routine use by most laboratories. To address this problem, we have developed a simple and versatile technology platform for automated culture, stimulation, and recovery of small populations of cells (100 - 2,000 cells) in micro-scale volumes (1 - 20 &mu;l). The platform consists of a set of fibronectin-coated microcapillaries ("cell perfusion chambers"), within which micro-scale cultures are established, maintained, and stimulated; a digital microfluidics (DMF) device outfitted with "transfer" microcapillaries ("central hub"), which routes cells and reagents to and from the perfusion chambers; a high-precision syringe pump, which powers transport of materials between the perfusion chambers and the central hub; and an electronic interface that provides control over transport of materials, which is coordinated and automated via pre-determined scripts. As an example, we used the platform to facilitate study of transcriptional responses elicited in immune cells upon challenge with bacteria. Use of the platform enabled us to reduce consumption of cells and reagents, minimize experiment-to-experiment variability, and re-direct hands-on labor. Given the advantages that it confers, as well as its accessibility and versatility, our platform should find use in a wide variety of laboratories and applications, and prove especially useful in facilitating analysis of cells and stimuli that are available in only limited quantities.

We have developed an automated cell culture and interrogation platform for micro-scale cell stimulation experiments. The platform offers simple, versatile, and precise control in cultivating and stimulating small populations of cells, and recovering lysates for molecular analyses. The platform is well suited to studies that use precious cells and/or reagents.

פלטפורמה אוטומטית צדדי לניסויים בגירוי תא מיקרו בקנה מידה

Study of cells in culture (in vitro analysis) has provided important insight into complex biological systems. Conventional methods and equipment for in ...

A Microfluidic Chip for the Versatile Chemical Analysis of Single Cells

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this purpose, the cells are passively trapped in the middle of a microchamber. Upon activation of the control layer, the cell is isolated from the surrounding volume in a small chamber. The surrounding volume can then be exchanged without affecting the isolated cell. However, upon short opening and closing of the chamber, the solution in the chamber can be replaced within a few hundred milliseconds. Due to the reversibility of the chambers, the cells can be exposed to different solutions sequentially in a highly controllable fashion, e.g. for incubation, washing, and finally, cell lysis. The tightly sealed microchambers enable the retention of the lysate, minimize and control the dilution after cell lysis. Since lysis and analysis occur at the same location, high sensitivity is retained because no further dilution or loss of the analytes occurs during transport. The microchamber design therefore enables the reliable and reproducible analysis of very small copy numbers of intracellular molecules (attomoles, zeptomoles) released from individual cells. Furthermore, many microchambers can be arranged in an array format, allowing the analysis of many cells at once, given that suitable optical instruments are used for monitoring. We have already used the platform for proof-of-concept studies to analyze intracellular proteins, enzymes, cofactors and second messengers in either relative or absolute quantifiable manner.

In this article we present a microfluidic chip for single cell analysis. It allows the quantification of intracellular proteins, enzymes, cofactors, and second messengers by means of fluorescent assays or immunoassays.&#160;

שבב microfluidic לניתוח הכימי תכליתי של תאים בודדים

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this ...

The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture

The ever growing amount of new substances released onto the market and the limited predictability of current in vitro test systems has led to a high need for new solutions for substance testing. Many drugs that have been removed from the market due to drug-induced liver injury released their toxic potential only after several doses of chronic testing in humans. However, a controlled microenvironment is pivotal for long-term multiple dosing experiments,&#160;as even minor alterations in extracellular conditions may greatly influence the cell physiology. We focused within our research program on the generation of a microengineered bioreactor, which can be dynamically perfused by an on-chip pump and combines at least two culture spaces for multi-organ applications. This circulatory system mimics the in vivo conditions of primary cell cultures better and assures a steadier,&#160;more quantifiable extracellular relay of signals to the cells. 
For demonstration purposes, human liver equivalents, generated by aggregating differentiated HepaRG cells with human hepatic stellate cells in hanging drop plates, were cocultured with human skin punch biopsies for up to 28 days inside the microbioreactor. The use of cell culture inserts enables the skin to be cultured at an air-liquid interface, allowing topical substance exposure. The microbioreactor system is capable of supporting these cocultures at near physiologic fluid flow and volume-to-liquid ratios, ensuring stable and organotypic culture conditions. The possibility of long-term cultures enables the repeated exposure to substances. Furthermore, a vascularization of the microfluidic channel circuit using human dermal microvascular endothelial cells yields a physiologically more relevant vascular model.

Here, we present a protocol to coculture primary cells, tissue models and punch biopsies in a microfluidic multi-organ chip for up to 28 days. Human dermal microvascular endothelial cells, liver aggregates and skin biopsies were successfully combined in a common media circulation.

