This research was supported by Advanced Research Projects Agency - Energy (ARPA-E) Award No. DE-AR0000313.

懸濁細胞培養の1の確立<ol><li>蒸留900 mlの4.43 gでLinsmaier＆スクーグ基本培地、スクロース30gを、200mgのKH 2 PO 4、及び2,4-ジクロロフェノキシ酢酸（2,4-D）200μgのを添加することにより、BY-2培地液を調製水および0.1 M KOHで5.8にpHを。 pHを調整した後、蒸留水、オートクレーブで千ミリリットルへの最終的な音量を調整します。培地は4℃​​で2週間まで保存することができます。 </li><li> 1％を添加した培地BY-2 BY-2液を100mlの培地およびBY-2固体上に成長したBY-2カルス（&gt;直径1cm）の一枚の媒体（液体250 mlの三角フラスコに接種寒天）とアルミニウム箔でシール。 5日間振とうしながら28から30℃で培養をインキュベートします。 注：液体培養物は急速に過剰に増殖ますようBY-2カルスは、長期保存のための固体培地上で維持されます。培養容量は、典型的には、100mlの培養物は、30個の6-Wロード可能となり、必要に応じて調整することができますエルプレート。 </li><li>転送2 BY-2培養新鮮BY-2メディアの98ミリリットルに対数期のミリリットル、振とうしながら28から30℃で5〜7日間インキュベートします。 注：カルス100 5-7日齢の培養物の希釈物ではなく、接種：確立された液体培養物の継代培養は、定期的に1を用いて行うことができます。 </li><li>細胞が急速に沈降するよう、徹底的に文化をミックスし、転送細胞培養の6ミリリットルを15ミリリットルコニカル遠心管に、細胞は、少なくとも10分間沈降させます。上清を除去することにより、全体積の50％まで充填細胞音量を調整します。 </li><li>消化のための6ウェルプレートの各ウェルに500μlのを反転してピペットでチューブを振ります。彼らは密であるように、この段階で細胞を転送するために広い口径のピペットを使用し、標準的なピペットチップを詰まらせます。 </li></ol> 2.プロトプラストの単離<ol><li>ロボットシステム（ 図1A）のすべてのコンポーネントをオンにして、ソフトスケジューリングプレートムーバタスクを開きますウェア。タスクスケジューリングプログラムは、各機器間のプレートの移動を可能にするために他の機器とマイクロムーバを統合します。 </li><li>実験に先立ち、プロトコルで使用される技術的な実験機器の仕様（ 例えば 、プレート、蓋）を定義するだけでなく、次のように、プレートムーバソフトウェアで、実験器具の各部分のための開始位置と終了： <ol><li>プレートムーバソフトウェアのメインツールバーからセットアップをクリックし、[ 管理コンテナタイプ]コマンドを選択します。 </li><li>コンテナタイプが既存のコンテナタイプライブラリに記載されている場合は、適切なコンテナを選択します。 </li><li>コンテナタイプが既存のコンテナタイプライブラリに記載されていない場合、新しいコンテナ型を指定するには、[ 追加 ] をクリックします。 </li><li>新しいコンテナ型を追加した後、適切なタブに新しいコンテナ（高さ、幅、寸法を積み重ね、グリッパオフセット）の寸法を挿入し、[ 保存 ] をクリックします。<ol><li>正しい寸法はメーカーから利用できない場合は、正確にキャリパーを使用して、最も近いミリメートルまでのすべての寸法を決定。コンテナの寸法を測定する際のエラーは、プレート移動装置の故障の原因となります。 </li></ol></li><li>繰り返しは、プレート・ムーバーが遭遇するすべてのコンテナ型のための2.2.4.1を介して、2.2.2繰り返します。すべての実験器具のために、この工程の完了後、各容器（ステップ2.2.6）の開始と終了の位置を定義する必要があります。 注：このプロトコルについて実験器具は6ウェルプレート、ディープウェルプレート、および96ウェル蛍光スクリーニングプレートを含んでいます。 </li><li>各コンテナの開始と終了位置を定義するには、特定のプロトコルに開始/終了]タブをクリックします。まず、各コンテナの開始位置を選択します。次に、開始と終了位置の両方で蓋付き/ Unliddedためのチェックボックスをオンにします。すべてのコンテナのために繰り返します。 注：コンテナは、EQUの別の部分に残される場合ipment（代わりにプレートムーバの）終了位置を空白のままにすることができます。 </li></ol></li><li>この段階で手動で全体のワークフローの開始位置にすべてのプレートをロードします。ホテル3、プレートヒーター/冷却器巣2、及び50 mLコニカルに変換するために使用される96ディープウェルプレートにBY-2細胞を96ウェル蛍光ホテル2にスクリーニングプレート、6ウェルプレートにロードマルチモードディスペンサー上に酵素液を含むチューブ（ 補足ファイル 、第1.2.2項を参照してください）。 <ol><li>変換は、プロトコルで行わOFPレポーター構築物を含むウェルあたりプラスミドDNA（1μgの/μlの、260/280&gt; 1.8）10μlのとプリロード96ディープウェルプレートとプレート上でインキュベートされる場合4℃でヒーター/チラー。各ウェルは、従って充填ウェルの数は、実験に依存し、単一の形質転換のために使用されます。 </li></ol></li><li>自動化上のすべての電源およびプレートをロード指定された場所にあるD液体処理プラットフォームとは、自動化制御ソフトウェア（ 図1B）の各項目の位置を定義します。 <ol><li> MMGで40％PEG（0.4 Mマンニトール、100のMgCl 2、4mMのMES、pHは5.7）列1で、ヨウ化プロピジウム（PI、を1μg/ ml）を200μlの200μlのプリロード96ウェルプレートをロード列2、列3（巣2）中のエタノールを200μl、および巣8でのピペットチップのボックスに入力します。 </li><li> 、自動液体処理プラットフォームのソフトウェアで実験器具の位置を定義メニューから[ ツールや実験器具エディタをクリックします。 </li><li>プルダウンメニューから、実験器具の種類を選択するか、 新しい実験器具のボタンを使用して、新しい実験器具タイプを定義します。 </li><li> 主なプロトコル]タブを選択し、Configure実験器具をクリックして選択実験器具の各部分の位置を定義します。自動液体処理プラットフォーム上に配置された実験器具の各部分であることを確認してくださいプロトコルを実行する前に定義されています。 </li><li>自動化されたプロトコルをトリガするには、プロファイル・エクスプローラウィンドウをクリックして、実行するプロトコル（ プロトプラストの単離 、 セル数 、およびPEG媒介形質転換 ）の名前を選択します。 </li><li>プロトコルで使用されるすべてのデバイスを初期化するために、[ 実行 ] をクリックします。 </li><li>最後に、ワークエクスプローラウィンドウで、システム内のすべてのコンテナ/実験器具を確認し、自動化されたプロトコルを開始するために作業ユニットを追加 ] をクリックします。 注：自動化されたプロトコルの完全な説明は補足ファイルに含まれています。 </li></ol></li></ol> 3.細胞数の標準曲線を確立<ol><li>手動で1 mlの容量で、1×10 6プロトプラスト/ mlの濃度でプロトプラストを濃縮します。遠心分離機は10分1,000×gでプロトプラスト、上清を除去します。 </li><li>手動プロトプラストペレットに（4℃で維持）の70％エタノール900μlを添加しますそしてペレットを再懸濁します。細胞を固定するために、氷上で10分間インキュベートします。 </li><li>核を標識し、プレートリーダーによる検出を可能にするために、プロトプラストにPI（1μg/ ml）の100μlのを追加します。 </li><li>負荷BY-2液の80μlを96ウェル蛍光スクリーニングプレートの各列と行にメディアが2列で始まります。 </li><li> 96ウェル蛍光スクリーニングプレートの列1で、列に各ウェルにBY-2メディアプロトプラスト70μlの50μlを添加します。 </li><li>自動液体処理プラットフォームの巣6に板を置き、2倍連続希釈を実行します。 <ol><li>自動液体処理プラットフォーム上で連続希釈を行うために、 シリアル希釈ウィザードを起動し、転送量（60μl）を調整し、ミックスとボリューム（2、70μl）を、最初のウェル（カラム1、行AF）の数、希釈クリックウェル（列2-11、行AF）、および吸引及び分配する性質（ウェル底から0.5ミリメートル）。 </li><li>パラメータを設定した後、保存プロトコルを実行しますdは。 注：すべてのプロトプラスト（細胞の固定化のために）PIで標識されているので、蛍光がプロトプラストの濃度に比例します。 </li><li>連続希釈が完了した後、ネスト9からプレートを取り外し、プレートリーダーに挿入し、プレートリーダーソフトウェアの標準曲線プロトコルを実行します。 注：標準曲線は、既知のプロトプラストの濃度で各ウェルにPI（励起536 nmの/発光620 nm）での蛍光を比較することによって生成されます。 </li></ol></li><li>プレートリーダープロトコルが完了すると、プレートを取り外し、オートクレーブまたは「バイオセーフティプロトコルで定義されている他の脱活性化の手順については、任意のトランスジェニック細胞を収集します。 </li></ol>変革の4顕微鏡分析<ol><li>ロボットシステムのホテル1から形質転換されたプロトプラスト（自動プロトコル3、 補足ファイルの製品）でプレートを取り外します。 </li><li>順番倒立顕微鏡、カメラ、および蛍光灯に。 </li><li>プロトプラストに焦点を当てた初期のための10倍の対物レンズを選択し、ハロゲンランプをオンにし、蛍光ランプ用のシャッターを閉じます。 </li><li>明を使用してプロトプラストに微細システムとフォーカス上にロードプレート。 </li><li>プロトプラストに焦点を当てた後、ハロゲン電球をオフにして、蛍光灯のためのシャッターを開きます。 </li><li>トランスジェニックプロトプラストによって発現pporRFPタンパク質の可視化のために設定CY3 / TRITCフィルターを選択します。 </li><li> pporRFP蛍光マーカーを発現するプロトプラストの数を決定するために、各ウェルをスキャンします。 </li><li>蛍光マーカーをプロトプラストの合計数を表すプロトプラストの総数として、形質転換効率を計算します。 </li><li>オートクレーブ処理または「バイオセーフティプロトコルで定義されている他の脱活性化の手順については、承認されたバイオセーフティバッグでトランスジェニック細胞を含む任意のプレートを収集します。 </li></ol>

