Name: immunohistochemical detection of 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine in developing and postmitotic mouse retina
Uploaded: 2018-08-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
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Diese Arbeit wurde unterstützt durch einen SBIR Zuschuss (1R44EY027654-01A1).

Alle Eingriffe mit Mäusen waren gemäß Protokollen durch die Kinder Hospital Oakland Research Institute Tier Pflege und Verwendung Committee genehmigt und der Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) Erklärung für die Nutzung eingehalten von Tieren in der Augenheilkunde und vision Forschung.
(1) Gewebe Vorbereitung Immunostaining
<ol><li>Einschläfern C57 BL/6J Mäuse an embryonalen Tag (E) 16, postnatale (P) 0, P15 und P90 durch Kohlendioxid (CO2) gefolgt von Enthauptung (E16 und P0 Mäuse).</li>
	<li>Augen sofort Einatmung Maus punktiert mit 29 1/2 Nadel an der dorsalen Seite des Auges. 5 Minuten (min) in 1 mL 4 % Paraformaldehyd (PFA) Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (1 X PBS) pH 8.0 bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
	<li>Um Augenmuscheln aus P0, P15 und P90, sezieren, Hornhaut und Linse mit feinen ophthalmologischen Schere während Augen in den 4 % PFA. Hinweis: Überspringen diesen Schritt für E16 Augen wie die Augen sind zu klein.</li>
	<li>Befestigen Sie die Augenmuschel (P0, P15 und P90) und die ganze Augen (E16) in 4 % PFA für 20 min bei Raumtemperatur. Dann waschen Sie die Augenmuscheln und ganze Augen zweimal in 1 mL 1 X PBS für 10 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Cryoprotect das Auge Tassen und Augen ganz in 1xPBS pH 8.0 enthält 10 % Saccharose für 1 Stunde. Halten Sie in 20 % Saccharose mit 1 X PBS-Puffer für 1 Stunde und dann sättigen Sie, in 30 % Saccharose in 1 X PBS über Nacht bei 4 ° C.</li>
	<li>Am nächsten Tag die Augenmuschel und die ganze Augen in optimale Temperatur Verbindung (OCT), (500 µL) in Cryomolds einzubetten, Snap-Freeze in einem Trockeneis/Ethanol-Bad und bei-80 ° c Lagern</li>
	<li>Entfernen Sie die Formen mit eingebetteten Augenmuscheln und ganze Augen von-80 ° C und-20 ° c für 1 Stunde vor Kryoschneiden equilibrate lassen.</li>
	<li>Schneiden von retinalen Querschnitte (12 µm dick) Parallel zur Temporonasal Achse durch den Sehnerv Kopf mit einem Kryostaten bei-20 ° C.</li>
	<li>Montieren Sie retinalen Abschnitte auf Mikroskop Folien53 und Store bei-80 ° C.</li>
</ol>(2) Immunostaining mit 5-mC und 5-HmC Antikörper
<ol><li>Umschließen Sie die Netzhaut Abschnitte auf Folien mit einem Stift hydrophobe Barriere montiert. Die hydrophobe Barriere Stift reduziert die Lautstärke des Antikörpers erforderlich, um das Gewebe zu färben.</li>
	<li>Waschen Sie die Netzhaut Abschnitte einmal mit 200 µL 1 X PBS 10 min. lang.</li>
	<li>Permeabilize der Netzhaut Abschnitte mit 200 µL 0.1 % Triton x-100 mit 1 X PBS-Puffer (PBS-T) für 10 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Denaturieren Sie retinalen Abschnitte für 30 min mit 200 µL frisch gemacht 2 N Salzsäure (HCl) und mit 1 X PBS-Puffer in einem Inkubator 37 ° C. Hinweis: Sorgfältige Titration von HCl Behandlung ist notwendig, um das 5mC Signal zu optimieren.</li>
	<li>Immer auch biologische Wiederholungen (3-4) bei gleichzeitiger Optimierung 5mC Signal54. Hinweis: Wir haben Antigen-Retrieval zu 4 Zeitpunkten (15 min, 30 min, 1 h und 2 h) und gefunden 30 min Inkubation ist optimal für 5mC Signal. Längere Inkubation mit HCl verschlechtert sich die Struktur der Atomkerne führt zur Unfähigkeit, 5mC Signal in den Zellkern zu lokalisieren.</li>
	<li>Nach Denaturierung, neutralisieren retinalen Abschnitte durch Zugabe von 100 µL der 0,1 M Tris-HCl (pH 8,3) auf Netzhaut Abschnitte 10 min. lang.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Abschnitte in 500 µL Lösung zu blockieren (5 % preimmune normalem ziegenserum in 0,1 % Triton x-100 mit 1 X PBS-Puffer) für 1 h bei Raumtemperatur in einer feuchten Kammer.</li>
	<li>Fügen Sie nach der Blockierung, Anti-5mC; Anti-5hmC Antikörper verdünnt 1: 500 in blocking-Lösung für die Netzhaut Abschnitte.</li>
	<li>Inkubieren Sie der Netzhaut, die Abschnitte über bei 4 ° C in feuchten Kammer Nacht.</li>
	<li>Der nächste Tag waschen, retinale Abschnitte 3 mal (10-15 min jedes Mal) mit 0,1 % PBS-T und dann in blocking-Lösung mit den entsprechenden Sekundärantikörper inkubieren (Goat Anti-Kaninchen und Goat Anti-Maus IgG, verdünnt; 1: 1000), mit DAPI (4', 6 - Diamidino-2-Phenylindole) Lösung (1 µg/mL) bei Raumtemperatur für 1 h in blocking-Lösung. Hinweis: Vermeiden Sie Trocknen von Abschnitten in allen Phasen des Immunodetection.</li>
	<li>Waschen Sie die Folien drei Mal mit 1 mL 0,1 % PBS-T.</li>
	<li>Nach dem letzten waschen die Abschnitte mit wässrigen Eindeckmedium unter einem deckgläschen montieren und mit farblosen Nagellack versiegeln.</li>
</ol>(3) konfokale Immunohistochemistry
<ol><li>Richten Sie die Abschnitte die retinalen Pigment Epithel Seite des Optik-Cup immer mit Blick auf einen Weg (z. B. oben), für Konsistenz zu haben.</li>
	<li>Führen Sie Bilderfassung von Immunostained Netzhaut Abschnitte bei 63 X (Vergrößerung von einem Objektiv) mit 2 X oder 3 X zoom.</li>
	<li>Generieren Sie mehrere optische Abschnitte auf jedes ausgewählte Bild (Z-Stapel) in allen 3 Kanälen (rot, grün und blau, RGB) mit 0,35 µm Schritt. Hinweis: Die letzte Vergrößerung einer Probe bei 10-20 X visualisiert (Vergrößerung von einem Objektiv) werden 63 X, jeweils in Kombination mit einem (in der Regel verwendeten) 10-fach Okular. Visualisieren Sie komprimierte optische Stack um das 5mC und 5hmC Signal zu finden</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

