Bu tekniklerin genel amacı, streptozotosin kaynaklı diyabetik retinopati sıçan modelinde retinal patofizyolojiyi değerlendirmektir. Diyabetik retinopati körlüğün önde gelen nedenlerinden biridir. Diyabetik retinopatiyi tedavi etmek için daha iyi etkinliğe ve daha uzun etkiye sahip farmakolojik ajanları keşfetmek için sürekli araştırmalar devam etmektedir.
Klinik öncesi hayvan modellerinde farmakolojik ajanların keşfedilme süreci hayati bir rol oynamaktadır. Bu hayvan modelleri, gözün arka segment dokularının yapısal ve fonksiyonel değişikliklerini anlamaya yardımcı olur. Bu nedenle, arka segment sorunlarındaki bu değişiklikleri incelemek için üç farklı teknik göstereceğiz.
Katmanlardaki retina hücrelerinin morfolojik değişikliklerini incelemek için histolojiyi, plazmadan vitreustaki sızan proteini nicelleştirerek tehlikeye atılmış BRB'yi incelemek için BRB parçalanma testini ve ayrıca FITC-dextran boyasını kullanarak retinal vaskülatürü görselleştirmek için floresan anjiyografi gösteriyoruz. Yüksek dozda pentobarbital kullanarak sıçanı ötenazi haline getirin ve tespit edilebilir kalp atışı olmadan ölümünü onaylayın. Gözün burun ve temporal bölgelerinde neşter bıçağı kullanarak kesi yaparak gözü enüklee edin.
Daha sonra gözü orbital soketten çıkarmak için kenarları boyunca kesin. Gözü çevreleyen fazla yağı çıkarın ve 5 mL fiksatif çözeltiye yerleştirin. Gözü fiksatif çözeltide 24 ila 48 saat boyunca inkübe edin.
Fiksasyondan sonra, gözü fiksatif çözeltiden çıkarın ve 10 mL PBS ile doldurulmuş Petri kabına aktarın. Mikro forseps kullanarak, gözü optik sinir ile tutun ve mikro makas yardımıyla pars plana'da bir nick yapın. Ön fincanı ve arka göz kabını ayırmak için korneanın tüm kenarını kesin.
Lensi çıkarın ve optik siniri kesin. Arka bardağı optik sinirden geçerek iki yarıya bölün. Her yarısını ayrı kasetlere aktarın.
Etanol konsantrasyonunu% 50'den% 100 etanol'e kademeli olarak artırarak dokuyu kurutun. Ve son olarak, etanolün ksilen ile temizlenmesi. Dokudaki ksilenin yerini almak için dokuyu önceden ısıtılmış parafin ile 60 santigrat derecede emprenye edin.
Parafin bloklarını, doku ve kaseti taban olarak tutmak için çelik bir kalıp kullanarak hazırlayın. Bloğu hazırlarken gözün optik disk kısmı çelik kalıbın dibine bakmalıdır. Kaseti parafin ile doldurun ve serin bir yüzeye aktarın.
Bıçağı ve kaseti mikrotom üzerindeki ilgili tutuculara monte edin. Bir mikrotom kullanarak, fazla parafin mumunu kesin ve 5 mikrometre kalınlığında beş ila altı bölümden oluşan bir kurdele kesin. Şeridi açmak için şeridi önceden ısıtılmış su banyosunun yüzeyine aktarın.
Bölümleri albümin ile kaplanmış cam bir slayt üzerinde toplayın. Slaytların gece boyunca 37 santigrat derecede kurumasını bekleyin. Hematoksilin ve Eozin boyama işlemini gerçekleştirmek için, parafini eritmek için slaytları 1 saat boyunca 60 santigrat derecede önceden ısıtın.
Makalede verilen boyama prosedürünü takip edin. Dokunun rehidrasyonu ile başlayın ve daha sonra Hematoksilin ve ardından Eosin ile lekeleyin. Şimdi, dokuyu kurutun ve bölümlere montaj ortamı ekleyin.
Kapak kaymasını kesitlere yerleştirin ve ışık mikroskobu altında görselleştirin. Kan-retinal bariyer parçalanma testi yapmak için, ketamin ve ksilazin kullanarak sıçanı uyuşturun ve ayak parmağı sıkışmasıyla anestezik durumu onaylayın. Kalbi bulun ve kardiyak delinme yoluyla kanı çekmek için 24 gauge iğneli 1 mL şırınga yerleştirin.
Yeterli kan toplandıktan sonra, EDTA kaplı tüpe aktarın. Hemolizi önlemek için hafifçe karıştırın. Gözü enüklee edin ve hemen kuru buza aktarın.
Donmuş koşullar altında, kornea ve lensin çıkarılmasıyla gözün diseksiyonuna başlayın. Vitreusu gözün arka segmentinden forseps kullanarak retinadan herhangi bir kontaminasyon olmadan çekin. Üç ila dört boncuklu homojenizasyon tüpüne aktarın.
Boncuk homojenizatörü kullanarak numuneleri 10 saniye boyunca orta hızda homojenize edin. Daha fazla işlemek için kan ve vitreus mizah örneklerini mikrosantrifüj tüplerine aktarın. Her iki numuneyi de 4 santigrat derecede 10 dakika boyunca 5.200 g'da santrifüj yapın.