著者は、彼らが競合する経済的利害関係を持っていないことを宣言します。

上記のプロトコルが正常BY-2タバコ懸濁細胞培養を用いてプロトプラスト単離、列挙、および形質転換のために検証されています。しかしながら、このプロトコルは容易に任意の植物懸濁培養に拡張することができます。現時点では、プロトプラストの分離および形質転換は、トウモロコシ（ トウモロコシ ）10、ニンジン（ ニンジン属のcarota）32、ポプラ（ ?...

除草剤抵抗性2を与える、様々な疾患1を克服するために、トランスジェニック作物の設計上に配置された有意な刺激があった近年、バイオマス収率7を高める、草食性6を防ぐ、干ばつ3,4および塩耐性5を付与し、細胞壁の反抗を減少させます8。この傾向は、CRISPRとTALENs 9を用いて、ゲノム編集、およびdsRNAの10、miRNAの11、およびsiRNA 12を介して遺伝子サイレンシングを含むトランスジェニック植物を生成するための新たな分子ツールの開発によって支援されています。これらの技術は、トランスジェニック植物の生成を簡略化しているが、彼らはまた、生成されたトランスジェニック植物の膨大な数は植物体再生に依存している従来のシステムを用いてスクリーニングすることができないボトルネックを作成しました。 、多くのサイレンシングゲノム編集構築物が急速に植物内に挿入することができるが、このボトルネックに関連します標的の形質は、植物を温室内で分析されるまで、頻繁に発見されていない所望の効果を生み出すことができません。この研究では、特異的ゲノム編集及び遺伝子サイレンシングの標的の多数の初期スクリーニングにおいて現在のボトルネックに対処するために、植物プロトプラストの迅速、自動化、ハイスループットスクリーニングのための方法を開発しました。 無傷の植物細胞とは対照的に、プロトプラストの使用は、自動化されたプラットフォームの開発のためのいくつかの利点を有します。まず、プロトプラストは、植物細胞壁の消化後に単離されており、もはや存在し、このバリアと、形質転換効率は、13に増加します。無傷の植物細胞14およびアグロバクテリウム媒介形質転換15遺伝子銃形質転換のために2つだけの十分に確立された方法があります。微粒子銃がtransfoのための特殊な装置を必要とするこれらの方法のいずれもが簡単に、液体ハンドリングプラットフォームに変換することができますアグロバクテリウムを介した形質転換一方rmationは、共培養し、細菌のその後の除去を必要とします。どちらも高スループット方法のために適していません。プロトプラストの場合には、変換は、日常的にのみ、いくつかの溶液交換を必要とし、理想的には、液体ハンドリングプラットフォームに適しているポリエチレングリコール（PEG）媒介性トランスフェクション16を用いて行われます。第二に、プロトプラストは、定義により、単一細胞培養物であり、従って、植物細胞培養物中で凝集し、鎖形成に関連する問題は、プロトプラストでは観察されません。プレートベースの分光光度計を用いて迅速なスクリーニングの観点から、複数の平面内の細胞、または細胞の凝集は、一貫した測定値を取得することの困難につながります。プロトプラストは、それらの培地よりも密であるので、それらは、プレートベースの分光光度法のために助長している単分子層を形成し、ウェルの底に沈降します。最後に、植物細胞懸濁培養物はprimarいる間ILYカルス17由来のプロトプラストは、組織特異的発現を同定する能力をもたらす、植物組織の数から採取することができます。例えば、遺伝子のルートで、または葉特異的発現を分析する能力は、表現型の予測にとって非常に重要であることができます。これらの理由から、本研究で開発されたプロトコルが広く使用されているタバコ（ タバコ L.）「明るい黄色&#39;2（BY-2）懸濁培養物から単離したプロトプラストを用いて検証しました。 BY-2浮遊培養は、植物細胞18の分子分析におけるその遍在使用のために、高等植物の「HeLa細胞」細胞として記載されています。最近、BY-2細胞は、植物の効果を研究するために使用されている、細胞内タンパク質局在23,24、および植物生物学において、これらの培養物の広範な有用性を示す基本的な細胞生物学25-27を 19-22をストレッサー。 BY-2培養物のさらなる利点は遺伝子発現研究28向けに拡張再現性につながる可能性がアフィディコリン、と文化を同期する機能。さらに、方法は、伝統的に、プロトプラストを生成するために使用される酵素は、コスト高スループットシステムのために禁止されているように、低コストの酵素29,30を用いた BY-2プロトプラストの抽出のために開発されてきました。そのようなものとして、以下に記載されるプロトコルは、BY-2浮遊培養を用いて検証されていますが、それは任意の植物細胞懸濁培養に修正可能でなければなりません。概念実証実験は、ハードサンゴハマからオレンジ色蛍光タンパク質（OFP）レポーター遺伝子（pporRFP）はCaMV35Sプロモーターの制御下で、31を ハマ使用して実行されます。

