עבודה זו נתמכה על ידי מענק SBIR (1R44EY027654-01A1).

כל ההליכים עם עכברים בוצעו על פי פרוטוקולים שאושרו על-ידי החולים אוקלנד המכון לחקר בעלי חיים טיפול ושימוש הוועדה של הילדים, דבקה האגודה למחקר בהצהרת חזון, רפואת עיניים (ארוו) לשימוש חיות אופטלמולוגיות ועל חזון המחקר.
1. רקמות הכנה Immunostaining
<ol><li>המתת חסד C57 BL/6J עכברים ביום עובריים (E) 16, יום לאחר הלידה (P) 0, P15 ו P90 על ידי פחמן דו חמצני (CO2) ואחריו עריפת ראש (עכברים E16, P0).</li>
	<li>עכבר מיד enucleate העיניים ניקב עם המחט 29G 1/2 בצד הגבי של העין. תקופת דגירה של 5 דקות (דקות) ב 1 מ"ל של 4% paraformaldehyde (PFA) בבאגירה פוספט תמיסת מלח (1 x PBS) pH 8.0 בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>כדי להפוך את העין כוסות מן P0, P15 P90, שווייץ קרנית, עדשה עם מספריים אופטלמולוגיות בסדר בעוד העיניים % 4 מחברים. הערה: לדלג על שלב זה עבור העיניים E16 עיניו הם קטנים מדי.</li>
	<li>לתקן את כוסות העין (P0, P15 P90), כל העיניים (E16) ב 4% מחברים עבור 20 דקות בטמפרטורת החדר. ואז לשטוף את העין כוסות, עיניו כל פעמיים ב 1 מ"ל של PBS 1 x 10 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>Cryoprotect העין כוסות, כל העיניים ב 1xPBS, pH 8.0 המכיל 10% סוכרוז למשך שעה. לשמור על 20% סוכרוז ב- PBS 1 x 1 שעה וירווה ואז ב- 30% סוכרוז ב- PBS 1 x לילה ב 4 º C.</li>
	<li>למחרת, להטביע את הכוסות עיניים והעיניים כל אופטימלית טמפרטורה תרכובת חיתוך (אוקטובר), (500 µL) ב cryomolds snap-הקפאת באמבט קרח יבש/אתנול, לאחסן ב- 80 ° c</li>
	<li>להסיר את התבניות עם העין מוטבע כוסות ועיניים כל-80 ° C, מאפשרים equilibrate ל-20 ° C עבור שעה אחת לפני cryosectioning.</li>
	<li>לחתוך חתכי רוחב ברשתית (בעובי 12 מיקרומטר) במקביל לציר temporonasal דרך ראש עצב הראייה באמצעות cryostat ב-20 ° C.</li>
	<li>הר מקטעי רשתית על שקופיות מיקרוסקופ53 וחנות ב-80 מעלות צלזיוס.</li>
</ol>2. Immunostaining עם נוגדנים 5-mC, 5-hmC
<ol><li>להקיף את המקטעים ברשתית רכוב על שקופיות עם עט הידרופובי המכשול. העט הידרופובי המכשול מפחיתה את עוצמת הקול של נוגדן הנדרש כדי להכתים את הרקמה.</li>
	<li>לשטוף את המקטעים ברשתית פעם אחת עם 200 µL 1 x PBS למשך 10 דקות.</li>
	<li>Permeabilize הסעיפים ברשתית עם 200 µL של 0.1% טריטון X-100 ב 1 x PBS (PBS-T) למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>Denature מקטעי רשתית למשך 30 דקות עם 200 µL של טריות חומצת מלח (HCl) N 2 ב 1 x PBS ב חממה 37 ° C. הערה: טיטור זהיר של HCl טיפול נחוץ כדי למטב את האות 5mC.</li>
	<li>תמיד כוללים ביולוגי משכפל (3-4) תוך אופטימיזציה 5mC אות54. הערה: עשינו אנטיגן אחזור ב- 4 נקודות זמן (15 דקות, 30 דקות, 1 h ו- 2 h), והוא נמצא 30 דקות הדגירה אופטימלי איתות 5mC. זמן הדגירה עם HCl השתנה המבנה של גרעינים שמוביל לחוסר יכולת לבצע לוקליזציה אות 5mC את הגרעין.</li>
	<li>לאחר דנטורציה, לנטרל סעיפים רשתית על-ידי הוספת µL 100 של 0.1 M טריס-HCl (pH 8.3) על הרשתית מקטעים עבור 10 דקות.</li>
	<li>דגירה בסעיפים 500 µL של חסימת פתרון (5% סרום preimmune עז רגילה ב- 0.1% טריטון X-100 ב 1 x PBS) לשעה בטמפרטורת החדר בתוך תא לחות.</li>
	<li>לאחר חסימת, להוסיף אנטי-5mC; נוגדנים אנטי-5hmC מדולל שבערך בחסימה לפתרון הסעיפים ברשתית.</li>
	<li>דגירה רשתית מקטעים לילה ב 4 מעלות צלזיוס בתא לחות.</li>
	<li>כביסה היום הבא, מקטעי רשתית 3 פעמים (10-15 דקות כל פעם) עם 0.1% PBS-T ואז דגירה בחסימה פתרון עם נוגדנים משניים המתאים (אנטי-ארנב עז, עז העכבר אנטי אג, מדולל; 1:1000), המכיל דאפי (4', 6 - diamidino-2-phenylindole) פתרון (1 µg/mL) בטמפרטורת החדר במשך 1 h בחסימה פתרון. הערה: למנוע ייבוש סעיפים בכל שלבי immunodetection.</li>
	<li>לשטוף את השקופיות בפעם השלישית עם 1 מ"ל של 0.1% ל- PBS-טי</li>
	<li>לאחר השטיפה האחרונה הר הסעיפים מימית הרכבה בינונית תחת coverslip, לאטום עם לק שקוף.</li>
</ol>3. אימונוהיסטוכימיה קונאפוקלית
<ol><li>אוריינט הסעיפים יש את הצד אפיתל הפיגמנט ברשתית של גביע אופטיים פונה תמיד דרך אחת (למשל, למעלה), עקביות.</li>
	<li>לבצע לכידת התמונה סעיפים immunostained רשתית-63 X (הגדלה של עדשת המטרה) עם 2 X או 3 X זום.</li>
	<li>ליצור מספר מקטעים אופטי של כל תמונה שנבחרה (z-ערימות) כל 3 ערוצים (אדום, ירוק וכחול, RGB) באמצעות 0.35 שלב מיקרומטר. הערה: ההגדלה הסופי של הדגימה דמיינו ב- 10-20 X (הגדלה של עדשת המטרה) תהיה 63 X, בהתאמה, כאשר בשילוב עם 10 (בדרך כלל בשימוש) X העדשה הפנימית. דמיינו מחסנית אופטית דחוס כדי לאתר את האות 5mC ו- 5hmC</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

