Nuestra investigación se centró en el desarrollo de una metodología sencilla paso a paso para la preparación de láminas histológicas y la evaluación de la retina de roedores. Los resultados de un examen histológico de la retina se pueden utilizar para la investigación de muchas enfermedades oftálmicas, incluidos los trastornos neurodegenerativos y vasculares. En la literatura publicada, la descripción de la metodología para el examen histológico de los globos oculares de roedores es muy limitada.
Faltan guías paso a paso, lo que dificulta la recreación de los principiantes. Creemos que este protocolo será útil para otros investigadores. Aunque existen otros métodos que se pueden utilizar para evaluar la morfología de la retina, incluida la tomografía de coherencia óptica, el examen histopatológico permite la evaluación de células individuales y proporciona menos artefactos.
Por lo tanto, puede resultar más útil para investigar los mecanismos patológicos de las enfermedades oftálmicas. Para comenzar, retire los globos oculares de rata fijados con paraformaldehído y sacarosa del congelador. Corta el globo ocular por la mitad a lo largo del plano sagital con un bisturí afilado.
A continuación, retire y deseche la lente. Descongele el globo ocular a temperatura ambiente. Mueva las dos mitades en un casete y enjuague con agua corriente durante 20 minutos para lavar la sacarosa.
Deshidratar el globo ocular en concentraciones crecientes de etanol durante 15 minutos cada uno bajo una campana extractora, con deshidratación final en acetona durante siete minutos. Para limpiar el globo ocular, colóquelo en xileno durante siete minutos debajo de una campana extractora. Agregue un poco de parafina sólida en un vaso de precipitados y colóquelo en una incubadora configurada a una temperatura superior a la temperatura de fusión especificada por el fabricante de la parafina.
Después de que la parafina se haya derretido por completo, mueva el globo ocular al vaso de precipitados y déjelo en la incubadora durante una hora. Revuelva el vaso de precipitados cada 10 a 15 minutos durante la incubación para la infiltración de parafina en el tejido. A continuación, abra el casete y retire la tapa superior.
Elige un molde de metal y vierte una pequeña cantidad de parafina para cubrir el fondo del molde. A continuación, retire el globo ocular del casete con pinzas y coloque la mitad de un globo ocular con la parte inferior de la copa hacia arriba y la otra hacia abajo sobre la parafina del molde. Cuando el tejido esté anclado en su lugar, cubra cuidadosamente el globo ocular con parafina y la parte inferior del casete para formar un bloque.
Transfiera el bloque a una placa de enfriamiento para que se solidifique por completo. Después de la solidificación, retire el bloque del molde de metal y vuelva a colocar los bloques de parafina en la placa de enfriamiento durante 15 minutos. Asegure un bloque de parafina en el micrótomo.
Ajuste el micrótomo para recortar el exceso de parafina del bloque y recorte hasta llegar al centro del globo ocular. Después de cambiar la configuración del micrótomo, corte secciones más delgadas de 3,5 micrómetros. Coloque la sección cortada en una corredera.
Coloque el portaobjetos en una incubadora durante 15 minutos para que la parafina se derrita. A continuación, coloque el portaobjetos en xileno. Después de esto, transfiera el portaobjetos a etanol al 96%.
Después del tratamiento con etanol, lave el portaobjetos con agua corriente durante cinco minutos. Coloque el portaobjetos durante dos minutos en la hematoxilina de Mayer, seguido de dos minutos en la hematoxilina de Mayer con una solución limpia. Lave el portaobjetos dos veces con agua corriente durante cinco minutos cada uno.
Agregue 1% de eosina durante dos minutos, seguido de etanol durante un minuto y 30 segundos cada uno. Coloque el portaobjetos durante dos minutos en xileno, seguido de un minuto de xileno con otro vaso de precipitados con una solución limpia. Selle el portaobjetos con un sellador de portaobjetos automatizado.
Para comenzar, en una computadora, abra la imagen escaneada de alta resolución del globo ocular de rata y encuentre las secciones transversales de la pupila. Amplíe la sección transversal seleccionada desplazándose con el ratón. A continuación, gira el punto de la esquina derecha para ajustar la orientación de la imagen y hacer que la retina quede horizontal.
Haga clic en el cuadro de aumento en la esquina superior derecha y seleccione 20 veces para encontrar la parte más gruesa de la retina. A continuación, haga clic con el botón derecho del ratón para elegir Anotar y Regla. Coloque el cursor del ratón en la membrana limitante externa en la parte más gruesa de la retina y haga clic en el botón izquierdo para iniciar la medición.
A continuación, mueva el cursor perpendicularmente a la membrana limitante interna y vuelva a hacer clic en el botón izquierdo para completar la medición. Asigne un título a la medida como Grosor de la retina y marque las casillas para mostrar el título y la longitud. A continuación, con una regla, mida el grosor de cada capa de la retina, incluida la capa nuclear externa, la capa plexiforme externa, la capa nuclear interna y la capa plexiforme interna, y etiquételas en consecuencia.
Para contar el número de células dentro de la capa de células ganglionares, seleccione una sección de la retina y, con la regla, mida la distancia elegida a lo largo de la capa de células ganglionares. Para marcar los cuerpos de las celdas, pulse el botón derecho del ratón y seleccione Anotar, Guardar y 1 x RBC. Haga clic en cada célula identificada como un cuerpo redondo y nucleado teñido de hematina a lo largo de la capa de células ganglionares a lo largo de la longitud predeterminada de la retina.
El grosor de la retina, el grosor de las capas individuales y el número de células en la capa de células ganglionares se midieron y compararon entre individuos para evaluar las características de la neurodegeneración en la retina de los roedores.
