El objetivo general de estas técnicas es evaluar la fisiopatología retiniana en el modelo de rata con retinopatía diabética inducida por estreptozotocina. La retinopatía diabética es una de las principales causas de ceguera. La búsqueda continua continúa para descubrir agentes farmacológicos con mejor eficacia y mayor acción para tratar la retinopatía diabética.
El proceso de descubrimiento de agentes farmacológicos en modelos animales preclínicos juega un papel vital. Estos modelos animales ayudan a comprender las alteraciones estructurales y funcionales de los tejidos del segmento posterior del ojo. Por lo tanto, demostraremos tres técnicas diferentes para estudiar estas alteraciones en los problemas del segmento posterior.
Estamos demostrando histología para estudiar los cambios morfológicos de las células de la retina en capas, ensayo de descomposición de BRB para estudiar BRB comprometido mediante la cuantificación de proteínas filtradas en el vítreo del plasma, y también angiografía fluorescencia para visualizar la vasculatura retiniana utilizando tinte FITC-dextrano. Sacrificar rata usando altas dosis de pentobarbital y confirmar su muerte sin latidos cardíacos detectables. Enucle el ojo haciendo incisiones usando una cuchilla de bisturí en las regiones nasal y temporal del ojo.
Luego corte a lo largo de sus bordes para quitar el ojo de la cavidad orbitaria. Retire el exceso de grasa que rodea el ojo y colóquelo en 5 ml de solución fijadora. Incubar el ojo en solución fijadora durante 24 a 48 horas.
Después de la fijación, retire el ojo de la solución fijadora y transfiéralo a una placa de Petri llena de 10 ml de PBS. Usando micro pinzas, sostenga el ojo con el nervio óptico y haga un corte en pars plana con la ayuda de micro tijeras. Corte a través de todo el margen de la córnea para separar la copa anterior y la copa posterior del ojo.
Retire la lente y corte el nervio óptico. Corte la copa posterior en dos mitades, pasando a través del nervio óptico. Transfiera cada mitad a los casetes separados.
Deshidratar el tejido aumentando gradualmente la concentración de etanol del 50% al 100% de etanol. Y finalmente, limpie el etanol con xileno. Impregnar el tejido con parafina precalentada a 60 grados centígrados para reemplazar el xileno en el tejido.
Prepare los bloques de parafina usando un molde de acero para sostener el tejido y el cassette como base. Al preparar el bloque, la parte del disco óptico del ojo debe estar orientada hacia la parte inferior del molde de acero. Llene el cassette con parafina y transfiéralo a una superficie fría.
Monte la cuchilla y el cassette en los respectivos soportes en el microtomo. Usando un microtomo, recorte el exceso de cera de parafina y corte una cinta de cinco a seis secciones con un grosor de 5 micrómetros. Transfiera la cinta a la superficie del baño de agua precalentada para desplegar la cinta.
Recoge las secciones en un portaobjetos de vidrio recubierto con albúmina. Deje que los toboganes se sequen durante la noche a 37 grados centígrados. Para realizar la tinción de hematoxilina y eosina, precaliente los portaobjetos a 60 grados centígrados durante 1 hora para derretir la parafina.
Siga el procedimiento de tinción como se indica en el manuscrito. Comience con la rehidratación del tejido y luego se tiñe con hematoxilina seguida de eosina. Ahora, deshidrate el tejido y agregue medio de montaje en las secciones.
Coloque el resbalón de la cubierta en las secciones y visualice bajo el microscopio de luz. Para realizar el ensayo de ruptura de la barrera sangre-retina, anestesiar a la rata con ketamina y xilazina y confirmar el estado anestésico mediante pellizco en el dedo del pie. Localice el corazón e inserte una jeringa de 1 ml con aguja calibre 24 para extraer la sangre por punción cardíaca.
Una vez que se haya recolectado la sangre suficiente, transfiérala a un tubo recubierto de EDTA. Mézclelo suavemente para prevenir la hemólisis. Enucle el ojo e inmediatamente transfiéralo al hielo seco.
En condiciones de congelación, comience la disección del ojo mediante la extirpación de la córnea y el cristalino. Extraiga el vítreo del segmento posterior del ojo usando fórceps sin ninguna contaminación de la retina. Transfiéralo a un tubo homogeneizador con tres o cuatro cuentas.
Homogeneizar las muestras utilizando homogeneizador de perlas a velocidad media durante 10 segundos. Transfiera muestras de sangre y humor vítreo a tubos de microcentrífuga para procesar aún más. Centrifuga ambas muestras a 5, 200 g durante 10 minutos a 4 grados centígrados.