מתילציה DNA hydroxymethylation דינמי והפיך DNA השינויים אשר modulatethe מגוון רחב של מנגנונים ביולוגיים מתפתחת גם כמו תאים postmitotic בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. כאן, אנו מתארים שיטה לשחזור לגילוי 5mC ו- 5hmC DNA השינויים בחיי עיר בטכניקת immunohistochemical (באמצעות נוגדנים anti-5mC ו- anti-5hmC) בסעיפים paraformaldehyde-קבוע קפוא של העכבר הרשתית, ולספק הנחיות ולשיפור המתקנות את התוצאות, במיוחד בעת השוואת מספר פרטים שונים. אנחנו קודם לכן השתמשו בשיטה זו על 5mC שינויים ברשתית עכבר עם הרשתית ספציפיים פילוח של Dnmt1, Dnmt3a , Dnmt3b DNA methyltransferase גנים, ודיווח דלדול (הצפויה) של סימני 5mC שלהם קרועות7 .
השלב הקריטי בזיהוי immunohistochemical 5mC הוא אופטימיזציה של טיפול סעיפים היסטולוגית עם HCl: פחות מ 15 דקות רעלני לא צפוי לייצר תוצאות לשחזור, ואילו טיפול מופרז עם HCl הורס את הגרעין ארכיטקטורה. מצאנו את התוצאה הטובה ביותר לאחר דגירה 30 דקות עם HCl. מומלץ תמיד להשתמש HCl טרי מדולל והפתרון PFA טרי 4% עבור קיבוע דנטורציה DNA רקמת רשתית.
כדי לפתור את התוצאות, אנו ממליצים לכלול שלושה או ארבעה ביולוגי משכפל תוך אופטימיזציה 5mC אות. בעוד כל אדם סט של נוגדן עשויה ליצור תוצאות שונות במקצת (אזורים heterochromatic בהיר יותר או פחות), אשר צפויה immunohistochemical בשיטה, 5mC, 5hmC הפצה גרעינית בתוך ערכת בודדים סעיפים צפוי להיות מאוד לשחזור, עבור כל עוד מופיע בפרוטוקול.
טכניקה זו יש גם הגבלה בעקביות הבחנו השתנות בחלוקה 5mC ב גרעינים תא קולט אור בתוך אותו סעיף. . מצאנו כמה גרעינים הראה אות חזק 5mC תוך גרעין התא הסמוך הראה שום אות 5mC... זאת בשל הגבלה ב גם ההומניסטית והאוטונומית אנטיגן 5mC על ידי טיפול HCl בסעיפים קפוא.
המשמעות של טכניקה זו מאפשרת 5mC לוקליזציה ללא טיפול K DNase ו proteinase מובילים יותר לשימור chromocenters. טכניקה זו הוא צפוי לעבוד robustly על כל קטעי כל רקמות בעלי חוליות, 5mC נשיאה, סימני 5hmC, מעובד עם גישה דומה, לא רק העכבר הרשתית, עבור כל עוד מופיע בפרוטוקול.

