Este protocolo ajuda a orientar a seleção de regiões de interesse para tecnologias ômicas espaciais, o que permite uma caracterização mais direcionada de tecidos ou populações celulares. Um protocolo automatizado para seleção de ROI em ensaios proteômicos é mais robusto e reprodutível do que protocolos manuais, e o uso de ROIs de 50 micrômetros para ensaios transcriptômicos permite o perfil de populações celulares específicas. Comece programando o autostainer para aplicar anticorpos de visualização fluorescente.
No software autostamant, clique no botão home e escolha Protocolos. Em seguida, clique em Criar/Editar Protocolos e selecione RUO Discovery Universal como procedimento. Clique em Primeira Sequência e, em seguida, selecione Deparaffinazation, seguido por Depar v2.
Para Temperatura Média, escolha 72 graus Celsius, clique em Pré-tratamento e selecione Condicionamento Celular e Reservatório CC1. Para Very High Temperature, escolha 100 graus Celsius, clique em CC1 oito minutos e continue clicando até que CC1 64 minutos seja selecionado. Clique em Inibidor, selecione Inibidor DISCOVERY e, para Tempo de Incubação, escolha oito minutos.
Em seguida, clique em Anticorpo, seguido de Incubação de Anticorpo de Alta Temperatura. Para Baixa Temperatura, escolha 37 graus Celsius. Para Anticorpos, escolha o ANTICORPO 6 no rótulo do dispensador.
Para Mais Tempo de Incubação, selecione 32 minutos. Clique em Multimer HRP e, em seguida, selecione Multimer HRP Blocker. Em seguida, para Bloqueio de Anticorpos, escolha Gt Ig Block.
E para Tempo de Incubação, escolha quatro minutos. Em seguida, em Multimer HRP Reagent, selecione OMap Anti-Rb HRP e, para Tempo de incubação, escolha 16 minutos. Em seguida, clique em Cy5 e, para Tempo de Incubação Longo, escolha zero hora, oito minutos.
Clique em Dual Sequence e escolha Antibody Denaturation. Em seguida, selecione Antibody Denature CC2-1 e, para uma temperatura muito alta, escolha 100 graus Celsius. Certifique-se de que o tempo de incubação seja de oito minutos.
Em seguida, clique em Inibidor de DS e selecione Neutralizar. Clique em DS Antibody e, para Very Low Temperature, escolha 37 graus Celsius. Em seguida, em Anticorpo, escolha ANTICORPO 3 no rótulo do dispensador.
E para Mais Tempo de Incubação, selecione 32 minutos. Clique em DS Multimer HRP e escolha DS Multimer HRP Blocker. Em seguida, para Bloqueio de Anticorpos, selecione Gt Ig Block e, para Tempo de Incubação, escolha quatro minutos.
Em seguida, em Multimer HRP Reagent, selecione OMap anti-Ms HRP e, para Tempo de incubação, escolha 16 minutos. Em seguida, clique em DS Rhodamine 6G e, para Tempo de Incubação Longo, escolha zero hora, oito minutos. Clique em Tripla Mancha e selecione Desnaturação de Anticorpos TS, em seguida, selecione Desnaturação de Anticorpos CC2-2 e, para Temperatura Muito Alta, selecione 100 graus Celsius.
Certifique-se de que o tempo de incubação seja de oito minutos. Em seguida, clique em Inibidor de TS e selecione TS Neutralizar. Clique em TS Anticorpo e, para Temperatura Muito Baixa, selecione 37 graus Celsius.
Em seguida, em Anticorpo, selecione o ANTICORPO 7 no rótulo do dispensador e, para Tempo de Incubação Adicional, selecione 32 minutos. Clique em TS Multimer HRP e escolha TS Multimer HRP Blocker. Em seguida, para Bloqueio de Anticorpos, selecione Gt Ig Block e, para Tempo de Incubação, escolha quatro minutos.
Em seguida, em Multimer HRP Reagent, selecione OMap Anti-Rb HRP e, para Tempo de incubação, escolha 16 minutos. Em seguida, clique em TS FAM e, para Tempo de Incubação Longo, escolha zero hora, oito minutos. Clique em Salvar e adicione um título ao protocolo.