<table><tbody><tr><td>Orbitor RS Microplate mover</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bravo Liquid Handler</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Synergy H1 Multi-mode Reader</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MultiFlo FX Multi-mode Dispenser</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Teleshake</td><td>Inheco</td><td>3800048</td><td></td></tr><tr><td>CPAC Ultraflat Heater/cooler</td><td>Inheco</td><td>7000190</td><td></td></tr><tr><td>Vworks Automation Software</td><td>Agilent</td><td></td><td>Software used to control and write protocols for Agilent Bravo</td></tr><tr><td>Momentum Software</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Task scheduling software for controlling Orbiter RS</td></tr><tr><td>Liquid Handling Control 2.17 Software</td><td>Biotek</td><td></td><td>Software used to control and write protocols for MultiFlo FX</td></tr><tr><td>IX81 Inverted Microscope</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zyla 3-Tap microscope camera</td><td>Andor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ET-CY3/TRITC Filter Set</td><td>Chroma Technology Corp</td><td>49004</td><td></td></tr><tr><td>Rohament CL</td><td>AB Enzymes</td><td>sample bottle</td><td>low-cost cellulase</td></tr><tr><td>Rohapect UF</td><td>AB Enzymes</td><td>sample bottle</td><td>low-cost pectinase</td></tr><tr><td>Rohapect 10L</td><td>AB Enzymes</td><td>sample bottle</td><td>low-cost pectinase/arabinase</td></tr><tr><td>Linsmaier &amp;amp; Skoog Basal Medium</td><td>Phytotechnology Laboratories</td><td>L689</td><td></td></tr><tr><td>2,4-dichlorophenoxyacetic acid</td><td>Phytotechnology Laboratories</td><td>D295</td><td></td></tr><tr><td>propidium iodide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4170</td><td></td></tr><tr><td>Poly(ethylene glycol) 4000</td><td>Sigma Aldrich</td><td>95904-250G-F</td><td>Formerly Fluka PEG</td></tr><tr><td>Propidium Iodide</td><td>Fisher Scientific</td><td>25535-16-4</td><td>Acros Organics</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7902-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Acetate</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP333-500</td><td></td></tr><tr><td>Mannitol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1902-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Fisher Scientific</td><td>S5-3</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC424205000</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1767</td><td></td></tr><tr><td>Gelzan CM</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1910-250G</td><td></td></tr><tr><td>6-well plate</td><td>Thermo Scientific</td><td>103184</td><td></td></tr><tr><td>96-well 1.2 ml deep well plate</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-0564</td><td></td></tr><tr><td>96 well optical bottom plate</td><td>Thermo Scientific</td><td>165305</td><td></td></tr><tr><td>Finntip 1000 Wide bore Pipet tips</td><td>Thermo Scientific</td><td>9405 163</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-10</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4504-1KG</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC17259-5000</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>M33-500</td><td></td></tr></tbody></table>