Epigenetic רגולציה של פיתוח, postmitotic הומאוסטזיס של רשתית העכבר הוא אזור מרתק של מחקר, אילו הבטחות להביא הבנה של מנגנונים ביולוגיים שליטה retinogenesis ותא גורל נחישות, תאים ייחודיים לסוג פונקציה מטבולית וכן תא פתולוגיות, מוות של תאים, התחדשות1,2,3,4,5,6,7,8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. כרומטין עובר שינויים דינמיים בשלבי פיתוח, כמו גם בתגובה אותות חיצוניים משתנה בין אם זה הלחץ, מטבולית או בתא המוות גירויים6,14,15, 16 , 17 , 18. ב העכבר גרעינים, כרומטין מחולק euchromatin פעיל והטרוכרומטין לא פעיל6,19,20. בגרעין לאטמוספרה, euchromatin שוכן באזור הפנימי של הגרעין ואילו הטרוכרומטין קווים את הפריפריה הגרעין ואת גרעינון. דפוס זה נקרא קונבנציונאלי והוא מאוד כולו ב פרוקריוטים. לעומת זאת, רוד גרעינים בעלי חיים ליליים כגון עכבר או חולדה יש הפוך דפוס שבו הגרעין מאוכלס על ידי הטרוכרומטין במרכז מוקף euchromatin ויוצרים את המעטפת החיצונית ביותר6,18, 20. בלידה, רוד גרעינים יש אדריכלות גרעיני קונבנציונלי. היפוך של רוד הגרעינים מתרחשת במהלך הפיתוח על ידי שיפוץ לאדריכלות גרעיני קונבנציונלי. במהלך תהליך זה, הטרוכרומטין היקפיים מפריד בין הפריפריה גרעינית, chromocenters להינתך יחד לצורה chromocenter יחיד במרכז של גרעין6,18.
מתילציה DNA גנומי משתתפת שליטה מקומיים כרומטין קונפורמציה21. מתילציה DNA מתרחשת במיקום 5' של ציטוזין שאריות של CpG dinucleotides כי הם מועשרים באזור המקדם של גנים רבים העכבר הגנום22,23,24,25,26 כמו גם intergenic ואזורים אינטרון, הנושאות אלמנטים תקינה27. מתילציה של CpG איים ב21,הפרוקסימלית היזמים24 וחלבונים CpG ג'ין משפרי27,28 חשוב בוויסות המצב הדינאמי של כרומטין טרינארית, המכיל רבים גורמים התפתחותיים גנים/תמלול משחקת תפקיד חשוב בתחום הפיתוח, סרטן להזדקנות29,30,31,32,33,34 . דנ א שלושה methyltransferases (DNMTs) להשתתף מתילציה DNA במהלך פיתוח העכבר35. כל שלושת DNMTs באים לידי ביטוי במהלך פיתוח רשתית העכבר36 , שינויים הספציפיים רשתית ב Dnmt גנים השפעת התפתחות הרשתית2,7. Hydroxymethylcytosine (5hmC) הוא מוצר חמצוני של demethylation 5-methylcytosine (5mC). השלושה עשר-11 טרנסלוקציה (ט) אנזימים להשתתף3938,37,demethylation 5mC. Hydroxymethyl-C השינוי מועשר בתמציות היזמים, וגופי ג'ין intergenic רצף גנומית בתוך ג'ין עשיר, אזורים באופן פעיל משועתקים27,40.
יש מגוון של גישות שתואר בקביעת דפוסי מתילציה DNA שינוי של תאים41,42,43,44,45,46, חלקם הפעלת לכימות שינויים כלליים של מתילציה DNA בעוד שאחרים התמקדות מדויק שינויים באזורים עשירים CpG בתוך היזמים, מוצרי טיפוח טבעיים. שיטות זיהוי, כימות של 5hmC היו גם דווח על47, לרבות על ידי אימונוהיסטוכימיה13. Immunohistochemical טכניקות, אשר מאפשרים ניטור חזקים של שינויים 5mC ו- 5hmC הגרעינים של פיתוח תאים postmitotic, הם מאוד אינפורמטיבי עבור בהתוויית כרומטין dynamics בחיי עיר בתגובה לשינויים חיצוני או פנימי להשפיע על48,4913,4,תאים. עם זאת, גישה זו היא נוטה ממעיט מתילציה DNA ושינויים hydroxymethylation עקב קשיים טכניים, הקשורים בזיהוי שינויים ציטוזין בהכנות היסטולוגית. זה בגלל ה-DNA פולרי בסיסים, כולל 5mC ו- 5hmC-השתנה ציטוזין, מוסתרים בתוך המרכז של סליל ה-DNA גדילי כפול50, וזקוקים חשיפת פרצופו האמיתי. . זה מאתגר במיוחד קפוא ההכנות היסטולוגית, אשר עלול לאבד במהירות ארגון מקיף של הרקמה המקורית כאשר היחס הקשה מוחל.
הרשתית העכבר הוא מודל מצוינת לנתח את התרומה של מתילציה DNA התפתחות עצבית, הומאוסטזיס postmitotic. יש רק 6 סוגים של נוירונים (photoreceptors רוד, קונוס, אמקרין, תאים דו-קוטביים, אופקי וגנגליון), תא גליה אחד (מולר עכשיו, דונלד) וסוג אחד neuroepithelial תא סוג (אפיתל הפיגמנט ברשתית)51. סוגי תאים ברשתית דווחו יש דפוסים ברורים של ה-DNA מתילציה18,19, אשר לאחרונה נחקרה על בסיס יחיד רזולוציה1,5,9,12. לאחרונה דיווחנו ליישום אימונוהיסטוכימיה בהתוויית 5mC דפוס של הפצה בתוך גרעין של תאים ברשתית ושינויים הגרעינים של רשתית העכבר למבוגרים, איפה כל שלושת ה-DNA methyltransferases הוסרו על ידי מיקוד מותנה 7. לעומת מספר דוחות, בו הנוכחות של מתילציה DNA של תאים ברשתית יכולה להיחשב רק חיובי או שלילי האות hypermethylated תאי העובר אפופטוזיס, הגישה שלנו זמין גילוי כרומטין ספציפי סידור בתוך האטומים התא רשתית, אשר אנו, מספר קבוצות דיווח קודם5,6,7,18,19,36 , 52. כאן, אנו מתארים את הטכניקה immunohistochemical (IHC) של גילוי 5mC ו- 5hmC בסעיפים קפוא paraformaldehyde-קבוע היסטולוגית הפרטים כמו גם להדגים את הנתונים, אשר היינו יכולים להתרבות מהדוח המקורי שלנו7 .

