Dieses Protokoll hilft bei der Auswahl von Regionen von Interesse für Spatial Omics-Technologien, was eine gezieltere Charakterisierung von Geweben oder Zellpopulationen ermöglicht. Ein automatisiertes Protokoll für die ROI-Selektion in Proteomik-Assays ist robuster und reproduzierbarer als manuelle Protokolle, und die Verwendung von 50-Mikrometer-ROIs für Transkriptomik-Assays ermöglicht die Profilierung spezifischer Zellpopulationen. Beginnen Sie mit der Programmierung des Autostainers zum Auftragen von Fluoreszenz-Visualisierungsantikörpern.
Klicken Sie in der Autostainer-Software auf die Home-Taste und wählen Sie Protokolle. Klicken Sie dann auf Protokolle erstellen/bearbeiten und wählen Sie RUO Discovery Universal als Prozedur aus. Klicken Sie auf Erste Sequenz und wählen Sie dann Deparaffinazation, gefolgt von Depar v2.
Wählen Sie für Mediumstemperatur 72 Grad Celsius, klicken Sie dann auf Vorbehandlung und wählen Sie Zellkonditionierung und CC1-Reservoir. Wählen Sie für "Sehr hohe Temperatur" 100 Grad Celsius, klicken Sie dann auf CC1 acht Minuten und klicken Sie weiter, bis CC1 64 Minuten ausgewählt ist. Klicken Sie auf Inhibitor, wählen Sie dann DISCOVERY Inhibitor und wählen Sie für Inkubationszeit acht Minuten aus.
Klicken Sie dann auf Antikörper, gefolgt von Hochtemperatur-Antikörper-Inkubation. Wählen Sie für niedrige Temperatur 37 Grad Celsius. Wählen Sie für Antikörper den ANTIKÖRPER 6 aus dem Spenderetikett aus.
Wählen Sie für Plus Inkubationszeit 32 Minuten aus. Klicken Sie auf Multimer HRP und wählen Sie dann Multimer HRP Blocker. Wählen Sie dann für Antikörperblockierung die Option Gt Ig Block.
Wählen Sie für Inkubationszeit vier Minuten aus. Wählen Sie als Nächstes für Multimer HRP Reagenz OMap Anti-Rb HRP aus, und wählen Sie für Inkubationszeit 16 Minuten aus. Klicken Sie dann auf Cy5 und wählen Sie für Lange Inkubationszeit null Stunde, acht Minuten.
Klicken Sie auf Dual Sequence und wählen Sie Antikörper-Denaturierung. Wählen Sie dann Antikörper-Denaturierung CC2-1 und für eine sehr hohe Temperatur 100 Grad Celsius. Stellen Sie sicher, dass die Inkubationszeit acht Minuten beträgt.
Klicken Sie anschließend auf DS Inhibitor und wählen Sie Neutralisieren. Klicken Sie auf DS Antikörper und wählen Sie für Sehr niedrige Temperatur 37 Grad Celsius. Wählen Sie dann unter Antikörper die Option ANTIKÖRPER 3 aus dem Spenderetikett aus.
Wählen Sie für Plus Inkubationszeit 32 Minuten aus. Klicken Sie auf DS Multimer HRP und wählen Sie DS Multimer HRP Blocker. Wählen Sie dann für Antikörperblockierung die Option Gt Ig-Block und für Inkubationszeit vier Minuten aus.
Wählen Sie als Nächstes auf Multimer HRP Reagenz OMap Anti-Ms HRP aus, und wählen Sie für Inkubationszeit 16 Minuten aus. Klicken Sie dann auf DS Rhodamine 6G und wählen Sie für Lange Inkubationszeit null Stunde, acht Minuten. Klicken Sie auf Triple Färbung und wählen Sie TS Antikörper-Denaturierung, dann wählen Sie Antikörper-Denaturierung CC2-2 und für Sehr hohe Temperatur wählen Sie 100 Grad Celsius.
Stellen Sie sicher, dass die Inkubationszeit acht Minuten beträgt. Klicken Sie anschließend auf TS-Inhibitor und wählen Sie TS Neutralisieren. Klicken Sie auf TS-Antikörper und wählen Sie für Sehr niedrige Temperatur 37 Grad Celsius aus.
Wählen Sie dann unter Antikörper den ANTIKÖRPER 7 auf dem Etikett des Spenders aus, und wählen Sie für Plus Inkubationszeit 32 Minuten aus. Klicken Sie auf TS Multimer HRP und wählen Sie TS Multimer HRP Blocker. Wählen Sie dann für Antikörperblockierung die Option Gt Ig-Block und für Inkubationszeit vier Minuten aus.
Wählen Sie als Nächstes für Multimer HRP Reagenz OMap Anti-Rb HRP und für Inkubationszeit 16 Minuten aus. Klicken Sie dann auf TS FAM und wählen Sie für Lange Inkubationszeit die Option Null Stunde, acht Minuten. Klicken Sie auf Speichern und fügen Sie dem Protokoll einen Titel hinzu.