DNA-Methylierung und Hydroxymethylation sind dynamisch und reversible DNA-Modifikationen, welche Modulatethe vielfältigen biologischen Mechanismen in einem Entwicklungsland ebenso wie in postmitotischen Zellen. Hier beschreiben wir eine reproduzierbare Technik zur Erfassung von 5mC und 5hmC DNA-Modifikationen in Situ durch immunhistochemische Technik (mit Anti-5mC und Anti-5hmC Antikörper) in Paraformaldehyd fixiert Gefrierschnitte Maus Netzhaut, und bieten Richtlinien für die Verbesserung und Standardisierung der Ergebnisse, vor allem, wenn mehrere verschiedene Proben zu vergleichen. Wir früher verwendet diese Methode, 5mC Veränderungen der Netzhaut Maus mit Netzhaut-spezifische Ausrichtung der Dnmt1, Dnmt3a und Dnmt3b DNA Methyltransferase Gene abzugrenzen, und berichtet von der (voraussichtlichen) Erschöpfung der 5mC Marken in ihre Netzhaut7 .
Der entscheidende Schritt in 5mC immunhistochemischen Nachweis ist die Optimierung der Behandlung von histologischen Schnitten mit HCl: weniger als 15 min Vorbehandlung voraussichtlich nicht reproduzierbaren Ergebnissen, während übermäßige Behandlung mit HCl die nukleare zerstört Architektur. Wir fanden beste Ergebnis nach 30 min Inkubation mit HCl. Wir empfehlen, immer frisch verdünnte HCl und frisch zubereiteten 4 % PFA Lösung für DNA Denaturierung und retinalen Gewebes Fixierung verwenden.
Um die Ergebnisse zu beheben, wird empfohlen, drei bis vier biologischen Wiederholungen bei gleichzeitiger Optimierung 5mC Signal aufzunehmen. Während jeder einzelne von Satz kann immunhistochemische Färbung leicht unterschiedliche Ergebnisse (mehr oder weniger hellen heterochromatischen Regionen), erzeugen die immunhistochemische Methode und der 5mC 5hmC nuklearen Verteilung innerhalb der einzelnen erwartet der Abschnitte werden voraussichtlich für sehr reproduzierbar sein, solange das Protokoll gefolgt ist.
Diese Technik hat auch Einschränkung, da wir konsequent Variabilität in 5mC Verteilung in der Photorezeptor Zellkerne innerhalb des gleichen Abschnitts zu beobachten. Wir fanden einige Kerne zeigte starke 5mC Signal während angrenzenden Zellkerne kein 5mC Signal zeigte. Dies ist aufgrund der Einschränkung in Demaskierung 5mC Antigen durch HCl Behandlung in Gefrierschnitte.
Die Bedeutung dieser Technik ermöglicht 5mC Lokalisierung ohne DNase und Proteinase K-Behandlung führt zu besseren Schutz der Chromocenters. Diese Technik ist robust auf alle Abschnitte von allen Wirbeltieren tierischen Geweben, tragenden 5mC, 5hmC Marken arbeiten und mit einen ähnlichen Ansatz, nicht nur Maus Netzhaut für verarbeitet, solange das Protokoll gefolgt ist.