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Supplies&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>29G1/2 ULTRA-FINE</td><td>BD Biosciences</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>Ophthalmic scissor</td><td>Fine Science tools, Inc.&amp;nbsp;</td><td>15000-03</td><td></td></tr><tr><td>PAP pen</td><td>RPICORP.com</td><td>195505</td><td></td></tr><tr><td>Microslide Superfrost plus</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Reagent&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Electron Microscope Science</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek Optical cutting compound (OCT)</td><td>VWR</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Triton X 100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>6 N HCl</td><td>VWR analytical&amp;nbsp;</td><td>BDH7204-1</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl pH 8.3</td><td>Teknova</td><td>T1083</td><td></td></tr><tr><td>Goat serum</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>005-000-121</td><td></td></tr><tr><td>5mC</td><td>Genway Biotech&amp;nbsp;</td><td>GWB-BD5190</td><td></td></tr><tr><td>5hmC</td><td>Active Motif</td><td>39791</td><td></td></tr><tr><td>LaminB1</td><td>Abcam</td><td>Ab16048</td><td></td></tr><tr><td>Cy2 AffiniPure Goat Ant-Rabbit IgG</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>111-225-1444</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 AffiniPure Goat Ant-Mouse IgG</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>115-585-166</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold Antifade medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MICRM HM 550</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>388114</td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

immunohistochemical detection of 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine in developing and postmitotic mouse retina