Wählen Sie eine Protokollnummer aus, fügen Sie einen Kommentar hinzu und klicken Sie auf Aktiv, gefolgt von Speichern. Backen Sie vom Hersteller beschaffte formalinfixierte, in Paraffin eingebettete menschliche Gewebeschnitte in einem Ofen, der auf 70 Grad Celsius eingestellt ist, für 20 bis 60 Minuten. Drucken Sie Etiketten aus, indem Sie in der Autostainer-Software auf "Etikett erstellen" klicken.
Klicken Sie anschließend auf Protokolle, wählen Sie die Protokollnummer aus und klicken Sie auf Schließen/Drucken. Fügen Sie relevante Informationen auf dem Folienetikett hinzu und klicken Sie auf Drucken. Dias aus dem Ofen nehmen und auf Raumtemperatur abkühlen lassen.
Wenden Sie die zuvor gedruckten Protokollbeschriftungen auf die entsprechenden Folien an. Beladen Sie nachfüllbare Antikörperspender mit Antikörpern entsprechend den Antikörper-Label-Nummern. Verdünnen Sie jeden Antikörper in dem angegebenen Verdünnungsmittel und bereiten Sie die nachfüllbaren Antikörperspender vor.
Sammeln Sie vorgefüllte Reagenzienspender zum Blockieren, Erkennen und Verstärken und legen Sie sie auf das Reagenzienfach des Instruments. Laden Sie die Folien in die Folienschubladen und klicken Sie auf Ausführen, gefolgt von Ja. Bestätigen Sie den Start des Laufs, indem Sie die Laufdauer in der Autostainer-Software überprüfen.
Stellen Sie am nächsten Tag sicher, dass der Lauf abgeschlossen ist, indem Sie die grün blinkenden Lichter an den Schubladenschlitzen beobachten. Nehmen Sie dann die Objektträger vom Gerät ab und spülen Sie die Objektträger kräftig in 1x Reaktionspuffer ab, bis die flüssige Deckglaslösung vollständig entfernt ist. Ersetzen Sie SYTO 13 durch SYTO 64 bei 5.000 Nanomolaren, um die Integration von Fluorophoren zu ermöglichen.
SYTO 64 in 1x TB verdünnen und 15 Minuten in einer Feuchtigkeitskammer inkubieren. Verwenden Sie FITC für DISCOVERY Fam und stellen Sie die Belichtung auf 200 Millisekunden ein. Verwenden Sie Cy3 für DISCOVERY Rhodamine 6G und stellen Sie die Belichtung auf 200 Millisekunden ein.
Verwenden Sie Texas Red für SYTO 64 und stellen Sie die Belichtung auf 50 Millisekunden ein. Geben Sie SYTO 64 als Fokuskanal an und verwenden Sie schließlich Cy5 für DISCOVERY Cy5. Stellen Sie die Belichtung auf 200 Millisekunden ein und speichern Sie die Änderungen.
Backen Sie formalinfixierte, in Paraffin eingebettete Zellpelletabschnitte in einem Ofen, der auf 70 Grad Celsius eingestellt ist, für 20 bis 60 Minuten. Scannen Sie Objektträger auf der räumlichen Profilierungsplattform und wählen Sie Größen von 50 Mikrometern und 300 Mikrometern aus. Das automatisierte Visualisierungsprotokoll wurde entwickelt, indem es Steuerelemente zum Auslassen von Eins enthält, um zu bestätigen, dass es kein Durchbluten von den benachbarten Kanälen gab.
Die Log-2-Heatmap aller Marker, die im räumlichen Proteomik-Assay enthalten sind und das manuelle Pan-Cytokeratin-CD-45-Protokoll in Schwarz mit dem automatisierten 3-Plex-Protokoll in Grau vergleichen, zeigt einen Spearman-R-Wert von 0,88. Von den 31 Antikörpern, die in den Assays verwendet wurden, hatten 23 Antikörper einen Spearman-R-Wert größer oder gleich 0,5. Die Log-2-Heatmap ausgewählter Ziele, die im räumlichen Transkriptomik-Assay enthalten waren, der das manuelle Pan-Cytokeratin-CD-45-Protokoll in Schwarz mit dem automatisierten 3-Plex-Protokoll in Grau verglich, zeigte Unterschiede in diesen Werten.
Die Sequenzierungsdaten für das automatisierte 3-Plex-Visualisierungsprotokoll wiesen im Vergleich zum manuellen Visualisierungsprotokoll Pan-Cytokeratin CD 45 niedrigere Werte auf, was sich auch in den niedrigen Spearman-R-Werten von 0,15 widerspiegelt. Außerdem wurde ein Verlust des Dynamikbereichs beobachtet, wenn das automatisierte 3-Plex-Visualisierungsprotokoll verwendet wurde. Die Detektion kleiner ROIs im räumlichen Transkriptomik-Protokoll erfolgte durch die Auswahl von kreisförmigen Regionen von Interesse bei 50 Mikrometer und 300 Mikrometer Durchmesser, RNA-Zählungen für ausgewählte Ziele auf verschiedenen Zelllinien waren zwischen den beiden Regionen mit interessierenden Größen nach der Normalisierung vergleichbar.
Dieses Protokoll für automatisierte Visualisierungspanels kann von Forschern durch den Austausch von Markern angepasst werden, um Panels zu entwickeln, die ROIs genau definieren, um ihre räumlichen Proteomik-Fragen zu beantworten.