a robotic platform for high-throughput protoplast isolation and transformation

過去10年間のシグナル伝達経路、転写制御ネットワーク、遺伝子発現、ゲノム編集、および遺伝子サイレンシングの分析のため、モデル種からの作物種に及ぶ植物プロトプラストの使用に復活がありました。さらに、重要な進展は、植物ゲノミクスのためのこれらのシステムの使用であってもより多くの関心を生成したプロトプラストからの植物の再生、で行われています。この作業では、プロトコルは、ロボットプラットフォームを使用して「明るい黄色 &#39;2（BY-2）タバコ懸濁培養からのプロトプラストの分離および形質転換の自動化のために開発されてきました。形質転換手順は、カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーター（35S）の制御下で、オレンジ色蛍光タンパク質（OFP）レポーター遺伝子（pporRFP）を用いて検証しました。プロトプラストにおけるOFPの発現は、エピ蛍光顕微鏡によって確認されました。分析はまたpropidiuを用いてプロトプラスト生産効率の方法を含めメートルヨウ化。最後に、低コストの食品グレードの酵素は、ハイスループット自動プロトプラスト単離および分析にコスト高である実験室グレードの酵素の必要性を回避する、プロトプラスト単離手順のために使用しました。今回開発したプロトコルに基づいて、変換へのプロトプラスト単離からの完全な手順は、オペレータからの入力なしに、4時間の下で行うことができます。今回開発したプロトコルは、BY-2細胞培養で検証されたが、手順および方法は、作物ゲノム研究の加速を有効にする必要があります任意の植物懸濁培養/プロトプラストシステムに翻訳可能でなければなりません。

現在の研究では、BY-2の倍加速度は、培養物は、15時間の平均細胞周期の長さの以前の報告と一致して培養したときの温度に依存して14から18時間から変化しました。この倍加速度で、1：100の出発接種材料は5-7日で50％のパック細胞容積（PCV）での文化につながる、培養を開始するために使用されました。培養物を培地200mlに成長された現在のプロトコルでは、100mlとPCV 3...

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A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation

ハイスループット、自動化され、タバコプロトプラストの生産と変換方法について説明します。ロボットシステムは、非モデル作物に翻訳可能であるべきであるBY-2システムモデルにおける大規模並列遺伝子発現と発見を可能にします。

ハイスループットプロトプラスト単離と変革のためのロボットプラットフォーム

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Genetics

14.2K ビュー.  University of Tennessee, Knoxville. ハイスループット、自動化され、タバコプロトプラストの生産と変換方法について説明します。ロボットシステムは、非モデル作物に翻訳可能であるべきであるBY-2システムモデルにおける大規模並列遺伝子発現と発見を可能にします。 

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High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

Systematic identification and characterization of genetic perturbations have proven useful to decipher gene function and cellular pathways. However, the conventional approaches of permanent gene deletion cannot be applied to essential genes. We have pioneered a unique collection of ~70 temperature-sensitive (ts) lethal mutants for studying cell cycle regulation in the unicellular green algae Chlamydomonas reinhardtii1. These mutations identify essential genes, and the ts alleles can be conditionally inactivated by temperature shift, providing valuable tools to identify and analyze essential functions. Mutant collections are much more valuable if they are close to comprehensive, since scattershot collections can miss important components. However, this requires the efficient collection of a large number of mutants, especially in a wide-target screen. Here, we describe a robotics-based pipeline for generating ts lethal mutants and analyzing their phenotype in Chlamydomonas. This technique can be applied to any microorganism that grows on agar. We have collected over 3000 ts mutants, probably including mutations in most or all cell-essential pathways, including about 200 new candidate cell cycle mutations. Subsequent molecular and cellular characterization of these mutants should provide new insights in plant cell biology; a comprehensive mutant collection is an essential prerequisite to ensure coverage of a broad range of biological pathways. These methods are integrated with downstream genetics and bioinformatics procedures for efficient mapping and identification of the causative mutations that are beyond the scope of this manuscript.

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

Temperature-sensitive (ts) lethal mutants are valuable tools to identify and analyze essential functions. Here we describe methods to generate and classify ts lethal mutants in high throughput.

ハイスループットは、ロボットに温度に敏感な致死変異体の単離を支援します<em&gt;クラミドモナス</em

Systematic identification and characterization of genetic perturbations have proven useful to decipher gene function and cellular pathways. However, the ...

遺伝学

A High-throughput Automated Platform for the Development of Manufacturing Cell Lines for Protein Therapeutics

The fast-growing biopharmaceutical industry demands speedy development of highly efficient and reliable production systems to meet the increasing requirement for drug supplies. The generation of production cell lines has traditionally involved manual operations that are labor-intensive, low-throughput and vulnerable to human errors. We report here an integrated high-throughput and automated platform for development of manufacturing cell lines for the production of protein therapeutics.
The combination of BD FACS Aria Cell Sorter, CloneSelect Imager and TECAN Freedom EVO liquid handling system has enabled a high-throughput and more efficient cell line development process. In this operation, production host cells are first transfected with an expression vector carrying the gene of interest 1, followed by the treatment with a selection agent. The stably-transfected cells are then stained with fluorescence-labeled anti-human IgG antibody, and are subsequently subject to flow cytometry analysis 2-4. Highly productive cells are selected based on fluorescence intensity and are isolated by single-cell sorting on a BD FACSAria. Colony formation from single-cell stage was detected microscopically and a series of time-laps digital images are taken by CloneSelect Imager for the documentation of cell line history. After single clones have formed, these clones were screened for productivity by ELISA performed on a TECAN Freedom EVO liquid handling system. Approximately 2,000 - 10,000 clones can be screened per operation cycle with the current system setup.
This integrated approach has been used to generate high producing Chinese hamster ovary (CHO) cell lines for the production of therapeutic monoclonal antibody (mAb) as well as their fusion proteins. With the aid of different types of detecting probes, the method can be used for developing other protein therapeutics or be applied to other production host systems. Comparing to the traditional manual procedure, this automated platform demonstrated advantages of significantly increased capacity, ensured clonality, traceability in cell line history with electronic documentation and much reduced opportunity in operator error.