צ&#39;יפ Multi-האיבר - פלטפורמת Microfluidic לCoculture Multi-רקמה לטווח ארוך

The ever growing amount of new substances released onto the market and the limited predictability of current in vitro test systems has led to a high need ...

A Microfluidic Platform for Precision Small-volume Sample Processing and Its Use to Size Separate Biological Particles with an Acoustic Microdevice

A major advantage of microfluidic devices is the ability to manipulate small sample volumes, thus reducing reagent waste and preserving precious sample. However, to achieve robust sample manipulation it is necessary to address device integration with the macroscale environment. To realize repeatable, sensitive particle separation with microfluidic devices, this protocol presents a complete automated and integrated microfluidic platform that enables precise processing of 0.15&#8211;1.5 ml samples using microfluidic devices. Important aspects of this system include modular device layout and robust fixtures resulting in reliable and flexible world to chip connections, and fully-automated fluid handling which accomplishes closed-loop sample collection, system cleaning and priming steps to ensure repeatable operation. Different microfluidic devices can be used interchangeably with this architecture. Here we incorporate an acoustofluidic device, detail its characterization, performance optimization, and demonstrate its use for size-separation of biological samples. By using real-time feedback during separation experiments, sample collection is optimized to conserve and concentrate sample. Although requiring the integration of multiple pieces of equipment, advantages of this architecture include the ability to process unknown samples with no additional system optimization, ease of device replacement, and precise, robust sample processing.

This protocol describes a system architecture for performing automated small volume (0.15&#8211;1.5 ml) particle separations using a microfluidic device, and discusses methods to optimize acoustofluidic device performance and operation.

פלטפורמת microfluidic לעיבוד מדגם Precision הקטן-נפח ושימוש בו לגודל חלקיקים הביולוגיים נפרדים עם Microdevice אקוסטי

A major advantage of microfluidic devices is the ability to manipulate small sample volumes, thus reducing reagent waste and preserving precious sample. ...

An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of cellular heterogeneity in biological systems. However, single-cell sequencing of large populations has been hampered by limitations in processing genomes for sequencing. In this paper, we describe a method for single-cell genome sequencing (SiC-seq) which uses droplet microfluidics to isolate, amplify, and barcode the genomes of single cells. Cell encapsulation in microgels allows the compartmentalized purification and tagmentation of DNA, while a microfluidic merger efficiently pairs each genome with a unique single-cell oligonucleotide barcode, allowing &gt;50,000 single cells to be sequenced per run. The sequencing data is demultiplexed by barcode, generating groups of reads originating from single cells. As a high-throughput and low-bias method of single-cell sequencing, SiC-seq will enable a broader range of genomic studies targeted at diverse cell populations.

Single-cell sequencing reveals genotypic heterogeneity in biological systems, but current technologies lack the throughput necessary for the deep profiling of community composition and function. Here, we describe a microfluidic workflow for sequencing &gt;50,000 single-cell genomes from diverse cell populations.

פלטפורמת Microfluidic על קוליים בתפוקה של רצף הגנום בתא יחיד

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of ...

Establishing Single-Cell Based Co-Cultures in a Deterministic Manner with a Microfluidic Chip

Cell co-culture assays have been widely used for studying cell-cell interactions between different cell types to better understand the biology of diseases including cancer. However, it is challenging to clarify the complex mechanism of intercellular interactions in highly heterogeneous cell populations using conventional co-culture systems because the heterogeneity of the cell subpopulation is obscured by the average values; the conventional co-culture systems can only be used to describe the population signal, but are incapable of tracking individual cells behavior. Furthermore, conventional single-cell experimental methods have low efficiency in cell manipulation because of the Poisson distribution. Microfabricated devices are an emerging technology for single-cell studies because they can accurately manipulate single cells at high-throughput and can reduce sample and reagent consumption. Here, we describe the concept and application of a microfluidic chip for multiple single-cell co-cultures. The chip can efficiently capture multiple types of single cells in a culture chamber (~46%) and has a sufficient culture space useful to study the cells&#39; behavior (e.g., migration, proliferation, etc.) under cell-cell interaction at the single-cell level. Lymphatic endothelial cells and oral squamous cell carcinoma were used to perform a single-cell co-culture experiment on the microfluidic platform for live multiple single-cell interaction studies.

This report describes a microfluidic chip-based method to set up a single cell culture experiment in which high-efficiency pairing and microscopic analysis of multiple single cells can be achieved.