Epigenetischen Regulation von Entwicklung und postmitotischen Homöostase der Maus Netzhaut ist ein spannender Bereich der Forschung, welche verspricht eine neuartige Verständnis der biologischen Mechanismen, die Steuerung von Retinogenesis und Zelle Schicksal Bestimmung, bringen Zelle typspezifischen Stoffwechselfunktionen sowie Zelle Pathologien, Zelltod und Regeneration1,2,3,4,5,6,7,8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. Chromatin erfährt dynamische Veränderungen in der Entwicklung sowie als Reaktion auf Variable externe Signale, sei es stress, metabolischen oder Zelle Tod Reize6,14,15, 16 , 17 , 18. in Maus Kerne Chromatin gliedert sich in aktive Euchromatin und inaktive Heterochromatin6,19,20. In Interphase Nucleus wohnt Euchromatin im inneren Bereich des Kernes während Heterochromatin der nuklearen Peripherie und Nukleolus Linien. Dieses Muster wird als konventionelle und ist hoch konserviert in den Eukaryotes. Im Gegensatz dazu haben Stab Kerne in nachtaktive Tiere wie Maus und Ratte Muster invertiert, wo der Kern von Heterochromatin in der Mitte umgeben von Euchromatin bildet die äußerste Schale6,18besetzt ist, 20. Bei der Geburt haben die Rute Kerne konventionellen nuklearen Architektur. Umkehrung der Rute Kerne erfolgt während der Entwicklung durch Umbau von konventionellen und nuklearen Architektur. Während dieses Prozesses periphere Heterochromatin trennt von der nuklearen Peripherie und Chromocenters verschmelzen zu einer einzigen Chromocenter in der Mitte der Kern6,18.
Genomische DNA-Methylierung beteiligt sich bei der Kontrolle der lokalen Chromatin Konformation21. DNA-Methylierung tritt an der 5' Position von Cytosin Rückständen von CpG dinucleotid, die angereichert sind in der Promotorregion vieler Gene in der Maus Genome22,23,24,25,26 sowie in intergenetischer und Intron-Regionen, die regulatorische Elemente27tragen. Methylierung von CpG Inseln im proximalen Promotoren21,24 und CpG-Sequenzen in gen Enhancer27,28 ist wichtig bei der Regulation der dynamische Zustand des bivalenten Chromatin, mit vielen Developmental Gene/Transkription Faktoren spielen wichtige Rolle bei der Entwicklung, Krebs und Altern29,30,31,32,33,34 . DNA-Methylierung bei Maus Entwicklung35beteiligen sich drei DNA-Methyltransferasen (DNMTs). Alle drei DNMTs sind während Maus retinalen Entwicklung36 und Netzhaut-spezifische Änderungen in Dnmt Gene Auswirkungen retinalen Entwicklung2,7zum Ausdruck gebracht. Hydroxymethylcytosine (5hmC) resultiert oxidative Demethylierung 5-Methylcytosine (5mC). Die drei zehn-elf Translokation (TET) Enzyme beteiligt 5mC Demethylierung37,38,39. Hydroxymethyl-C Modifikation wird in Promotoren, gen Körpern und intergenetischer Genomsequenzen innerhalb gen reichen und aktiv transkribierten Regionen27,40bereichert.
Es gibt eine Vielzahl der beschriebenen Ansätze zur Bestimmung der veränderten Methylierungsmuster der DNA in Zellen41,42,43,44,45,46, einige davon ermöglichen Quantifizierung der globale Veränderungen der DNA-Methylierung, während andere mit Schwerpunkt auf präzise Änderungen in CpG-reiche Regionen Promotoren und Geschmacksverstärker. Methoden für die Erkennung und Quantifizierung von 5hmC wurden auch berichteten47, einschließlich von Immunohistochemistry13. Immunhistochemischen Techniken, die robuste Überwachung der 5mC und 5hmC Veränderungen in Kernen der Entwicklung ermöglichen und postmitotischen Zellen sind sehr informativ für die Abgrenzung Chromatin Dynamik in Situ in Reaktion auf externe oder interne Änderungen Auswirkungen auf die Zellen4,13,48,49. Dieser Ansatz ist jedoch anfällig für DNA-Methylierung und Hydroxymethylation Änderungen aufgrund technischer Probleme, verbunden mit Erkennung von Cytosin Änderungen in histologische Präparate zu unterschätzen. Deshalb, weil die unpolaren DNA-Datenbanken, einschließlich 5mC und 5hmC geändert Cytosin, in der Mitte der doppelsträngigen DNA-Helix50versteckt sind und erfordern entlarven. Dies ist eine besondere Herausforderung im gefrorenen histologische Präparate, die schnell informativ Organisation des ursprünglichen Gewebes verlieren können, wenn harte Behandlung angewendet wird.
Die Maus Netzhaut ist ein ausgezeichnetes Modell, den Beitrag der DNA-Methylierung neurale Entwicklung und postmitotischen Homöostase zu zergliedern. Es gibt nur 6 Arten von Neuronen (Stab und Zapfen-Photorezeptoren, amakrinen, Bipolarzellen, Horizontal "und" Ganglion), einem glialen Zelltyp (Muller Glia) und ein neuroepithelialer Zell-Typ (retinale Pigmentepithel)51. Netzhaut Zelltypen wurden berichtet, unterschiedliche Muster der DNA-Methylierung18,19, haben die vor kurzem bei Single-Base Auflösung1,5,9,12untersucht worden. Wir berichteten vor kurzem Immunohistochemistry Anwendung zur Abgrenzung 5mC Muster der Verteilung innerhalb der Kerne der netzhautzellen und Veränderungen in den Kernen der Erwachsenen Maus Netzhaut, wo alle drei DNA-Methyltransferasen durch bedingte gezielte entfernt wurden 7. im Vergleich zu einer Reihe von Berichten, wo das Vorhandensein von DNA-Methylierung in netzhautzellen konnte nur als positiv betrachtet werden oder negatives Signal in Hypermethylated Zellen in Apoptose, aktiviert unsere Vorgehensweise erkennen spezifische Chromatin Anordnung innerhalb der Netzhaut Zellkerne, die wir mehrere Gruppen berichtet und erläuterten5,6,7,18,19,36 , 52. hier beschreiben wir die immunhistochemische (IHC) Technik 5mC und 5hmC ebenso wie die Daten zeigen, die wir Ihnen aus unserer ursprünglichen Bericht7 reproduzieren konnten in gefrorenen Paraformaldehyd fixiert histologischen Abschnitten im Detail erkennen .

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Supplies&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>29G1/2 ULTRA-FINE</td><td>BD Biosciences</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>Ophthalmic scissor</td><td>Fine Science tools, Inc.&amp;nbsp;</td><td>15000-03</td><td></td></tr><tr><td>PAP pen</td><td>RPICORP.com</td><td>195505</td><td></td></tr><tr><td>Microslide Superfrost plus</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Reagent&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Electron Microscope Science</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek Optical cutting compound (OCT)</td><td>VWR</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Triton X 100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>6 N HCl</td><td>VWR analytical&amp;nbsp;</td><td>BDH7204-1</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl pH 8.3</td><td>Teknova</td><td>T1083</td><td></td></tr><tr><td>Goat serum</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>005-000-121</td><td></td></tr><tr><td>5mC</td><td>Genway Biotech&amp;nbsp;</td><td>GWB-BD5190</td><td></td></tr><tr><td>5hmC</td><td>Active Motif</td><td>39791</td><td></td></tr><tr><td>LaminB1</td><td>Abcam</td><td>Ab16048</td><td></td></tr><tr><td>Cy2 AffiniPure Goat Ant-Rabbit IgG</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>111-225-1444</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 AffiniPure Goat Ant-Mouse IgG</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>115-585-166</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold Antifade medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MICRM HM 550</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>388114</td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

immunohistochemical detection of 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine in developing and postmitotic mouse retina

