これらの技術の全体的な目的は、ストレプトゾトシン誘発糖尿病性網膜症ラットモデルにおける網膜病態生理を評価することである。糖尿病性網膜症は失明の主な原因の1つです。継続的な検索は、糖尿病性網膜症を治療するためのより良い有効性とより長い作用を有する薬理学的薬剤を発見するために進行中である。
前臨床動物モデルにおける薬理学的薬剤の発見プロセスは、重要な役割を果たしている。これらの動物モデルは、眼の後部組織の構造的および機能的変化を理解するのに役立つ。したがって、後部セグメントの問題でこれらの変化を研究するための3つの異なるテクニックを紹介します。
網膜細胞の層状変化を研究する組織学、血漿から硝子体内に漏れたタンパク質を定量して妥協したBRBを研究するBRBブレークダウンアッセイ、FITCデキストラン色素を用いて網膜血管系を可視化する蛍光血管造影法を実証しています。高用量のペントバルビタールを使用してラットを安楽死させ、検出可能な心拍なしでその死を確認する。メスの刃を使って眼の鼻側頭部および側頭部に切開を行って眼球を有核化する。
次に、その縁に沿って切断して、眼窩ソケットから目を取り除きます。目を取り囲む余分な脂肪を取り除き、5mLの固定液に入れます。眼を固定液中で24〜48時間インキュベートする。
固定後、固定液から眼球を取り出し、10mL PBSを充填したシャーレに移す。マイクロ鉗子を使用して、視神経で目を保持し、マイクロハサミの助けを借りてパースプラナでニックネームを作ります。角膜の縁全体を切断して、前部カップと後部カップを分離します。
レンズを外し、視神経を切断します。後部カップを2つの半分に切り、視神経を通過する。各半分を別々のカセットに移します。
エタノール濃度を50%から100%エタノールに徐々に増加させることによって組織を脱水する。そして最後に、キシレンでエタノールをきれいにする。60°Cで予熱したパラフィンを組織に含浸させ、組織内のキシレンを置換する。
そのベースとして組織とカセットを保持するためにスチールモールドを使用してパラフィンブロックを準備します。ブロックを準備している間、目の視ディスク部分はスチール金型の底に面する必要があります。カセットをパラフィンで満たし、冷たい表面に移します。
ブレードとカセットをミクロトームのそれぞれのホルダーに取り付けます。ミクロトームを使用して、余分なパラフィンワックスをトリミングし、厚さ5マイクロメートルの5〜6枚のリボンを切断する。リボンを予め温めた水浴の表面に移してリボンを広げます。
アルブミンでコーティングしたスライドガラス上の切片を集める。スライドを摂氏 37 度で一晩乾燥させます。ヘマトキシリンおよびエオジン染色を行うには、スライドを摂氏60度で1時間予熱し、パラフィンを溶融させる。
原稿に記載されている染色手順に従ってください。組織の水分補給から始めて、ヘマトキシリンで染色し、続いてエオジンで染色する。次に、組織を脱水し、切片にマウント媒体を追加します。
カバースリップを断面に置き、光学顕微鏡で可視化します。血液網膜関門破壊アッセイを行うには、ケタミンとキシラジンを用いてラットを麻酔し、つま先をつまんで麻酔状態を確認する。心臓の位置を確認し、24ゲージの針で1mLのシリンジを挿入し、心臓穿刺によって血液を引きます。
十分な血液が採取されたら、EDTAコーティングされたチューブに移す。溶血を防ぐために優しく混ぜる。眼を核形成し、直ちにドライアイスに移す。
凍結条件下で、角膜および水晶体の除去によって眼の解剖を開始する。網膜からの汚染なしに鉗子を使用して眼の後部から硝子体を引っ張る。3〜4個のビーズで均質化チューブに移します。
ビーズホモジナイザーを用いて中速で10秒間サンプルを均質化する。血液および硝子体液サンプルを微量遠心チューブに移し、さらに処理します。両方のサンプルを5で遠心分離し、摂氏4度で10分間200g。