A high-throughput, automated platform of manufacturing cell line development for producing protein therapeutics is described. Implementation of BD FACS Aria Cell Sorter, CloneSelect Imager and TECAN Freedom EVO liquid handling system has demonstrated significantly increased processing capacity in cell line development with improved cell line quality and high reproducibility.

タンパク質治療薬の製造細胞株の開発のためのハイスループット自動化されたプラットフォーム

The fast-growing biopharmaceutical industry demands speedy development of highly efficient and reliable production systems to meet the increasing ...

医学

Studying Protein Import into Chloroplasts Using Protoplasts

The chloroplast is an essential organelle that is responsible for various cellular processes in plants, such as photosynthesis and the production of many secondary metabolites and lipids. Chloroplasts require a large number of proteins for these various physiological processes. Over 95% of chloroplast proteins are nucleus-encoded and imported into chloroplasts from the cytosol after translation on cytosolic ribosomes. Thus, the proper import or targeting of these nucleus-encoded chloroplast proteins to chloroplasts is essential for the proper functioning of chloroplasts as well as the plant cell. Nucleus-encoded chloroplast proteins contain signal sequences for specific targeting to chloroplasts. Molecular machinery localized to the chloroplast or cytosol recognize these signals and carry out the import process. To investigate the mechanisms of protein import or targeting to chloroplasts in vivo, we developed a rapid, efficient protoplast-based method to analyze protein import into chloroplasts of Arabidopsis. In this method, we use protoplasts isolated from leaf tissues of Arabidopsis. Here, we provide a detailed protocol for using protoplasts to investigate the mechanism by which proteins are imported into chloroplasts.

Here we describe a protocol to express proteins into protoplasts by using PEG-mediated transformation method. The method provides easy expression of proteins of interest, and efficient investigation of protein localization and the import process for various experimental conditions in vivo.

プロトプ ラストを用いた葉緑体への蛋白質輸送を勉強

The chloroplast is an essential organelle that is responsible for various cellular processes in plants, such as photosynthesis and the production of many ...

生化学

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental stimuli in any multicellular organism. In situ hybridization and reporter gene visualization can to a limited extent be used to this end but for high resolution quantitative RT-PCR or high-throughput transcriptome-wide analysis the isolation of RNA from particular cell types is requisite. Cellular dissociation of tissue expressing a fluorescent protein marker in a specific cell type and subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) makes it possible to collect sufficient amounts of material for RNA extraction, cDNA synthesis/amplification and microarray analysis.
An extensive set of cell type-specific fluorescent reporter lines is available to the plant research community. In this case, two marker lines of the Arabidopsis thaliana root are used: PSCR::GFP (endodermis and quiescent center) and PWOX5::GFP (quiescent center). Large numbers (thousands) of seedlings are grown hydroponically or on agar plates and harvested to obtain enough root material for further analysis. Cellular dissociation of plant material is achieved by enzymatic digestion of the cell wall. This procedure makes use of high osmolarity-induced plasmolysis and commercially available cellulases, pectinases and hemicellulases to release protoplasts into solution.
FACS of GFP-positive cells makes use of the visualization of the green versus the red emission spectra of protoplasts excited by a 488 nm laser. GFP-positive protoplasts can be distinguished by their increased ratio of green to red emission. Protoplasts are typically sorted directly into RNA extraction buffer and stored for further processing at a later time.
This technique is revealed to be straightforward and practicable. Furthermore, it is shown that it can be used without difficulty to isolate sufficient numbers of cells for transcriptome analysis, even for very scarce cell types (e.g. quiescent center cells). Lastly, a growth setup for Arabidopsis seedlings is demonstrated that enables uncomplicated treatment of the plants prior to cell sorting (e.g. for the cell type-specific analysis of biotic or abiotic stress responses). Potential supplementary uses for FACS of plant protoplasts are discussed.

