このプロトコルは、空間オミクス技術の関心領域の選択をガイドするのに役立ち、組織または細胞集団のより的を絞った特性評価を可能にします。プロテオミクスアッセイにおけるROI選択のための自動プロトコルは、手動プロトコルよりも堅牢で再現性が高く、トランスクリプトミクスアッセイに50マイクロメートルのROIを使用することで、特定の細胞集団のプロファイリングが可能になります。蛍光可視化抗体を適用するためのオートステナーのプログラミングから始めます。
オートステイナーソフトウェアで、ホームボタンをクリックし、プロトコルを選択します。次に、[プロトコルの作成/編集]をクリックし、手順としてRUOディスカバリーユニバーサルを選択します。最初のシーケンスをクリックし、次に「パラフィナゼーション」を選択し、続いて「Depar v2」を選択します。
中温の場合は、摂氏72度を選択し、前処理をクリックして、細胞コンディショニングとCC1リザーバーを選択します。[非常に高い温度] で [摂氏 100 度] を選択し、[CC1] を 8 分間クリックし、[CC1 64 分] が選択されるまでクリックを続けます。[阻害剤] をクリックし、[ディスカバリー阻害剤] を選択し、[インキュベーション時間] で 8 分を選択します。
次に、抗体をクリックし、続いて高温抗体インキュベーションをクリックします。[低温] で摂氏 37 度を選択します。[抗体] で、ディスペンサーラベルから抗体 6 を選択します。
プラスインキュベーション時間で、32分を選択します。マルチマーHRPをクリックし、マルチマーHRPブロッカーを選択します。次に、抗体ブロッキングでGt Igブロックを選択します。
インキュベーション時間には4分を選択します。次に、マルチマーHRP試薬でOMap抗RB HRPを選択し、インキュベーション時間で16分を選択します。次に、Cy5をクリックし、[長いインキュベーション時間]で、ゼロ時間、8分を選択します。
デュアルシーケンスをクリックし、抗体変性を選択します。次に、抗体変性CC2-1を選択し、非常に高い温度の場合は摂氏100度を選択します。インキュベーション時間が8分であることを確認してください。
次に、DS阻害剤をクリックし、中和を選択します。DS抗体をクリックし、[超低温]で摂氏37度を選択します。次に、[抗体]で、ディスペンサーラベルから抗体3を選択します。
また、[プラスインキュベーション時間]で32分を選択します。DS Multimer HRP をクリックし、DS Multimer HRP ブロッカーを選択します。次に、[抗体ブロッキング] で [Gt Ig ブロック] を選択し、[インキュベーション時間] で 4 分を選択します。
次に、マルチマーHRP試薬でOMap抗MSHRPを選択し、インキュベーション時間で16分を選択します。次に、DSローダミン6Gをクリックし、長いインキュベーション時間の場合は、0時間8分を選択します。トリプルステインをクリックしてTS抗体変性を選択し、次に抗体変性CC2-2を選択し、超高温の場合は摂氏100度を選択します。
インキュベーション時間が8分であることを確認してください。次に、TS阻害剤をクリックし、TS中和を選択します。TS抗体をクリックし、[超低温]で摂氏37度を選択します。
次に、[抗体]でディスペンサーラベルから抗体7を選択し、[プラスインキュベーション時間]で32分を選択します。TS マルチマー HRP をクリックし、TS マルチマー HRP ブロッカーを選択します。次に、[抗体ブロッキング] で [Gt Ig ブロック] を選択し、[インキュベーション時間] で 4 分を選択します。
次にマルチマーHRP試薬でOMap抗RB HRPを選択し、インキュベーション時間で16分を選択します。次に、TS FAMをクリックし、[長いインキュベーション時間]で0時間8分を選択します。[保存] をクリックし、プロトコルにタイトルを追加します。
