La heterogeneidad de las estructuras esqueléticas es un obstáculo para estudiar la expresión génica en el desarrollo de cartílago y hueso. Este protocolo proporciona un método para el aislamiento preciso de tejidos adyacentes pero diferentes. Optimizamos la microdisección de captura láser para el cartílago y el hueso utilizando la tinción violeta cresil para visualizar estos tejidos para una recolección precisa manteniendo una alta integridad del ARN para su posterior análisis.
Otros tejidos se pueden aislar si el violeta cresil proporciona suficiente distinción del tejido objetivo y la calidad del ARN sigue siendo alta después de nuestro método de procesamiento. Estos tejidos incluyen suturas craneofaciales y cerebro. La criocisión es la habilidad más exigente en este protocolo.
Asegúrese de que el tejido esté diseccionado e incrustado rápidamente para mantener la máxima integridad del ARN. Para comenzar este procedimiento, diseccione el embrión o tejido de interés. Incruste la muestra en un molde de incrustación desechable con un compuesto de temperatura de corte óptimo y ajuste la orientación de la muestra con una punta o aguja.
Congele rápidamente las muestras en un baño de hielo seco y metil-2-buteno. A continuación, prepare un recipiente tapado con hielo seco colocando una lámina de papel de aluminio en el hielo seco para el almacenamiento temporal de diapositivas de muestra de disección durante la criocciones. Transfiera el espécimen congelado fresco al cubo de hielo seco.
Coloque una capa de compuesto de temperatura de corte óptima sobre un soporte para muestras de criostato e inmediatamente coloque la muestra encima del compuesto de temperatura de corte óptimo con una presión suave. Cuando el compuesto de temperatura de corte óptima esté completamente congelado, fije el soporte con la muestra en el brazo de corte de criostato. Dejar la muestra en el criostato durante 15 minutos para equilibrarla a la temperatura de corte.
Luego, secueste el tejido con un grosor de 12 micrómetros y recoge las rodajas en los portaobjetos de membrana PEN. Alinee secciones consecutivas en la membrana. Una vez completada la diapositiva, deje que las secciones se sequen durante unos minutos y, a continuación, transfiera la diapositiva a la lámina en el recipiente de hielo seco hasta que se recojan todas las diapositivas requeridas.
Guarde las diapositivas a menos 80 grados centígrados en una caja de diapositivas. Para empezar, prepare tres tubos centrífugos de 15 mililitros etiquetados. Añadir 45 mililitros de 80% etanol a cada tubo.
Coloque tres tubos sobre hielo. Coloque un tubo que contenga 45 mililitros de 95% de etanol y un tubo que contenga 100% de etanol sobre hielo. A continuación, añada 45 mililitros de xileno a un tubo centrífuga de 50 mililitros a temperatura ambiente.
Descongelar una membrana PEN se desliza brevemente colocándola contra una mano enguanada, y lávela dos veces durante 30 segundos en cada uno de los tubos que contienen 80%etanol con agitación para eliminar el compuesto de temperatura de corte óptima. A continuación, poner la diapositiva sobre una hoja de papel de aluminio. Pipetear 8 mililitros de 1%cresil violeta y 50%etanol en el portaobjetos y manchar durante 30 segundos.
Lave el portaobjetos en el tercer tubo que contenga 80% de etanol durante 30 segundos. Deshidrate el portaobjetos pasándolo a través del tubo que contiene 95%etanol durante 30 segundos, el tubo que contiene 100%etanol durante 30 segundos, y finalmente, el tubo que contiene xileno durante 30 segundos. Después de esto, coloque los portaobjetos en un delicado limpiaparabrisas durante cinco minutos para dejar que el xileno drene y deje que las secciones se sequen.
En primer lugar, encienda el microscopio de microdisección de captura láser, el láser y la computadora. Inicie sesión en el equipo e inicie el software. Cuando la luz verde esté encendida, pulse el botón rojo para activar el láser.