אפיגנטיקה של התפתחות הרשתית הוא שדה מחקר למד היטב, אשר מבטיח מביא רמה חדשה של הבנה לגבי המנגנונים של מגוון מחלות ניוון רשתית האדם והצבע גישות טיפול חדשות. הארכיטקטורה הגרעין של רשתית העכבר מאורגן שני דפוסים שונים: הפוך קונבנציונאלי. דפוס קונבנציונלי הוא אוניברסלי שבו הטרוכרומטין הוא מקומי לפריפריה של הגרעין, בעוד euchromatin פעיל שוכנת על הפנים גרעיני. לעומת זאת, הפוך דפוס גרעיני הוא ייחודי רוד למבוגרים קולט אור התא האטום שבו הטרוכרומטין. רגישה למרכז הגרעין, euchromatin מתגורר באזורי הפריפריה גרעינית. מתילציה DNA נצפית בעיקר ב- chromocenters. מתילציה DNA הוא שינוי דינמי קוולנטיות על משקעי ציטוזין (5-methylcytosine, 5mC) של CpG dinucleotides כי הם מועשרים באזורים המקדם של גנים רבים. שלושה methyltransferases DNA (DNMT1, DNMT3A ו- DNMT3B) להשתתף מתילציה של הדנ א במהלך הפיתוח. גילוי 5mC עם טכניקות immunohistochemical הוא מאוד מאתגר, תורם השתנות בתוצאות, כמו כל DNA בסיסים כולל בסיסים 5mC ששינה ומוסתרים בתוך סליל הדנ א גדילי כפול. אולם, תיחום מפורט של התפלגות 5mC במהלך הפיתוח היא מאוד אינפורמטיבי. כאן, אנו מתארים שיטה לשחזור לגילוי immunohistochemical חזקה של 5mC ושל עוד epigenetic DNA סמן 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), אשר colocalizes עם כרומטין 'פתח', transcriptionally פעיל בפיתוח, רשתית העכבר postmitotic.