Die Epigenetik der retinalen Entwicklung ist eine gut untersuchte Forschungsfeld, das verspricht, bringen eine neue Ebene des Verständnisses über die Mechanismen der unterschiedlichsten menschlichen degenerativen Netzhauterkrankungen und neue Behandlungsansätze zu lokalisieren. Die nukleare Architektur der Maus Netzhaut gliedert sich in zwei verschiedenen Mustern: konventionelle und umgekehrt. Konventionellen Muster ist universell, wo Heterochromatin lokalisiert an der Peripherie des Zellkerns, während aktive Euchromatin im nuklearen inneren wohnt. Im Gegensatz dazu ist invertiert nuklearen Muster nur für die Erwachsenen Stab Photorezeptor Zellkerne Heterochromatin, das nukleare Zentrum lokalisiert, wobei Euchromatin befindet sich in der nuklearen Peripherie. DNA-Methylierung wird überwiegend im Chromocenters beobachtet. DNA-Methylierung ist eine dynamische kovalente Modifikation auf die Cytosin-Rückstände (5 Methylcytosine, 5mC) von CpG dinucleotid, die in den Regionen Förderer vieler Gene angereichert sind. Drei DNA-Methyltransferasen (DNMT1, DNMT3A und DNMT3B) in der Methylierung der DNA während der Entwicklung zu beteiligen. Erkennung von 5mC mit immunhistochemischen Techniken ist eine große Herausforderung, einen Beitrag zur Variabilität der Ergebnisse, da alle DNA-Basen, einschließlich 5mC geändert Basen innerhalb der doppelsträngigen DNA-Helix verborgen sind. Detaillierte Darstellung der 5mC Verteilung während der Entwicklung ist jedoch sehr informativ. Hier beschreiben wir eine reproduzierbare Technik für robuste immunhistochemischen Nachweis von 5mC und eine weitere epigenetische DNA-Marker 5-Hydroxymethylcytosine (5hmC), die mit der "offenen", transcriptionally aktiv Chromatin bei der Entwicklung von colocalizes und postmitotischen Maus Netzhaut.