A method for isolating specific cell types from plant material is demonstrated. This technique employs transgenic marker lines expressing fluorescent proteins in particular cell types, cellular dissociation and Fluorescence Activated Cell Sorting. Additionally, a growth setup is established here that facilitates treatment of Arabidopsis thaliana seedlings prior to cell sorting.

植物プロトプラストの蛍光活性化細胞選別

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

生物学

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.

Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.

ハイスループットシングルセルの単離および培養のためのマイクロ流体プラットフォーム

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

生物工学

Automated Robotic Liquid Handling Assembly of Modular DNA Devices

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; represented by &#34;devices&#34; created as combinations of individual genetic components. However, manual assembly of such large numbers of devices is time-intensive, error-prone, and costly. The increasing sophistication and scale of synthetic biology research necessitates an efficient, reproducible way to accommodate large-scale, complex, and high throughput device construction.
Here, a DNA assembly protocol using the Type-IIS restriction endonuclease based Modular Cloning (MoClo) technique is automated on two liquid-handling robotic platforms. Automated liquid-handling robots require careful, often times tedious optimization of pipetting parameters for liquids of different viscosities (e.g. enzymes, DNA, water, buffers), as well as explicit programming to ensure correct aspiration and dispensing of DNA parts and reagents. This makes manual script writing for complex assemblies just as problematic as manual DNA assembly, and necessitates a software tool that can automate script generation. To this end, we have developed a web-based software tool, http://mocloassembly.com, for generating combinatorial DNA device libraries from basic DNA parts uploaded as Genbank files. We provide access to the tool, and an export file from our liquid handler software which includes optimized liquid classes, labware parameters, and deck layout. All DNA parts used are available through Addgene, and their digital maps can be accessed via the Boston University BDC ICE Registry. Together, these elements provide a foundation for other organizations to automate modular cloning experiments and similar protocols.
The automated DNA assembly workflow presented here enables the repeatable, automated, high-throughput production of DNA devices, and reduces the risk of human error arising from repetitive manual pipetting. Sequencing data show the automated DNA assembly reactions generated from this workflow are ~95% correct and require as little as 4% as much hands-on time, compared to manual reaction preparation.

Here, an automated workflow to perform modular DNA &#34;device&#34; assembly using a modular cloning DNA assembly method on liquid-handling robots is presented. The protocol uses an intuitive software tool for generating liquid handler picklists for combinatorial DNA device library generation, which we demonstrate using two liquid handling platforms.

モジュラー DNA デバイスの液体ハンドリング アセンブリを自動化

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; ...

Efficient Polyethylene Glycol (PEG) Mediated Transformation of the Moss Physcomitrella patens

A simple and efficient method to transform Physcomitrella pantens protoplasts is described. This method is adapted from protocols for Physocmitrella protonemal protoplast and Arabidopsis mesophyll protoplast transformation1. Due to its capacity to undergo efficient mitotic homologous recombination, Physcomitrella patens has emerged as an important model system in recent years2. This capacity allows high frequencies of gene targeting3-9, which is not seen in other model plants such as Arabidopsis. To take full advantage of this system, we need an effective and easy method to deliver DNA into moss cells. The most common ways to transform this moss are particle bombardment10 and PEG-mediated DNA uptake11. Although particle bombardment can produce a high transformation efficiency12, gene guns are not readily available to many laboratories and the protocol is difficult to standardize. On the other hand, PEG mediated transformation does not require specialized equipments, and can be performed in any laboratory with a sterile hood. Here, we show a simple and highly efficient method for transformation of moss protoplasts. This method can generate more than 120 transient transformants per microgram of DNA, which is an improvement from the most efficient protocol previously reported13. Because of its simplicity, efficiency, and reproducibility, this method can be applied to projects requiring large number of transformants as well as for routine transformation.

Efficient Polyethylene Glycol PEG Mediated Transformation of the Moss Physcomitrella patens

A simple and efficient method to transform Physcomitrella pantens protoplasts is described. This method is adapted from protocols for Physocmitrella protonemal protoplast and Arabidopsis mesophyll protoplast transformation1.

効率的なポリエチレングリコール（PEG）モスの媒介形質転換ヒメツリガネゴケ</em

A simple and efficient method to transform Physcomitrella pantens protoplasts is described. This method is adapted from protocols for Physocmitrella ...

High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, including those with direct relevance to human disease. Because of its short generation time and well-characterized genome, a major experimental advantage of the yeast model system is the ability to perform genetic screens to identify genes and pathways that are involved in a given process. Over the last thirty years such genetic screens have been used to elucidate the cell cycle, secretory pathway, and many more highly conserved aspects of eukaryotic cell biology 1-5. In the last few years, several genomewide libraries of yeast strains and plasmids have been generated 6-10. These collections now allow for the systematic interrogation of gene function using gain- and loss-of-function approaches 11-16. Here we provide a detailed protocol for the use of a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot to perform a plasmid overexpression screen, using an arrayed library of 5,500 yeast plasmids. We have been using these screens to identify genetic modifiers of toxicity associated with the accumulation of aggregation-prone human neurodegenerative disease proteins. The methods presented here are readily adaptable to the study of other cellular phenotypes of interest.