Çok kanallı pipet kullanarak, kuyucuklara 250 mikrolitre Bradford reaktifi ekleyin. PBS kullanarak vitreus örneklerini 10 kez, plazma örneklerini 20 kez seyreltin. Bradford reaktifine 5 mikrolitre seyreltilmiş numune ekleyin ve iyice karıştırın.
Numuneleri 20 ila 30 dakika boyunca inkübe edin ve ardından 96 delikli bir plaka okuyucu kullanarak 590 nanometrede absorbansı ölçün. Numunenin yoğunluğu, protein konsantrasyonu ile doğru orantılıdır. Floresan anjiyografi yapmak için,% 3 izofluran kullanarak sıçanı anestezi altına alın ve anestezik durumu ayak parmağı punch ile onaylayın.
Boyayı enjekte etmeden önce kuyruğu ılık suya batırın. Yanal kuyruk damarına mL FITC-dextran çözeltisi başına 1 mL 50 mg enjekte edin. Boyanın 5 ila 10 dakika dolaşmasına izin verin.
Pentobarbital kullanarak sıçanı ötenazi yapın ve ölümünü tespit edilebilir bir kalp atışı olmadan doğrulayın. Gözü enüklee edin ve düz montaj hazırlığına devam edin. Retinal düz montaj hazırlamak için, gözü lifsiz bir Kimwipe üzerine yerleştirin ve gözün ön kısmını kesin.
Objektifi, vitreus mizahı ile birlikte, gözün arka segmentinden yavaşça çekin. Arka segmenti PBS ile doldurulmuş Petri kabına aktarın ve optik siniri kesin. Şimdi, sivri forsepsin ucunu sklera ve retina arasına yerleştirin.
Retinanın herhangi bir noktada skleraya bağlı olmadığından emin olmak için bardağın kenarı boyunca yavaşça hareket ettirin. Optik diskin yakınında kesin, böylece retina skleradan tamamen ayrılır. Retinanın skleraya herhangi bir taraftan bağlı olmadığı doğrulandıktan sonra, yavaşça PBS çözeltisine itin.
Bir forseps yardımıyla, retinayı herhangi bir hasara neden olmadan temiz bir cam slaytın üzerine aktarın. Mikro makas veya neşter bıçağı kullanarak, gösterildiği gibi retinayı dört kadrana bölmek için dört kesim yapın. Retinal ortamdaki fazla PBS'yi çıkarın ve retinal düz montaja solmaya karşı koruma montaj ortamı ekleyin.
Bir kapak kapağı ile örtün ve düz montajı konfokal mikroskop altında görselleştirin. Burada, floresan anjiyografi işleminin tamamının, FITC-dextran boyasından floresanın söndürülmesini önlemek için minimum ışık altında gerçekleştirildiğine dikkat etmek önemlidir. Diyabetik sıçanlarda, retina hücreleri dejenerasyona uğrar ve bu da daha fazla komplikasyona yol açar.
Bu yapısal değişiklikler histoloji tekniği ile görselleştirilerek retinanın hücre sayısı ve kalınlığı belirlenebilir. Diyabetik sıçanlarda, ödem nedeniyle retina tabakalarının kalınlığı artar. Bu nedenle, bu teknik diyabetik retinopatiyi tedavi etmek için çeşitli potansiyel farmakolojik ajanların taranmasına yardımcı olur.
Diyabete bağlı retinadaki metabolik değişiklikler perisit kaybına ve kan-retina bariyerinin bozulmasına neden olur. Protein ve diğer biyomoleküllerin retina ve vitreusa sızması nedeniyle, diyabetik sıçanların vitreusunda toplam protein seviyeleri artar. Kan-retina bariyerinin parçalanmasını önlemek, diyabetik retinopatinin ilerlemesini önemli ölçüde engelleyebilir.
Diyabetik retinopatide, vasküler endotelyal büyüme faktörünün ekspresyonu artar ve bu da yeni damarların oluşumuna yol açar. Bu damarlar normal retina yapısını bozar ve bu nedenle innervasyonu diyabetik retinopatiyi tedavi etmek için birincil öneme sahiptir. Floresan anjiyografi tekniği, burada vurgulandığı gibi, yeni kan damarlarını ve ayrıca kan damarlarının sızıntısını görselleştirmek için kullanılır.
Bununla birlikte, anjiyogenez sadece altı ila 12 aylık diyabet indüksiyonundan sonra belirgindir. Bu teknik, ilaç tedavisinin anjiyogenez ve vasküler sızıntının innervasyonu üzerindeki etkisini ölçmemize yardımcı olur. Diyabetik retinopatinin gelecekteki tedavisi daha etkili farmakolojik ajanlara ihtiyaç duymaktadır, ancak gelecekteki tedaviler ancak hastalığın patogenezinin daha iyi anlaşılmasıyla sağlanabilir.
Bu tekniklerde uzmanlaşmak, araştırmacıların diyabetik retinopatinin patogenezi hakkında daha iyi bir anlayışa sahip olmalarına yardımcı olabilir ve bu da daha iyi farmakolojik müdahalelerin keşfine yol açabilir.