Um die Verteilung von 5-Methylcytosine (5mC) und 5-Hydroxymethylcytosine (5hmC) während der retinalen Entwicklung und in postmitotischen Netzhaut bestimmen wir Immunostained C57BL/6J Maus retinalen Abschnitt von E16, P0, P15 und P90 mit spezifischen Antikörpern nach 5mC und 5hmC.
E16 war die 5mC Färbung stark in Chromocenters von den Zellkernen während schwache Färbung in der gesamten Zellkerne (Abbildung 1a) beobachtet wurde. Die 5hmC Färbung beschränkte sich auf die Zellkerne und abwesend war von der Chromocenters (Abb. 1 b).
In P0 Netzhaut wurde das 5mC-Signal an den Chromocenters der Zellkerne und nukleare Peripherie (Abb. 2a, Pfeil und Pfeilspitze) lokalisiert. Wir beobachteten auch schwache Färbung des 5mC zwischen den Chromocenters der Zellkerne. Das 5hmC-Signal war stark in den Zellkernen mit Ausnahme der Chromocenters (Abb. 2 b). Wir fanden, dass mehr Kerne mit 5mC und 5hmC im Inneren Neuroblast Schicht (INBL) (Abbildung 2 c, gepunktete Linie) gefärbt sind
P15 Netzhaut fanden wir starke Färbung des 5mC und 5hmC in nuklearen Außenschicht (ONL), nukleare Innenschicht (INL) und Ganglion Zellschicht (GCL) (Abbildung 3). Im ONL (Stab Photorezeptoren) war das 5mC Signal in den Chromocenters der Zellkerne und nukleare Peripherie (Abbildungen 3a-3 c, 3 g). Das 5hmC-Signal wurde in der gesamten Zellkerne mit Ausnahme der Chromocenters (Figuren 3d-3f) gefunden. Die Transmissions-Elektronenmikroskopie getan auf P15 Netzhaut zeigt die Verteilung der heterochromatischen Domänen im Stab Zellkerne ähnlich wie mit 5mC Antikörper Signal (Abbildungen 3 h und 3i).
Die 5mC Färbung im INL und GCL war stark in der Chromocenters der Zellkerne und schwache Färbung wurde auch im ganzen Zellkerne (Zahlen 3j-3 l und 3r-3 t) beobachtet. Im Gegensatz zu 5mC wurde das 5hmC Signal an die ganze Zellkerne mit Ausnahme der Chromocenters in INL und GCL (Zahlen 3 m-3o und 3u-3w) lokalisiert. Wir beobachteten starken 5hmC Signal an der Peripherie der GCL Zellkerne.
In Erwachsenen Stab Photorezeptoren war das 5mC Signal auf die Chromocenter und nukleare Peripherie der Zellkerne (Abbildungen 4a-4 c) beschränkt, während 5hmc Signal an die nuklearen Peripherie (Abbildungen 4 d-4f) beschränkt war.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58274/58274fig1.jpg"> Abbildung 1. Lokalisierung von 5 Methylcytosine und 5-Hydroxymethylcytosine in Maus Netzhaut an embryonalen Tag 16. Immunostaining C57BL/6J Netzhaut mit Antikörpern gegen 5mC (rot (a) und 5hmC (grün, b). E16 ist 5mC Signal sehr stark in Chromocenters von den Zellkernen und auch in der gesamten Zellkerne auf deutlich niedrigerem Niveau vorhanden. 5hmC Färbung beschränkte sich ausschließlich auf die Zellkerne. Panel-c steht für zusammengeführte 5mC und 5hmC Bild. Kerne sind mit DAPI (blau, c) counterstained. Einsätze sind Vergrößerung des Bereichs mit Sternchen in den Bildern gezeigt. Maßstab: 5 µm. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/58274/58274fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58274/58274fig2.jpg"> Abbildung 2. Immunhistochemische Färbung des 5-Methylcytosine und 5-Hydroxymethylcytosine in Maus Netzhaut auf postnatale Tag 0. Immunolabeling der C57BL/6J Netzhaut mit Antikörpern gegen 5mC (rot (a) und 5hmC (grün, b). In P0 Netzhaut sind 5mC und 5hmC in äußeren Neuroblast Schicht (ONBL) und innere Neuroblast Schicht (INBL). (a) 5mC Signal ist stark in die Chromocenters (Pfeil) und nukleare Peripherie der Zellkerne (Pfeilspitze). Schwache Färbung des 5mC wird auch zwischen den Chromocenters von Zellkernen beobachtet. (b) 5hmC Färbung beschränkt sich auf den Zellkern und starkes Signal in INBL (gestrichelte Linie im Panel c) eingehalten wird. Panel-c steht für zusammengeführte 5mC und 5hmC Bild. Kerne sind mit DAPI (blau, c) counterstained. Einsätze sind Vergrößerung des Bereichs mit Sternchen in den Bildern gezeigt. Maßstab: 5 µm. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/58274/58274fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58274/58274fig3.jpg"> Abbildung 3. 5-Methylcytosine und 5-Hydroxymethylcytosine Verteilung in Maus Netzhaut postnatale Tag 15. Immunostaining C57BL/6J Netzhaut mit Anti-5mC und 5hmC Antikörper (a-g, j-y). In nuklearen Außenschicht (ONL) (Stab Photorezeptoren), 5mC Signal (rot, (a) in der Regel deckt sich mit den Chromocenters der Zellkerne (Pfeilspitze, b) und auch an die nuklearen Peripherie (Pfeil, b) lokalisiert. Gruppe b (rot) und c (grau) repräsentieren Vergrößerung des Bereichs mit Sternchen in der Abbildung gezeigt ein. Das 5hmC-Signal (grün, d) beschränkt sich auf die gesamte Zellkerne mit Ausnahme der Chromocenters. Gruppe e (grün) und f (grau) repräsentieren Vergrößerung des Bereichs gezeigt in Bild d. Panel mit Sternchen, g zusammengeführten 5mC und 5hmC Bild darstellt. Kerne sind mit DAPI counterstained. H und ich sind Übertragung elektronenmikroskopische Aufnahme der Photorezeptor Kerne postnatale 15.Tag zeigt Verteilung von heterochromatischen Domains. Schwarze Pfeilspitze im Panel h verweist auf einzelne Rute Photorezeptor Kern im Panel i. erweitert roten Pfeilspitzen im Bedienfeld ", die ich auf heterochromatischen Domänen innerhalb Stab Photorezeptor Kern verweisen, während rote Pfeile auf Heterochromatin in der nuklearen Peripherie. In INL (j-Q) und GCL Zellkerne (R-y) das 5mC-Signal (rot) ist auf der Chromocenters in der Peripherie vorhanden lokalisiert und schwache Färbung wird auch in den Rest der Zellkerne erkannt. Gruppe k (rot) und ich (grau) vertreten Vergrößerung des Bereichs in der Bild-j mit Sternchen angezeigt. Die 5hmC Färbung (grün) im INL und GCL Zellkerne beschränkt sich auf den gesamten Zellkern. Beachten Sie die starke 5hmC Färbung in der nuklearen Peripherie der GCL Zellen. Panel p und x stellen zusammengeführte 5mC und 5hmC Bild, während Panel Q und y Vergrößerung der Fläche mit Sternchen im Bild p und x bzw. darstellen. Kerne sind mit DAPI counterstained. Maßstab: 5 µm. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/58274/58274fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58274/58274fig4.jpg"> Abbildung 4. 5-Methylcytosine und 5-Hydroxymethylcytosine Distribution in Stab Photorezeptor Kernen C57BL/6J Maus Netzhaut bei postnatalen Tag 90. Die 5mC Färbung (rot, ein) ist in der Chromocenter der Zellkerne und auch schwach Gegenwart in der nuklearen Peripherie stark vertreten. Gruppe b (rot) und c (grau) repräsentieren Vergrößerung des Bereichs mit Sternchen in der Abbildung gezeigt ein. Die 5hmC Färbung (grün, d) beschränkt sich ausschließlich auf die nukleare Peripherie Panel e (grün) und f (grau) repräsentieren Vergrößerung des Bereichs gezeigt in Bild d. Panel mit Sternchen, g zusammengeführten 5mC und 5hmC Bild beim Panel h darstellt ist die Vergrößerung der Fläche mit Sternchen Sie in das Bild, das g. Kerne mit DAPI (blau) counterstained sind. Maßstab: 5 µm. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/58274/58274fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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Immunohistochemical Detection of 5-Methylcytosine and 5-Hydroxymethylcytosine in Developing and Postmitotic Mouse Retina

Immunhistochemische Nachweis von 5 Methylcytosine und 5-Hydroxymethylcytosine bei der Entwicklung und der postmitotischen Maus Retina

Das Ziel dieses Berichts ist es, das Protokoll für robuste immunhistochemischen Nachweis von epigenetischen Markierungen beschreiben, 5-Methylcytosine (5mC) und 5-Hydroxymethylcytosine (5hmC) bei der Entwicklung und postmitotischen Maus Netzhaut.