הקמת תרבויות בודדות מבוססות-משותפות באופן דטרמיניסטי עם שבב מיקרופלואידיסי

Cell co-culture assays have been widely used for studying cell-cell interactions between different cell types to better understand the biology of diseases ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and organs are either highly expensive, like robotics, or lack nanoliter volume and millisecond time accuracy in liquid manipulation. We herein present the design and fabrication of a microfluidic system, which consists of 1,500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. To demonstrate the capacities of the microfluidic device, neural stem cell (NSC) spheres are maintained in the proposed system. We observed that when the NSC sphere is exposed to CXCL in day 1 and EGF in day 2, the round-shaped conformation is well maintained. Variation in the input order of 6 drugs causes morphological changes to the NSC sphere and the expression level representative marker for NSC stemness (i.e., Hes5 and Dcx). These results indicate that dynamic and complex environmental conditions have great effects on NSC differentiation and self-renewal, and the proposed microfluidic device is a suitable platform for high throughput studies on the complex life machinery.

We present a microfluidic system for high throughput studies on complex life machinery, which consists of 1500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. The microfluidic chip allows for the analysis of the highly complex and dynamic micro-environmental conditions in vivo.

יצירת תנאי סביבה דינמיים באמצעות מכשיר מיקרופלואידי בעל תפוקה גבוהה

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...

Clinical Microfluidic Chip Platform for the Isolation of Versatile Circulating Tumor Cells

Circulating tumor cells (CTCs) are significant in cancer prognosis, diagnosis, and anti-cancer therapy. CTC enumeration is vital in determining patient disease since CTCs are rare and heterogeneous. CTCs are detached from the primary tumor, enter the blood circulation system, and potentially grow at distant sites, thus metastasizing the tumor. Since CTCs carry similar information to the primary tumor, CTC isolation and subsequent characterization can be critical in monitoring and diagnosing cancer. The enumeration, affinity modification, and clinical immunofluorescence staining of rare CTCs are powerful methods for CTC isolation because they provide the necessary elements with high sensitivity. Microfluidic chips offer a liquid biopsy method that is free of any pain for the patients. In this work, we present a list of protocols for clinical microfluidic chips, a versatile CTC isolating platform, that incorporate a set of functionalities and services required for CTC separation, analysis, and early diagnosis, thus facilitating biomolecular analysis and cancer treatment. The program includes rare tumor cell counting, clinical patient blood preprocessing, which includes red blood cell lysis, and the isolation and recognition of CTCs in situ on microfluidic chips. The program allows the precise enumeration of tumor cells or CTCs. Additionally, the program includes a tool that incorporates CTC isolation with versatile microfluidic chips and immunofluorescence identification in situ on the chips, followed by biomolecular analysis.

The clinical microfluidic chip is an important biomedical analysis technique that simplifies clinical patient blood sample preprocessing and immunofluorescently stains circulating tumor cells (CTCs) in situ on the chip, allowing the rapid detection and identification of a single CTC.

פלטפורמת שבבים מיקרופלואידית קלינית לבידוד תאי גידול רב-תכליתיים במחזור הדם

Circulating tumor cells (CTCs) are significant in cancer prognosis, diagnosis, and anti-cancer therapy. CTC enumeration is vital in determining patient ...

Automated and High-throughput Microbial Monoclonal Cultivation and Picking Using The Single-cell Microliter-droplet Culture Omics System

Pure bacterial cultures are essential for the study of microbial culturomics. Traditional methods based on solid plates, well plates, and micro-reactors are hindered by cumbersome procedures and low throughput, impeding the rapid progress of microbial culturomics research. To address these challenges, we had successfully developed the Single-cell Microliter-droplet Culture Omics System (MISS cell), an automated high-throughput platform that utilizes droplet microfluidic technology for microbial monoclonal isolation, cultivation, and screening. This system can generate a large number of single-cell droplets and cultivate, screen, and collect monoclonal colonies in a short time, facilitating an integrated process from microbial isolation to picking. In this protocol, we demonstrated its application using the isolation and cultivation of human gut microbiota as an example and compared the microbial isolation efficiency, monoclonal culture performance, and screening throughput using the solid-plate culture method. The experimental workflow was simple, and reagent consumption was very low. Compared to solid-plate culture methods, the MISS cell could cultivate a greater diversity of gut microbiota species, offering significant potential and value for microbial culturomics research.

This protocol describes how to use the Single-cell Microliter-droplet Culture Omics System (MISS cell) to perform microbial monoclonal isolation, cultivation, and picking. The MISS cell achieves an integrated workflow based on droplet microfluidic technology, which offers excellent droplet monodispersity, high parallel cultivation, and high-throughput biomass detection.

גידול וקטיף חד-שבטי מיקרוביאלי אוטומטי ובתפוקה גבוהה באמצעות מערכת אומיקס תרבית מיקרוליטר-טיפה חד-תאית

Pure bacterial cultures are essential for the study of microbial culturomics. Traditional methods based on solid plates, well plates, and micro-reactors ...