כדי לקבוע את ההתפלגות של 5-methylcytosine (5mC) ו- 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) במהלך התפתחות הרשתית, ברשתית postmitotic, אנו immunostained C57BL/6J העכבר ברשתית סעיף E16, P0, P15, P90 עם נוגדנים ספציפיים 5mC, 5hmC.
-E16 ההכתמה 5mC הייתה חזקה ב- chromocenters של גרעינים תא בזמן צביעת חלש נצפתה ב גרעינים התא כולו (איור 1 א'). ההכתמה 5hmC היה מרותק גרעינים תא והיה נעדר מן chromocenters (איור 1b).
ברשתית P0, האות 5mC מקומי את chromocenters של גרעין התא, הגרעין לפריפריה (איור 2a, החצים, חץ). גם הבחנו מכתים חלש של 5mC בין chromocenters של גרעינים התא. האות 5hmC היה מאוד נוכח גרעינים תא חוץ chromocenters (איור 2b). . מצאנו שעוד גרעינים מוכתמים 5mC ו- 5hmC בשכבה הפנימית neuroblast (INBL) (c איור 2, קו מנוקד)
ברשתית P15, מצאנו מכתים חזק של 5mC ושל 5hmC השכבה החיצונית גרעינית (גרת), השכבה הפנימית גרעינית (להיכנס), שכבת תאים גנגליון (שזכתה) (איור 3). גרת (רוד photoreceptors), האות 5mC היה נוכח chromocenters של גרעין התא, הגרעין לפריפריה (דמויות 3a-3 c, 3 g). האות 5hmC נמצאה גרעינים התא כולו למעט chromocenters (דמויות 3d-3f). במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים על הרשתית P15 מציגה את התפלגות של תחומים heterochromatic רוד תא גרעינים דומה לזה נמצא עם האות נוגדן 5mC (דמויות 3 h ו- 3עכשיו).
ההכתמה 5mC להיכנס, שזכתה היה. חזק chromocenters של גרעינים תא, צביעת חלש נצפתה גם בתוך גרעין התא כולו (דמויות 3j-3 l ו- 3r-3t). בניגוד 5mC, האות 5hmC מקומי גרעינים התא כולו למעט chromocenters להיכנס, שזכתה (דמויות 3 מ'-3o ו 3 בגודל 3u-ואט). הבחנו חזקה 5hmC אות על הפריפריה של גרעין התא שזכתה.
ב- photoreceptors רוד למבוגרים, האות 5mC היה מוגבל chromocenter ואת הגרעין לפריפריה של גרעינים תא (דמויות 4a-4 c), ואילו 5hmc האות היה מרותק הפריפריה גרעינית (4 דמויות d-4f).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58274/58274fig1.jpg"> איור 1. לוקליזציה של 5-methylcytosine ו- 5-hydroxymethylcytosine ברשתית העכבר מתחלקים היום 16. Immunostaining של C57BL/6J הרשתית עם נוגדנים 5mC (אדום, a) ו- 5hmC (ירוק, b). -E16, 5mC אות היא מאוד חזקה ב- chromocenters של גרעינים תא גם נוכח גרעינים התא כולו ברמה נמוכה יותר. 5hmC מכתים היה באופן בלעדי מוגבלת את גרעין התא. לוח c מייצג 5mC הממוזג ותמונה 5hmC. הגרעינים הם counterstained עם דאפי (כחול, ג). כניסות מייצגים ההגדלה של האזור המוצג עם כוכבית של תמונות. סרגל קנה מידה: 5 מיקרומטר. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/58274/58274fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58274/58274fig2.jpg"> באיור 2. נוגדן של 5-methylcytosine, 5-hydroxymethylcytosine ברשתית העכבר ביום כמחנכת 0. Immunolabeling של C57BL/6J הרשתית עם נוגדנים 5mC (אדום, a) ו- 5hmC (ירוק, b). ברשתית P0, 5mC ו 5hmC נוכחים השכבה החיצונית neuroblast (ONBL) והן השכבה הפנימית neuroblast (INBL). a) האות 5mC קיים בחריפות chromocenters (חץ) ואת הגרעין לפריפריה של גרעינים תא (חץ). צביעת חלש של 5mC הוא ציין גם בין chromocenters של גרעין התא. b) 5hmC מכתים מוחזק בתוך גרעין התא, אות חזק נצפית ב- INBL (קו מנוקד לוח ג'). לוח c מייצג 5mC הממוזג ותמונה 5hmC. הגרעינים הם counterstained עם דאפי (כחול, ג). כניסות מייצגים ההגדלה של האזור המוצג עם כוכבית של תמונות. סרגל קנה מידה: 5 מיקרומטר. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/58274/58274fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58274/58274fig3.jpg"> איור 3. 5-methylcytosine 5-hydroxymethylcytosine והפצה ברשתית העכבר ב 15 יום לאחר הלידה. Immunostaining של C57BL/6J הרשתית עם נוגדנים anti-5mC ו- 5hmC (-g, j-y). בשכבה החיצונית גרעינית (גרת) (רוד photoreceptors), האות 5mC (א) בדרך כלל עולה בקנה אחד עם chromocenters של גרעינים תא (ראש חץ, b), אדום, רגישה גם לפריפריה גרעינית (חץ, b). פאנל b (אדום) ו- c (אפור) מייצג את ההגדלה של האזור המוצג עם כוכבית בתמונה. האות 5hmC (ירוק, d) מוגבל גרעינים התא כולו למעט chromocenters. לוח אלקטרוני (ירוק), f (אפור) מייצגים ההגדלה של האזור המוצג עם כוכבית קולטים תמונת לוח g מייצגת 5mC הממוזג ותמונה 5hmC. הגרעינים הם counterstained עם דאפי. לוח h ואני הם שידור תמונת מיקרוסקופ אלקטרונים של גרעינים קולט אור-כמחנכת היום 15 בסה כ מציג בחתך תחומים heterochromatic. ראש חץ שחור ב- h לוח מצביע על מוט יחיד קולט אור גרעין בלוח ט ראשי חץ אדום בחלונית שלב לתחומים heterochromatic בתוך מוט קולט אור גרעין בעוד חצים אדומים להצביע הטרוכרומטין בפריפריה גרעינית. להיכנס (j-q), שזכתה תא גרעינים (r-y), האות 5mC (אדום) הוא מקומי כדי chromocenters ההווה בפריפריה, צביעת חלש הוא זוהה גם בשאר חלקי האטום התא. לוח k (אדום) ואני (אפור) מייצגים ההגדלה של האזור המוצג עם כוכבית בתקופה של התמונה. 5hmC ההכתמה (ירוק) בתוך גרעין התא להיכנס, שזכתה מוגבל גרעין התא כולו. שימו לב חזק 5hmC מכתים בפריפריה גרעיני תאי שזכתה. לוח p ו- x מייצגים 5mC הממוזג, 5hmC התמונה בעוד לוח q ו- y מייצגים ההגדלה של האזור המוצג עם כוכבית תמונה p, x בהתאמה. הגרעינים הם counterstained עם דאפי. סרגל קנה מידה: 5 מיקרומטר. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/58274/58274fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58274/58274fig4.jpg"> באיור 4. 5-methylcytosine 5-hydroxymethylcytosine והפצה של רוד קולט אור גרעינים של רשתית העכבר C57BL/6J ביום כמחנכת 90. ההכתמה 5mC (אדום,) בחריפות נוכח chromocenter של גרעין התא, גם המתנה חלש באזורי הפריפריה גרעינית. פאנל b (אדום) ו- c (אפור) מייצג את ההגדלה של האזור המוצג עם כוכבית בתמונה. 5hmC ההכתמה (ירוק, d) באופן בלעדי מוגבל על e לוח הגרעין לפריפריה (ירוק), f (אפור) מייצגים ההגדלה של האזור המוצג עם כוכבית קולטים תמונת לוח g מייצג 5mC הממוזגים 5hmC תמונה תוך לוח h הוא הגדלה של האזור המוצג עם כוכבית בתמונה שג גרעינים הם counterstained עם דאפי (כחול). סרגל קנה מידה: 5 מיקרומטר. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/58274/58274fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Immunohistochemical Detection of 5-Methylcytosine and 5-Hydroxymethylcytosine in Developing and Postmitotic Mouse Retina at JoVE.com