The epigenetics of retinal development is a well-studied research field, which promises to bring a new level of understanding about the mechanisms of a ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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Serie: Immunohistochemical Detection of 5-Methylcytosine and 5-Hydroxymethylcytosine in Developing and Postmitotic Mouse Retina

Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of enzymatic oxidation of 5mC to 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) and 5-carboxylcytosine (5caC) as well as detection of N6-methyladenine (6mA) in the DNA of multicellular organisms provided additional degrees of complexity to the epigenetic research. According to a growing body of experimental evidence, these novel DNA modifications may play specific roles in different cellular and developmental processes. Importantly, as some of these marks (e. g. 5hmC, 5fC and 5caC) exhibit tissue- and developmental stage-specific occurrence in vertebrates, immunochemistry represents an important tool allowing assessment of spatial distribution of DNA modifications in different biological contexts. Here the methods for computational analysis of DNA modifications visualized by immunostaining followed by confocal microscopy are described. Specifically, the generation of 2.5 dimension (2.5D) signal intensity plots, signal intensity profiles, quantification of staining intensity in multiple cells and determination of signal colocalization coefficients are shown. Collectively, these techniques may be operational in evaluating the levels and localization of these DNA modifications in the nucleus, contributing to elucidating their biological roles in metazoans.

Newly discovered oxidized forms of 5-methylcytosine (oxi-mCs), 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) and 5-carboxylcytosine (5caC) may represent distinct DNA modifications with unique functional roles. Here a semi-quantitative workflow for visualization of oxi-mCs' spatial distribution, signal intensity profiling and colocalization is described.

Immunostaining für DNA-Modifikationen: computergestützte Analyse der konfokalen Bilder

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of ...

Forschung

Genetik

High Sensitivity 5-hydroxymethylcytosine Detection in Balb/C Brain Tissue

DNA hydroxymethylation is a long known modification of DNA, but has recently become a focus in epigenetic research. Mammalian DNA is enzymatically modified at the 5th carbon position of cytosine (C) residues to 5-mC, predominately in the context of CpG dinucleotides. 5-mC is amenable to enzymatic oxidation to 5-hmC by the Tet family of enzymes, which are believed to be involved in development and disease. Currently, the biological role of 5-hmC is not fully understood, but is generating a lot of interest due to its potential as a biomarker. This is due to several groundbreaking studies identifying 5-hydroxymethylcytosine in mouse embryonic stem (ES) and neuronal cells. Research techniques, including bisulfite sequencing methods, are unable to easily distinguish between 5-mC and 5-hmC . A few protocols exist that can measure global amounts of 5-hydroxymethylcytosine in the genome, including liquid chromatography coupled with mass spectrometry analysis or thin layer chromatography of single nucleosides digested from genomic DNA. Antibodies that target 5-hydroxymethylcytosine also exist, which can be used for dot blot analysis, immunofluorescence, or precipitation of hydroxymethylated DNA, but these antibodies do not have single base resolution.In addition, resolution depends on the size of the immunoprecipitated DNA and for microarray experiments, depends on probe design. Since it is unknown exactly where 5-hydroxymethylcytosine exists in the genome or its role in epigenetic regulation, new techniques are required that can identify locus specific hydroxymethylation. The EpiMark 5-hmC and 5-mC Analysis Kit provides a solution for distinguishing between these two modifications at specific loci. The EpiMark 5-hmC and 5-mC Analysis Kit is a simple and robust method for the identification and quantitation of 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine within a specific DNA locus. This enzymatic approach utilizes the differential methylation sensitivity of the isoschizomers MspI and HpaII in a simple 3-step protocol. Genomic DNA of interest is treated with T4-BGT, adding a glucose moeity to 5-hydroxymethylcytosine. This reaction is sequence-independent, therefore all 5-hmC will be glucosylated; unmodified or 5-mC containing DNA will not be affected. This glucosylation is then followed by restriction endonuclease digestion. MspI and HpaII recognize the same sequence (CCGG) but are sensitive to different methylation states. HpaII cleaves only a completely unmodified site: any modification (5-mC, 5-hmC or 5-ghmC) at either cytosine blocks cleavage. MspI recognizes and cleaves 5-mC and 5-hmC, but not 5-ghmC. The third part of the protocol is interrogation of the locus by PCR. As little as 20 ng of input DNA can be used. Amplification of the experimental (glucosylated and digested) and control (mock glucosylated and digested) target DNA with primers flanking a CCGG site of interest (100-200 bp) is performed. If the CpG site contains 5-hydroxymethylcytosine, a band is detected after glucosylation and digestion, but not in the non-glucosylated control reaction. Real time PCR will give an approximation of how much hydroxymethylcytosine is in this particular site. In this experiment, we will analyze the 5-hydroxymethylcytosine amount in a mouse Babl/C brain sample by end point PCR.

The EpiMark 5-hmC and 5-mC Analysis Kit can be used to analyze and quantitate 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine within a spe cific locus. The kit distinguishes 5-mC from 5-hmC by the addition of glucose to the hydroxyl group of 5-hmC via an enzymatic reaction utilizing &beta;-glucosyltransferase (T4-BGT). When 5-hmC occurs In the context of CCGG, this modification converts a cleavable MspI site to a non-cleavable site.

Hohe Empfindlichkeit 5-Hydroxymethylcytosin Erkennung in Balb / C Gehirngewebe

DNA hydroxymethylation is a long known modification of DNA, but has recently become a focus in epigenetic research.   Mammalian DNA is enzymatically ...

Neurowissenschaften

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

Angiogenesis is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting of new blood vessels from a pre-existing vessel network. Angiogenesis plays a key role not only in normal development of organs and tissues, but also in many diseases in which blood vessel formation is dysregulated, such as cancer, blindness and ischemic diseases. In adult life, blood vessels are generally quiescent so angiogenesis is an important target for novel drug development to try and regulate new vessel formation specifically in disease. In order to better understand angiogenesis and to develop appropriate strategies to regulate it, models are required that accurately reflect the different biological steps that are involved. The mouse neonatal retina provides an excellent model of angiogenesis because arteries, veins and capillaries develop to form a vascular plexus during the first week after birth. This model also has the advantage of having a two-dimensional (2D) structure making analysis straightforward compared with the complex 3D anatomy of other vascular networks. By analyzing the retinal vascular plexus at different times after birth, it is possible to observe the various stages of angiogenesis under the microscope. This article demonstrates a straightforward procedure for analyzing the vasculature of a mouse retina using fluorescent staining with isolectin and vascular specific antibodies.

