Este protocolo ayuda a guiar la selección de regiones de interés para las tecnologías ómicas espaciales, lo que permite una caracterización más específica de tejidos o poblaciones celulares. Un protocolo automatizado para la selección de ROI en ensayos proteómicos es más robusto y reproducible que los protocolos manuales, y el uso de ROI de 50 micrómetros para ensayos transcriptómicos permite perfilar poblaciones celulares específicas. Comience con la programación del autotinente para aplicar anticuerpos de visualización fluorescente.
En el software autostainer, haga clic en el botón de inicio y elija Protocolos. Luego haga clic en Crear / Editar protocolos y seleccione RUO Discovery Universal como procedimiento. Haga clic en Primera secuencia, luego seleccione Deparafinación, seguido de Depar v2.
Para Temperatura media, elija 72 grados centígrados, luego haga clic en Pretratamiento y seleccione Acondicionamiento celular y depósito CC1. Para Temperatura muy alta, elija 100 grados centígrados, luego haga clic en CC1 ocho minutos y continúe haciendo clic hasta que se seleccione CC1 64 minutos. Haga clic en Inhibidor, luego seleccione DISCOVERY Inhibitor y, para Tiempo de incubación, elija ocho minutos.
Luego haga clic en Anticuerpo, seguido de Incubación de anticuerpos de alta temperatura. Para baja temperatura, elija 37 grados centígrados. Para Anticuerpo, elija el ANTICUERPO 6 de la etiqueta del dispensador.
En Plus Incubation Time (Tiempo de incubación Plus), seleccione 32 minutos. Haga clic en Multimer HRP, luego seleccione Multimer HRP Blocker. Luego, para Antibody Blocking, elija Gt Ig Block.
Y para el tiempo de incubación, elija cuatro minutos. A continuación, en Multimer HRP Reagent, seleccione OMap Anti-Rb HRP y, en Incubation Time (Tiempo de incubación), elija 16 minutos. Luego haga clic en Cy5, y para el tiempo de incubación largo, elija cero hora, ocho minutos.
Haga clic en Secuencia dual y elija Desnaturalización de anticuerpos. Luego seleccione Antibody Denature CC2-1, y para una temperatura muy alta, elija 100 grados centígrados. Asegúrese de que el tiempo de incubación sea de ocho minutos.
A continuación, haga clic en DS Inhibitor y seleccione Neutralizar. Haga clic en DS Antibody, y para Very Low Temperature, elija 37 grados centígrados. Luego, en Anticuerpo, elija ANTICUERPO 3 en la etiqueta del dispensador.
Y para Plus Incubation Time, seleccione 32 minutos. Haga clic en DS Multimer HRP y elija DS Multimer HRP Blocker. Luego, para Antibody Blocking, seleccione Gt Ig Block y, en Incubation Time, elija cuatro minutos.
A continuación, en Multimer HRP Reagent, seleccione OMap anti-Ms HRP y, en Incubation Time (Tiempo de incubación), elija 16 minutos. Luego haga clic en DS Rhodamine 6G, y para el tiempo de incubación largo, elija cero hora, ocho minutos. Haga clic en Triple tinción y seleccione Desnaturalización de anticuerpos TS, luego seleccione Desnaturalización de anticuerpos CC2-2, y para Temperatura muy alta, seleccione 100 grados centígrados.
Asegúrese de que el tiempo de incubación sea de ocho minutos. A continuación, haga clic en Inhibidor de TS y seleccione TS Neutralize. Haga clic en Cuerpo TS y, para Temperatura muy baja, seleccione 37 grados centígrados.
Luego, en Anticuerpo, seleccione el ANTICUERPO 7 de la etiqueta del dispensador y, en Plus Incubation Time, seleccione 32 minutos. Haga clic en TS Multimer HRP y elija TS Multimer HRP Blocker. Luego, para Antibody Blocking, seleccione Gt Ig Block y, en Incubation Time, elija cuatro minutos.
A continuación, en Multimer HRP Reagent, seleccione OMap Anti-Rb HRP y, en Incubation Time (Tiempo de incubación), elija 16 minutos. Luego haga clic en TS FAM y, para el tiempo de incubación largo, elija cero horas, ocho minutos. Haga clic en Guardar y agregue un título al protocolo.