Cuando la luz se vuelve roja, el láser está listo para usar. Inserte la tapa de un tubo PCR de 5 mililitros en el colector. Pipetear 50 microlitros de tampón de extracción en la tapa e insertar el dispositivo de recogida en el microscopio.
En la ventana cambiar dispositivo de recopilador, haga clic en el botón Mover a punto de referencia para mover el selector al punto de referencia. Ajuste el enfoque para ver claramente el punto de referencia. A continuación, haga clic en el botón de descarga izquierdo de la barra de herramientas para bajar el portaobjetos.
Coloque la corredera en el soporte con la sección de tejido hacia abajo e inserte el soporte de nuevo en el escenario. Haga clic en Continuar en la ventana de cambiar muestra. Para configurar los parámetros del láser, seleccione la opción de control del menú láser o haga clic en el icono del láser.
Ajuste los siguientes parámetros como desee, la potencia, que es la potencia del láser, la apertura, que es la anchura del láser, y la velocidad, que es la velocidad de corte en el modo de dibujo y corte. Comience con un objetivo 5X para encontrar las áreas de interés, y cambie al objetivo que mejor muestre el área de interés. Elija el tubo para la recogida haciendo clic en la marca en el colector, luego elija mover y cortar o dibujar y cortar.
Una vez completado el corte, el tejido objetivo con membrana PEN caerá en la tapa del tubo de recolección por gravedad. Repita este proceso de selección y corte para extraer varias áreas de interés si es necesario. Después de esto, descargue el colector y cierre cuidadosamente el tubo PCR.
Coloque los tejidos microdiseccionados sobre hielo seco. Descongelar los tejidos microdiseccionados a temperatura ambiente, luego centrifugar brevemente, e incubar las muestras a 42 grados centígrados durante 30 minutos. Después de esto, gire el búfer de lelisis hacia abajo en el tubo PCR de 5 mililitros.
Realizar el tratamiento DNase y la extracción de ARN utilizando un kit de aislamiento de ARN, siguiendo las instrucciones del fabricante. En este estudio, se realiza una microdisección de captura láser optimizada del cartílago y el hueso, destacando el uso de la tinción violeta cresil en un procedimiento rápido para visualizar el cartílago y el hueso para la recolección precisa de tejido mientras se mantiene una alta integridad del ARN para el análisis posterior. La observación de las diapositivas muestra que todos los cartílagos examinados están manchados de magenta, y todos los tejidos mineralizados están manchados de marrón o negro.
Tanto el cartílago como el hueso se distinguen fácilmente de otros tejidos en múltiples sitios anatómicos. El cartílago de Meckel, el cartílago condylar y las regiones óseas mandibulares son seleccionados y aislados por microdisección de captura láser. Para obtener suficiente ARN para la secuenciación, tire de 10 regiones del cartílago de Meckel, 10 regiones de cartílago cario, o cuatro regiones de hueso mandibular en tres tubos de recolección individuales respectivamente.
A continuación, se extrae el ARN y se analiza el ARN total utilizando un bioanalizador. Este protocolo de microdisección de captura láser se utiliza en varios tejidos en diferentes etapas del desarrollo, y las mediciones del número de integridad del ARN indican una alta calidad del ARN. A continuación, se realiza un análisis de expresión génica diferencial.
Hay 4.006 genes expresados significativamente y de manera diferente entre el hueso mandibular y el cartílago de Meckel. Los genes específicos de los osteoblastos u osteocitos se expresan más alto en el hueso mandibular, mientras que los genes específicos del condrocitos se expresan más alto en el cartílago de Meckel. Además, los marcadores osteoclastos se expresan más alto en el hueso mandibular, lo que indica un aislamiento exitoso de los tejidos dirigidos.
Después de este procedimiento, se puede realizar un análisis de expresión génica, incluyendo qPCR y RNA-seq. Estos métodos pueden analizar la expresión génica del transcriptoma en tejidos o regiones de interés específicos dentro de los tejidos heterogéneos.