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

The neonatal murine retina provides a well characterized physiological model of angiogenesis, which permits investigations of the roles of different genes or drugs that modulate angiogenesis in an in vivo context. Immunofluorescent staining to accurately visualize the vascular plexus is pivotal to the success of these types of studies.

Ganze Berge Immunfluoreszenzfärbung der Neonatal Maus Retina zu untersuchen Angiogenese<em&gt; In vivo</em

Angiogenesis  is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting  of new blood vessels from a pre-existing vessel network. ...

Rapid and Efficient Spatiotemporal Monitoring of Normal and Aberrant Cytosine Methylation within Intact Zebrafish Embryos

Cytosine methylation is highly conserved across vertebrate species and, as a key driver of epigenetic programming and chromatin state, plays a critical role in early embryonic development. Enzymatic modifications drive active methylation and demethylation of cytosine into 5-methylcytosine (5-mC) and subsequent oxidation of 5-mC into 5-hydroxymethylcytosine, 5-formylcytosine, and 5-carboxylcytosine. Epigenetic reprogramming is a critical period during in utero development, and maternal exposure to chemicals has the potential to reprogram the epigenome within offspring. This can potentially cause adverse outcomes such as immediate phenotypic consequences, long-term effects on adult disease susceptibility, and transgenerational effects of inherited epigenetic marks. Although bisulfite-based sequencing enables investigators to interrogate cytosine methylation at base-pair resolution, sequencing-based approaches are cost-prohibitive and, as such, preclude the ability to monitor cytosine methylation across developmental stages, multiple concentrations per chemical, and replicate embryos per treatment. Due to the ease of automated in vivo imaging, genetic manipulations, rapid ex utero development time, and husbandry during embryogenesis, zebrafish embryos continue to be used as a physiologically intact model for uncovering xenobiotic-mediated pathways that contribute to adverse outcomes during early embryonic development. Therefore, using commercially available 5-mC-specific antibodies, we describe a cost-effective strategy for rapid and efficient spatiotemporal monitoring of cytosine methylation within individual, intact zebrafish embryos by leveraging whole-mount immunohistochemistry, automated high-content imaging, and efficient data processing using programming language prior to statistical analysis. To current knowledge, this method is the first to successfully detect and quantify 5-mC levels in situ within zebrafish embryos during early development. The method enables the detection of DNA methylation within the cell mass and also has the ability to detect cytosine methylation of yolk-localized maternal mRNAs during the maternal-to-zygotic transition. Overall, this method will be useful for the rapid identification of chemicals that have the potential to disrupt cytosine methylation in situ during epigenetic reprogramming.

This paper describes a protocol for the rapid and efficient spatiotemporal monitoring of normal and aberrant cytosine methylation within intact zebrafish embryos.

Schnelle und effiziente raumzeitliche Überwachung der normalen und aberranten Cytosinmethylierung in intakten Zebrafischembryonen

Cytosine methylation is highly conserved across vertebrate species and, as a key driver of epigenetic programming and chromatin state, plays a critical ...

Entwicklungsbiologie

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene expression, maintenance of genome integrity, parental imprinting, X-chromosome inactivation, regulation of development, aging, and cancer1. Recently, the presence of an oxidized 5-mC, 5-hydroxymethylcytosine (5-hmC), was discovered in mammalian cells, in particular in embryonic stem (ES) cells and neuronal cells2-4. 5-hmC is generated by oxidation of 5-mC catalyzed by TET family iron (II)/&alpha;-ketoglutarate-dependent dioxygenases2, 3. 5-hmC is proposed to be involved in the maintenance of embryonic stem (mES) cell, normal hematopoiesis and malignancies, and zygote development2, 5-10. To better understand the function of 5-hmC, a reliable and straightforward sequencing system is essential. Traditional bisulfite sequencing cannot distinguish 5-hmC from 5-mC11. To unravel the biology of 5-hmC, we have developed a highly efficient and selective chemical approach to label and capture 5-hmC, taking advantage of a bacteriophage enzyme that adds a glucose moiety to 5-hmC specifically12.
Here we describe a straightforward two-step procedure for selective chemical labeling of 5-hmC. In the first labeling step, 5-hmC in genomic DNA is labeled with a 6-azide-glucose catalyzed by &beta;-GT, a glucosyltransferase from T4 bacteriophage, in a way that transfers the 6-azide-glucose to 5-hmC from the modified cofactor, UDP-6-N3-Glc (6-N3UDPG). In the second step, biotinylation, a disulfide biotin linker is attached to the azide group by click chemistry. Both steps are highly specific and efficient, leading to complete labeling regardless of the abundance of 5-hmC in genomic regions and giving extremely low background. Following biotinylation of 5-hmC, the 5-hmC-containing DNA fragments are then selectively captured using streptavidin beads in a density-independent manner. The resulting 5-hmC-enriched DNA fragments could be used for downstream analyses, including next-generation sequencing.
Our selective labeling and capture protocol confers high sensitivity, applicable to any source of genomic DNA with variable/diverse 5-hmC abundances. Although the main purpose of this protocol is its downstream application (i.e., next-generation sequencing to map out the 5-hmC distribution in genome), it is compatible with single-molecule, real-time SMRT (DNA) sequencing, which is capable of delivering single-base resolution sequencing of 5-hmC.

Described is a two-step labeling process using &beta;-glucosyltransferase (&beta;-GT) to transfer an azide-glucose to 5-hmC, followed by click chemistry to transfer a biotin linker for easy and density-independent enrichment. This efficient and specific labeling method enables enrichment of 5-hmC with extremely low background and high-throughput epigenomic mapping via next-generation sequencing.