Immunohistochemical Detection of 5-Methylcytosine and 5-Hydroxymethylcytosine in Developing and Postmitotic Mouse Retina

Immunohistochemical זיהוי של 5-Methylcytosine, 5-Hydroxymethylcytosine בפיתוח ואת הרשתית העכבר Postmitotic

מטרת הדו ח היא לתאר את הפרוטוקול לגילוי immunohistochemical חזקה של סמני epigenetic, 5-methylcytosine (5mC) ו- 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) בפיתוח, postmitotic העכבר הרשתית.

The epigenetics of retinal development is a well-studied research field, which promises to bring a new level of understanding about the mechanisms of a ...

immunohistochemical-detection-5-methylcytosine-5

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.9K Views.  BioTime, Inc. מטרת הדו ח היא לתאר את הפרוטוקול לגילוי immunohistochemical חזקה של סמני epigenetic, 5-methylcytosine (5mC) ו- 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) בפיתוח, postmitotic העכבר הרשתית.

Video: Immunohistochemical Detection of 5-Methylcytosine and 5-Hydroxymethylcytosine in Developing and Postmitotic Mouse Retina

Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of enzymatic oxidation of 5mC to 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) and 5-carboxylcytosine (5caC) as well as detection of N6-methyladenine (6mA) in the DNA of multicellular organisms provided additional degrees of complexity to the epigenetic research. According to a growing body of experimental evidence, these novel DNA modifications may play specific roles in different cellular and developmental processes. Importantly, as some of these marks (e. g. 5hmC, 5fC and 5caC) exhibit tissue- and developmental stage-specific occurrence in vertebrates, immunochemistry represents an important tool allowing assessment of spatial distribution of DNA modifications in different biological contexts. Here the methods for computational analysis of DNA modifications visualized by immunostaining followed by confocal microscopy are described. Specifically, the generation of 2.5 dimension (2.5D) signal intensity plots, signal intensity profiles, quantification of staining intensity in multiple cells and determination of signal colocalization coefficients are shown. Collectively, these techniques may be operational in evaluating the levels and localization of these DNA modifications in the nucleus, contributing to elucidating their biological roles in metazoans.

Newly discovered oxidized forms of 5-methylcytosine (oxi-mCs), 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) and 5-carboxylcytosine (5caC) may represent distinct DNA modifications with unique functional roles. Here a semi-quantitative workflow for visualization of oxi-mCs' spatial distribution, signal intensity profiling and colocalization is described.

Immunostaining עבור שינויים DNA: ניתוח חישובית של תמונות קונפוקלי

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of ...