Usando una pipeta multicanal, agregue 250 microlitros de reactivo Bradford en los pozos. Diluya las muestras vítreas 10 veces y las muestras de plasma 20 veces usando PBS. Agregue 5 microlitros de muestras diluidas al reactivo Bradford y mezcle bien.
Incubar las muestras durante 20 a 30 minutos, y luego medir la absorbancia a 590 nanómetros utilizando un lector de placas de 96 pocillos. La intensidad de la muestra es directamente proporcional a la concentración de proteína. Para realizar la angiografía por fluorescencia, anestesiar a la rata con 3% de isoflurano y confirmar el estado anestésico mediante punción en el dedo del pie.
Sumerja la cola en agua tibia antes de inyectar el tinte. Inyecte 1 ml de 50 mg por ml de solución de FITC-dextrano en la vena lateral de la cola. Deje que el tinte circule durante 5 a 10 minutos.
Sacrificar a la rata usando pentobarbital y confirmar su muerte por latidos cardíacos no detectables. Enucle el ojo y proceda a la preparación de montaje plano. Para preparar la montura plana de la retina, coloque el ojo sobre un Kimwipe sin fibra y corte la parte anterior del ojo.
Tire lentamente de la lente, junto con el humor vítreo, del segmento posterior del ojo. Transfiera el segmento posterior a una placa de Petri llena de PBS y corte el nervio óptico. Ahora, coloque la punta del forceps puntiagudo entre la esclerótica y la retina.
Muévalo suavemente a lo largo del borde de la copa para asegurarse de que la retina no esté unida a la esclerótica en ningún momento. Corte cerca del disco óptico, de modo que la retina se desprenda completamente de la esclerótica. Una vez que se confirme que la retina no está unida a la esclerótica en ningún lado, empuje lentamente hacia la solución de PBS.
Con la ayuda de un forcep, transfiera la retina a un portaobjetos de vidrio limpio sin causarle ningún daño. Usando micro tijera o hoja de bisturí, haga cuatro cortes en la retina, como se muestra, para dividirla en cuatro cuadrantes. Elimine el exceso de PBS del entorno retiniano y agregue un medio de montaje antidesvanecimiento en el soporte plano retinal.
Cúbralo con un coverslip y visualice el montaje plano bajo microscopio confocal. Es importante tener en cuenta aquí que todo el proceso de angiografía por fluorescencia se realiza bajo una luz mínima para evitar el enfriamiento de la fluorescencia del tinte FITC-dextrano. En la rata diabética, las células de la retina sufren degeneración, lo que conduce a complicaciones adicionales.
Estas alteraciones estructurales pueden visualizarse mediante técnica histología para determinar el número celular y el grosor de la retina. En el caso de las ratas diabéticas, el grosor de las capas de la retina aumenta debido al edema. Por lo tanto, esta técnica ayuda a detectar varios agentes farmacológicos potenciales para tratar la retinopatía diabética.
Los cambios metabólicos en la retina debido a la diabetes causan pérdida de pericitos y ruptura de la barrera sangre-retina. A medida que hay fuga de proteínas y otras biomoléculas en la retina y el vítreo, los niveles de proteína total aumentan en el vítreo de las ratas diabéticas. La prevención de la ruptura de la barrera sangre-retina podría obstaculizar significativamente el progreso de la retinopatía diabética.
En la retinopatía diabética, la expresión del factor de crecimiento endotelial vascular aumenta que conduce a la formación de nuevos vasos. Estos vasos alteran la estructura normal de la retina y, por lo tanto, su inervación es de interés primordial para tratar la retinopatía diabética. La técnica de angiografía por fluorescencia se utiliza para visualizar nuevos vasos sanguíneos y también fugas de vasos sanguíneos, como se destaca aquí.
Sin embargo, la angiogénesis es prominente solo después de seis a 12 meses de inducción de la diabetes. Esta técnica nos ayuda a cuantificar el efecto del tratamiento farmacológico sobre la inervación de la angiogénesis y la fuga vascular. El tratamiento futuro de la retinopatía diabética necesita agentes farmacológicos más eficientes, pero los tratamientos futuros solo se pueden lograr a través de una mejor comprensión de la patogénesis de la enfermedad.
Dominar estas técnicas podría ayudar a los investigadores a tener una mejor comprensión sobre la patogénesis de la retinopatía diabética, lo que podría conducir a un descubrimiento de mejores intervenciones farmacológicas.