Selektive Aufnahme von 5-Hydroxymethylcytosin aus genomischer DNA

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...

Biologie

Preparation of Mouse Retinal Cryo-sections for Immunohistochemistry

Preparation of high-quality mouse eye sections for immunohistochemistry (IHC) is critical for assessing the retinal structure and function and for determining the mechanisms underlying retinal diseases. Maintaining structural integrity throughout the tissue preparation is vital for obtaining reproducible retinal IHC data but can be challenging due to the fragility and complexity of retinal cytoarchitecture. Strong fixatives like 10% formalin or Bouin's solution optimally preserve the retinal structure, they often impede IHC analysis by enhancing the background fluorescence and/or diminishing antibody-epitope interactions, a process known as epitope masking. Milder fixatives, on the other hand, like 4% paraformaldehyde, reduces background fluorescence and epitope-masking, meticulous dissection techniques must be utilized to preserve the retinal structure. In this article, we present a comprehensive method to prepare mouse ocular posterior cups for IHC that is sufficient to preserve most antibody-epitope interactions without loss of retinal structural integrity. We include representative IHC with antibodies to various retinal cell type markers to illustrate tissue preservation and orientation under optimal and sub-optimal conditions. Our goal is to optimize IHC studies of the retina by providing a complete protocol from ocular posterior cup dissection to IHC.

This report describes comprehensive methods for preparing frozen mouse retina sections for immunohistochemistry (IHC). Methods described include dissection of the ocular posterior cup, paraformaldehyde fixation, embedding in Optimal Cutting Temperature (OCT) media and tissue orientation, sectioning and immunostaining.

Vorbereitung von Maus-Retinal-Cryo-Sektionen für die Immunhistochemie

Preparation of high-quality mouse eye sections for immunohistochemistry (IHC) is critical for assessing the retinal structure and function and for ...

The Detection of 5-Hydroxymethylcytosine in Neural Stem Cells and Brains of Mice

Multiple&#160;DNA modifications have been identified in the mammalian genome. Of that, 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic mechanisms have been intensively studied. 5-hydroxymethylcytosine displays dynamic features during embryonic and postnatal development of the brain, plays a regulatory function in gene expression, and is involved in multiple neurological disorders. Here, we describe the detailed methods including immunofluorescence staining and&#160;DNA dot-blot to detect 5-hydroxymethylcytosine in cultured cells and brain tissues of mouse.

Here, we present a protocol to detect 5-hydroxymethylcytosine in cells and brain tissues, utilizing immunofluorescence staining and DNA dot-blot methods.

Der Nachweis von 5-Hydroxymethylcytosin in neuralen Stammzellen und Gehirnen von Mäusen

Multiple&#160;DNA modifications have been identified in the mammalian genome. Of that, 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic ...

Isolierung der Netzhaut von Mäusen und Methanolbehandlung zur Untersuchung von retinalen Ganglienzellen

Methanol-Based Whole-Mount Preparation for the Investigation of Retinal Ganglion Cells

Retinal ganglion cells (RGCs), which are the projection neurons of the retina, propagate external visual information to the brain. Pathological changes in RGCs have a close relationship with numerous retinal degenerative diseases. Whole-mount retinal immunostaining is frequently used in experimental studies on RGCs to evaluate the developmental and pathological conditions of the retina. Under some circumstances, some valuable retina samples, such as those from transgenic mice, may need to be retained for a long period without affecting the morphology or number of RGCs. For credible and reproducible experimental results, using an effective preserving medium is essential. Here, we describe the effect of methanol as an auxiliary fixed medium for retinal whole-mount preparations and long-term storage. In brief, during the isolation process, cold methanol (&#8722;20 &#176;C) is pipetted onto the surface of the retina to help fix the tissues and facilitate their permeability, and then the retinas can be stored in cold methanol (&#8722;20 &#176;C) before being immunostained. This protocol describes the retina isolation workflow and tissue sample storage protocol, which is useful and practical for the investigation of RGCs.

Autor im Rampenlicht: Methanol-basiertes Whole-Mount-Präparat für die Untersuchung von retinalen Ganglienzellen  

Methanol can be used as an auxiliary fixed medium for retinal whole-mount preparations and long-term storage, which is useful for the investigation of retinal ganglion cells.

Methanol-basiertes Whole-Mount-Präparat zur Untersuchung retinaler Ganglienzellen

Retinal ganglion cells (RGCs), which are the projection neurons of the retina, propagate external visual information to the brain. Pathological changes in ...

Immunhistochemische Nachweis von 5 Methylcytosine und 5-Hydroxymethylcytosine bei der Entwicklung und der postmitotischen Maus Retina

Zusammenfassung

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Immunostaining für DNA-Modifikationen: computergestützte Analyse der konfokalen Bilder

Hohe Empfindlichkeit 5-Hydroxymethylcytosin Erkennung in Balb / C Gehirngewebe

Ganze Berge Immunfluoreszenzfärbung der Neonatal Maus Retina zu untersuchen Angiogenese

Schnelle und effiziente raumzeitliche Überwachung der normalen und aberranten Cytosinmethylierung in intakten Zebrafischembryonen

Selektive Aufnahme von 5-Hydroxymethylcytosin aus genomischer DNA

Vorbereitung von Maus-Retinal-Cryo-Sektionen für die Immunhistochemie

Der Nachweis von 5-Hydroxymethylcytosin in neuralen Stammzellen und Gehirnen von Mäusen

Methanol-basiertes Whole-Mount-Präparat zur Untersuchung retinaler Ganglienzellen

Methanol-basiertes Whole-Mount-Präparat zur Untersuchung retinaler Ganglienzellen

Methanol-basiertes Whole-Mount-Präparat zur Untersuchung retinaler Ganglienzellen