Selecione um número de protocolo, adicione um comentário e clique em Ativo, seguido de Salvar. Asse as seções de tecido humano embutidas em parafina fixadas em formalina adquiridas pelo fornecedor em um forno ajustado a 70 graus Celsius por 20 a 60 minutos. Enquanto os slides estiverem assando, imprima as etiquetas clicando em Criar Etiqueta no software de coloração automática.
Em seguida, clique em Protocolos, selecione o número do protocolo e clique em Fechar/Imprimir. Adicione informações relevantes na etiqueta do slide e clique em Imprimir. Retire as lâminas do forno e deixe-as esfriar até a temperatura ambiente.
Aplique as etiquetas de protocolo impressas anteriormente aos slides correspondentes. Carregue os dispensadores de anticorpos recarregáveis com anticorpos de acordo com os números do rótulo do anticorpo. Diluir cada anticorpo no diluente especificado e preparar os dispensadores de anticorpos recarregáveis.
Reúna dispensadores de reagentes pré-preenchidos com bloqueio, detecção e amplificação e coloque-os na bandeja do reagente do instrumento. Carregue slides nas gavetas de slides e clique em Execução, seguido de Sim. Confirme o início da execução verificando a duração da execução no software de retenção automática.
No dia seguinte, garanta a conclusão da corrida observando luzes verdes piscando nos slots da gaveta deslizante. Em seguida, retire as lâminas do instrumento e enxágue as lâminas vigorosamente em tampão de reação 1x até que a solução de deslizamento da tampa líquida seja completamente removida. Substitua o SYTO 13 pelo SYTO 64 a 5.000 nanomolares para permitir a integração do fluoróforo.
Diluir SYTO 64 em 1x TBS e incubar em uma câmara de umidade por 15 minutos. Use o FITC para DISCOVERY Fam e defina a exposição para 200 milissegundos. Use Cy3 para DISCOVERY Rhodamine 6G e defina a exposição para 200 milissegundos.
Use Texas Red para SYTO 64 e defina a exposição para 50 milissegundos. Especifique SYTO 64 como o canal de foco e, finalmente, use Cy5 para DISCOVERY Cy5. Defina a exposição para 200 milissegundos e salve as alterações.
Asse as seções de pellets de células embutidas em parafina fixadas em formalina em um forno ajustado a 70 graus Celsius por 20 a 60 minutos. Digitalize slides na plataforma de perfil espacial e selecione tamanhos de 50 micrômetros e 300 micrômetros. O protocolo de visualização automatizada foi desenvolvido incluindo controles de deixar um de fora para confirmar que não houve sangramento dos canais vizinhos.
O mapa de calor log 2 de todos os marcadores incluídos no ensaio de proteômica espacial comparando o protocolo manual de pan-citoqueratina CD 45 em preto com o protocolo automatizado de 3-plex em cinza mostra um valor de Spearman R de 0,88. Dos 31 anticorpos utilizados nos ensaios, 23 anticorpos apresentaram um valor de Spearman R maior ou igual a 0,5. O mapa de calor log 2 dos alvos selecionados incluídos no ensaio de transcriptômica espacial comparando o protocolo manual de pan-citoqueratina CD 45 em preto com o protocolo automatizado de 3-plex em cinza mostrou diferenças nesses valores.
Os dados de sequenciamento para o protocolo de visualização automatizada de 3 plexos apresentaram valores inferiores quando comparados ao protocolo de visualização manual de pan-citoqueratina CD 45, o que também se reflete nos baixos valores de R de Spearman de 0,15. Além disso, uma perda de faixa dinâmica foi observada ao usar o protocolo automatizado de visualização de 3 plexos. A detecção de pequenas ROIs no protocolo de transcriptômica espacial foi realizada pela seleção de regiões circulares de interesse a 50 micrômetros e 300 micrômetros de diâmetro, contagens de RNA para alvos selecionados em diferentes linhagens celulares foram comparáveis entre as duas regiões de interesse após a normalização.
Este protocolo para painéis de visualização automatizada pode ser adaptado por pesquisadores através da troca de marcadores, a fim de desenvolver painéis que definem com precisão ROIs para responder às suas questões de proteômica espacial.