マルチチャンネルピペットを使用して、250マイクロリットルのブラッドフォード試薬をウェルに加えます。PBSを用いて硝子体試料を10倍、血漿試料を20倍に希釈する。5マイクロリットルの希釈サンプルをブラッドフォード試薬に加え、よく混合する。
サンプルを20〜30分間インキュベートし、次いで96ウェルプレートリーダーを用いて590ナノメートルでの吸光度を測定する。試料の強度は、タンパク質の濃度に正比例する。蛍光血管造影を行うには、3%イソフルランを用いてラットを麻酔し、つま先パンチにより麻酔状態を確認する。
染料を注入する前に尾を温水に浸してください。1mLあたり50mgのFITC−デキストラン溶液1mLを側尾静脈に注入する。染料を5〜10分間循環させます。
ペントバルビタールを使用してラットを安楽死させ、検出可能な心拍によってその死を確認する。眼を核形成し、フラットマウントの準備に進みます。網膜フラットマウントを準備するには、繊維を含まないキムワイプの上に目を置き、目の前部を切断します。
ガラス質のユーモアとともに、レンズを目の後部からゆっくりと引き抜きます。後部をPBSで満たされたペトリ皿に移し、視神経を切断する。次に、尖った鉗子の先端を強膜と網膜の間に置きます。
カップの縁に沿って静かに動かして、網膜がどの時点でも強膜に付着していないことを確認してください。網膜が強膜から完全に剥離するように、視神経椎間板の近くで切断する。どの側も強膜に網膜が付着していないことを確認したら、PBS溶液にゆっくりと押し込みます。
鉗子の助けを借りて、それに損傷を与えることなく、きれいなスライドガラスに網膜を移します。マイクロはさみまたはメス刃を使用して、図に示すように網膜に4つの切り込みを入れ、4つの象限に分割します。網膜周囲から余分なPBSを除去し、網膜フラットマウントに退色防止マウント媒体を追加します。
カバースリップで覆い、共焦点顕微鏡下でフラットマウントを視覚化します。蛍光血管造影の全プロセスは、FITC−デキストラン色素からの蛍光の消光を避けるために、最小の光の下で行われることにここで注意することが重要です。糖尿病ラットでは、網膜細胞は変性を受け、さらなる合併症を引き起こす。
これらの構造変化は、組織学技術によって視覚化され、網膜の細胞数および厚さを決定することができる。糖尿病ラットの場合、浮腫のために網膜層の厚さが増加する。したがって、この技術は、糖尿病性網膜症を治療するための様々な潜在的な薬理学的薬剤をスクリーニングするのに役立つ。
糖尿病による網膜の代謝変化は、周皮細胞の喪失および血液網膜関門の破壊を引き起こす。網膜および硝子体へのタンパク質および他の生体分子の漏出があるので、総タンパク質のレベルは糖尿病ラットの硝子体において増加する。血液網膜関門の破壊を防ぐことは、糖尿病性網膜症の進行を著しく妨げる可能性がある。
糖尿病性網膜症では、血管内皮増殖因子の発現が増加し、それが新しい血管の形成につながる。これらの血管は正常な網膜構造を乱すので、その神経支配は糖尿病性網膜症を治療するための主な関心事である。蛍光血管造影技術は、ここで強調したように、新しい血管および血管の漏出を視覚化するために利用される。
しかしながら、血管新生は、糖尿病誘発の6〜12ヶ月後にのみ顕著である。この技術は、血管新生および血管漏出の神経支配に対する薬物治療の効果を定量化するのに役立ちます。糖尿病性網膜症の将来の治療には、より効率的な薬理学的薬剤が必要であるが、将来の治療は、疾患の病因をよりよく理解することによってのみ達成することができる。
これらの技術を習得することは、研究者が糖尿病性網膜症の病因についてよりよく理解するのに役立ち、より良い薬理学的介入の発見につながる可能性があります。