Seleccione un número de protocolo, agregue un comentario y haga clic en Activo, seguido de Guardar. Secciones de tejido humano fijadas en parafina fijadas en formalina adquiridas por el vendedor de pasteles en un horno a 70 grados centígrados durante 20 a 60 minutos. Mientras se hornean las diapositivas, imprima etiquetas haciendo clic en Crear etiqueta en el software de tinción automática.
A continuación, haga clic en Protocolos, seleccione el número de protocolo y haga clic en Cerrar / Imprimir. Agregue información relevante en la etiqueta de la diapositiva y haga clic en Imprimir. Retire los portaobjetos del horno y déjelos enfriar a temperatura ambiente.
Aplique las etiquetas de protocolo previamente impresas a las diapositivas correspondientes. Cargue dispensadores de anticuerpos recargables con anticuerpos de acuerdo con los números de la etiqueta de anticuerpos. Diluir cada anticuerpo en el diluyente especificado y preparar los dispensadores de anticuerpos recargables.
Reúna los dispensadores de reactivos precargados de bloqueo, detección y amplificación y colóquelos en la bandeja de reactivos del instrumento. Cargue diapositivas en los cajones deslizantes y haga clic en En ejecución, seguido de Sí. Confirme el inicio de la ejecución comprobando la duración de la ejecución en el software autostainer.
Al día siguiente, asegúrese de completar la carrera observando las luces verdes intermitentes en las ranuras de los cajones deslizantes. Luego retire los portaobjetos del instrumento y enjuague los portaobjetos vigorosamente en un tampón de reacción 1x hasta que la solución de deslizamiento de la cubierta líquida se elimine por completo. Reemplace SYTO 13 con SYTO 64 a 5.000 nanomolares para permitir la integración de fluoróforos.
Diluir SYTO 64 en 1x TBS e incubar en una cámara de humedad durante 15 minutos. Utilice FITC para DISCOVERY Fam y establezca la exposición en 200 milisegundos. Utilice Cy3 para DISCOVERY Rhodamine 6G y establezca la exposición en 200 milisegundos.
Use Texas Red para SYTO 64 y establezca la exposición en 50 milisegundos. Especifique SYTO 64 como canal de enfoque y, por último, utilice Cy5 para DISCOVERY Cy5. Ajuste la exposición a 200 milisegundos y guarde los cambios.
Hornea las secciones de pellets de células embebidas en parafina fijadas en formalina en un horno a 70 grados centígrados durante 20 a 60 minutos. Escanee diapositivas en la plataforma de perfiles espaciales y seleccione tamaños de 50 micrómetros y 300 micrómetros. El protocolo de visualización automatizada se desarrolló incluyendo controles de dejar uno fuera para confirmar que no había sangrado de los canales vecinos.
El mapa de calor log 2 de todos los marcadores incluidos en el ensayo de proteómica espacial que compara el protocolo manual pancitoqueratina CD 45 en negro con el protocolo 3-plex automatizado en gris muestra un valor R de Spearman de 0.88. De los 31 anticuerpos utilizados en los ensayos, 23 anticuerpos tenían un valor R de Spearman mayor o igual a 0,5. El mapa de calor log 2 de los objetivos seleccionados incluidos en el ensayo de transcriptómica espacial que comparó el protocolo manual pancitoqueratina CD 45 en negro con el protocolo automatizado 3-plex en gris mostró diferencias en estos valores.
Los datos de secuenciación para el protocolo de visualización automatizada 3-plex presentaron valores más bajos en comparación con el protocolo de visualización manual pancitoqueratina CD 45, lo que también se refleja en los bajos valores R de Spearman de 0,15. Además, se observó una pérdida de rango dinámico al usar el protocolo automatizado de visualización 3-plex. La detección de pequeños ROIs en el protocolo de transcriptómica espacial se realizó mediante la selección de regiones circulares de interés a 50 micrómetros y 300 micrómetros de diámetro Los recuentos de ARN para objetivos seleccionados en diferentes líneas celulares fueron comparables entre las dos regiones de tamaños de interés después de la normalización.
Este protocolo para paneles de visualización automatizada puede ser adaptado por los investigadores mediante el intercambio de marcadores con el fin de desarrollar paneles que definan con precisión los ROI para responder a sus preguntas de proteómica espacial.