プロトコル番号を選択し、コメントを追加して、[アクティブ]、[保存]の順にクリックします。ベンダーが調達したホルマリン固定パラフィン包埋ヒト組織切片を、摂氏70度に設定されたオーブンで20〜60分間焼きます。スライドのベイク処理中に、オートステインソフトウェアで「ラベルを作成」をクリックしてラベルを印刷します。
次に、[プロトコル]をクリックし、プロトコル番号を選択して、[閉じる/印刷]をクリックします。スライドラベルに関連情報を追加し、[印刷]をクリックします。オーブンからスライドを取り出し、室温まで冷まします。
以前に印刷したプロトコル・ラベルを対応するスライドに適用します。詰め替え可能な抗体ディスペンサーには、抗体ラベル番号に従って抗体をロードします。各抗体を指定された希釈液で希釈し、詰め替え可能な抗体ディスペンサーをプライミングします。
ブロッキング、検出、増幅のプレフィルド試薬ディスペンサーを集め、機器の試薬トレイに置きます。スライドドロワーにスライドをロードし、[実行中]、[はい]の順にクリックします。オートステイナーソフトウェアで実行時間を確認して、実行の開始を確認します。
翌日、スライドドロワースロットの緑色のライトが点滅するのを観察して、実行が完了していることを確認します。次に、スライドを装置から取り出し、液体カバースリップ溶液が完全に除去されるまで、1x反応バッファーでスライドを激しくすすぎます。SYTO 13 を 5 , 000 ナノモルの SYTO 64 に置き換えて、蛍光色素の統合を可能にします。
SYTO 64を1x TBSで希釈し、湿度チャンバー内で15分間インキュベートします。ディスカバリーファムにFITCを使用し、露出を200ミリ秒に設定します。ディスカバリーローダミン6GにはCy3を使用し、露出を200ミリ秒に設定します。
SYTO 64 にはテキサスレッドを使用し、露出を 50 ミリ秒に設定します。フォーカス チャネルとして SYTO 64 を指定し、最後に DISCOVERY Cy5 に Cy5 を使用します。露出を 200 ミリ秒に設定し、変更を保存します。
ホルマリン固定パラフィン包埋細胞ペレット切片を摂氏70度に設定したオーブンで20〜60分間焼きます。空間プロファイリングプラットフォームでスライドをスキャンし、50マイクロメートルと300マイクロメートルのサイズを選択します。自動視覚化プロトコルは、隣接するチャネルからのブリードスルーがないことを確認するために、1つのアウトコントロールを含めることによって開発されました。
空間プロテオミクスアッセイに含まれるすべてのマーカーのログ2ヒートマップは、黒の手動パンサイトケラチンCD 45プロトコルと灰色の自動3プレックスプロトコルを比較し、スピアマンR値が0.88であることを示しています。アッセイに使用された31個の抗体のうち、23個の抗体は0.5以上のスピアマンR値を有していた。空間トランスクリプトミクスアッセイに含まれる選択されたターゲットのログ2ヒートマップは、黒の手動パンサイトケラチンCD 45プロトコルと灰色の3プレックス自動プロトコルを比較し、これらの値に違いを示しました。
3プレックス自動可視化プロトコルのシーケンシングデータは、パンサイトケラチンCD 45手動可視化プロトコルと比較して低い値を示し、これは0.15の低いスピアマンR値にも反映されています。また、3プレックス可視化自動化プロトコルを使用した場合、ダイナミックレンジの損失が観察されました。空間トランスクリプトミクスプロトコルにおける小さなROIの検出は、異なる細胞株上の選択されたターゲットの直径50マイクロメートルおよび300マイクロメートルの円形関心領域の選択によって実行され、正規化後の2つの関心領域サイズ間で比較可能であった。
自動可視化パネル用のこのプロトコルは、研究者がマーカーを交換することで、空間プロテオミクスの質問に答えるためのROIを正確に定義するパネルを開発することで適応させることができます。