Here we describe a plasmid overexpression screen in Saccharomyces cerevisiae, using an arrayed plasmid library and a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot.

ハイスループット酵母プラスミドの過剰発現の画面

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, ...

A Simple Method for Isolation of Soybean Protoplasts and Application to Transient Gene Expression Analyses

Soybean (Glycine max (L.) Merr.) is an important crop species and has become a legume model for the studies of genetic and biochemical pathways. Therefore, it is important to establish an efficient transient gene expression system in soybean. Here, we report a simple protocol for the preparation of soybean protoplasts and its application for transient functional analyses. We found that young unifoliate leaves from soybean seedlings resulted in large quantities of high quality protoplasts. By optimizing a PEG-calcium-mediated transformation method, we achieved high transformation efficiency using soybean unifoliate protoplasts. This system provides an efficient and versatile model for examination of complex regulatory and signaling mechanisms in live soybean cells and may help to better understand diverse cellular, developmental and physiological processes of legumes.

We developed a simple and efficient protocol for the preparation of large quantities of soybean protoplasts to study complex regulatory and signaling mechanisms in live cells.

簡便な分離大豆プロトプ ラストと一過的遺伝子発現解析への応用

Soybean (Glycine max (L.) Merr.) is an important crop species and has become a legume model for the studies of genetic and biochemical pathways. ...

Scalable Transfection of Maize Mesophyll Protoplasts

The transfection of maize mesophyll cells often involves digesting the plant cell walls to create protoplasts and then inserting DNA via electroporation or polyethylene glycol (PEG). Previous methods were developed to produce tens of thousands of transfected protoplasts at once. Here,&#160;we describe a straightforward method to isolate and transfect millions of leaf mesophyll protoplasts in maize (Zea mays L.). This streamlined process removes certain common protoplasting steps, such as washing in W5. Additionally, steps such as centrifugation, PEG-mediated transfection, and incubation have been modified to work with a greater number of protoplasts. The ability to express large libraries of plasmid constructs enables genome-scale experiments, such as massively parallel reporter assays in maize.

Here, we present a high-throughput protocol to transiently transfect millions of maize protoplasts for testing large libraries of plasmids in maize mesophyll cells.

トウモロコシ葉肉プロトプラストのスケーラブルトランスフェクション

The transfection of maize mesophyll cells often involves digesting the plant cell walls to create protoplasts and then inserting DNA via electroporation ...

ハイスループットプロトプラスト単離と変革のためのロボットプラットフォーム

要約

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ハイスループットは、ロボットに温度に敏感な致死変異体の単離を支援します

タンパク質治療薬の製造細胞株の開発のためのハイスループット自動化されたプラットフォーム

プロトプラストを用いた葉緑体への蛋白質輸送を勉強

植物プロトプラストの蛍光活性化細胞選別

ハイスループットシングルセルの単離および培養のためのマイクロ流体プラットフォーム

モジュラー DNA デバイスの液体ハンドリングアセンブリを自動化

効率的なポリエチレングリコール（PEG）モスの媒介形質転換ヒメツリガネゴケ

ハイスループット酵母プラスミドの過剰発現の画面

簡便な分離大豆プロトプラストと一過的遺伝子発現解析への応用

トウモロコシ葉肉プロトプラストのスケーラブルトランスフェクション

ハイスループットプロトプラスト単離と変革のためのロボットプラットフォーム

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ハイスループットは、ロボットに温度に敏感な致死変異体の単離を支援します

タンパク質治療薬の製造細胞株の開発のためのハイスループット自動化されたプラットフォーム

プロトプ ラストを用いた葉緑体への蛋白質輸送を勉強

植物プロトプラストの蛍光活性化細胞選別

ハイスループットシングルセルの単離および培養のためのマイクロ流体プラットフォーム

モジュラー DNA デバイスの液体ハンドリング アセンブリを自動化

効率的なポリエチレングリコール（PEG）モスの媒介形質転換ヒメツリガネゴケ

ハイスループット酵母プラスミドの過剰発現の画面

簡便な分離大豆プロトプ ラストと一過的遺伝子発現解析への応用

トウモロコシ葉肉プロトプラストのスケーラブルトランスフェクション

プロトプラストを用いた葉緑体への蛋白質輸送を勉強

モジュラー DNA デバイスの液体ハンドリングアセンブリを自動化

簡便な分離大豆プロトプラストと一過的遺伝子発現解析への応用