Genetics

High Sensitivity 5-hydroxymethylcytosine Detection in Balb/C Brain Tissue

DNA hydroxymethylation is a long known modification of DNA, but has recently become a focus in epigenetic research. Mammalian DNA is enzymatically modified at the 5th carbon position of cytosine (C) residues to 5-mC, predominately in the context of CpG dinucleotides. 5-mC is amenable to enzymatic oxidation to 5-hmC by the Tet family of enzymes, which are believed to be involved in development and disease. Currently, the biological role of 5-hmC is not fully understood, but is generating a lot of interest due to its potential as a biomarker. This is due to several groundbreaking studies identifying 5-hydroxymethylcytosine in mouse embryonic stem (ES) and neuronal cells. Research techniques, including bisulfite sequencing methods, are unable to easily distinguish between 5-mC and 5-hmC . A few protocols exist that can measure global amounts of 5-hydroxymethylcytosine in the genome, including liquid chromatography coupled with mass spectrometry analysis or thin layer chromatography of single nucleosides digested from genomic DNA. Antibodies that target 5-hydroxymethylcytosine also exist, which can be used for dot blot analysis, immunofluorescence, or precipitation of hydroxymethylated DNA, but these antibodies do not have single base resolution.In addition, resolution depends on the size of the immunoprecipitated DNA and for microarray experiments, depends on probe design. Since it is unknown exactly where 5-hydroxymethylcytosine exists in the genome or its role in epigenetic regulation, new techniques are required that can identify locus specific hydroxymethylation. The EpiMark 5-hmC and 5-mC Analysis Kit provides a solution for distinguishing between these two modifications at specific loci. The EpiMark 5-hmC and 5-mC Analysis Kit is a simple and robust method for the identification and quantitation of 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine within a specific DNA locus. This enzymatic approach utilizes the differential methylation sensitivity of the isoschizomers MspI and HpaII in a simple 3-step protocol. Genomic DNA of interest is treated with T4-BGT, adding a glucose moeity to 5-hydroxymethylcytosine. This reaction is sequence-independent, therefore all 5-hmC will be glucosylated; unmodified or 5-mC containing DNA will not be affected. This glucosylation is then followed by restriction endonuclease digestion. MspI and HpaII recognize the same sequence (CCGG) but are sensitive to different methylation states. HpaII cleaves only a completely unmodified site: any modification (5-mC, 5-hmC or 5-ghmC) at either cytosine blocks cleavage. MspI recognizes and cleaves 5-mC and 5-hmC, but not 5-ghmC. The third part of the protocol is interrogation of the locus by PCR. As little as 20 ng of input DNA can be used. Amplification of the experimental (glucosylated and digested) and control (mock glucosylated and digested) target DNA with primers flanking a CCGG site of interest (100-200 bp) is performed. If the CpG site contains 5-hydroxymethylcytosine, a band is detected after glucosylation and digestion, but not in the non-glucosylated control reaction. Real time PCR will give an approximation of how much hydroxymethylcytosine is in this particular site. In this experiment, we will analyze the 5-hydroxymethylcytosine amount in a mouse Babl/C brain sample by end point PCR.

The EpiMark 5-hmC and 5-mC Analysis Kit can be used to analyze and quantitate 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine within a spe cific locus. The kit distinguishes 5-mC from 5-hmC by the addition of glucose to the hydroxyl group of 5-hmC via an enzymatic reaction utilizing &beta;-glucosyltransferase (T4-BGT). When 5-hmC occurs In the context of CCGG, this modification converts a cleavable MspI site to a non-cleavable site.

רגישות גבוהה 5-hydroxymethylcytosine איתור ברקמה Balb / C המוח

DNA hydroxymethylation is a long known modification of DNA, but has recently become a focus in epigenetic research.   Mammalian DNA is enzymatically ...

Neuroscience

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

Angiogenesis is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting of new blood vessels from a pre-existing vessel network. Angiogenesis plays a key role not only in normal development of organs and tissues, but also in many diseases in which blood vessel formation is dysregulated, such as cancer, blindness and ischemic diseases. In adult life, blood vessels are generally quiescent so angiogenesis is an important target for novel drug development to try and regulate new vessel formation specifically in disease. In order to better understand angiogenesis and to develop appropriate strategies to regulate it, models are required that accurately reflect the different biological steps that are involved. The mouse neonatal retina provides an excellent model of angiogenesis because arteries, veins and capillaries develop to form a vascular plexus during the first week after birth. This model also has the advantage of having a two-dimensional (2D) structure making analysis straightforward compared with the complex 3D anatomy of other vascular networks. By analyzing the retinal vascular plexus at different times after birth, it is possible to observe the various stages of angiogenesis under the microscope. This article demonstrates a straightforward procedure for analyzing the vasculature of a mouse retina using fluorescent staining with isolectin and vascular specific antibodies.

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

The neonatal murine retina provides a well characterized physiological model of angiogenesis, which permits investigations of the roles of different genes or drugs that modulate angiogenesis in an in vivo context. Immunofluorescent staining to accurately visualize the vascular plexus is pivotal to the success of these types of studies.

מכתים Immunofluorescent הר שלם של רשתית עכבר ילודים לחקר אנגיוגנזה<em&gt; בvivo</em

Angiogenesis  is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting  of new blood vessels from a pre-existing vessel network. ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the developing cerebral cortex, abnormal mitosis of neural progenitors can cause defects in brain size and function. Hence, there is a critical need for tools to understand the mechanisms of neural progenitor mitosis. Cortical development in rodents is an outstanding model for studying this process. Neural progenitor mitosis is commonly examined in fixed brain sections. This protocol will describe in detail an approach for live imaging of mitosis in ex vivo embryonic brain slices. We will describe the critical steps for this procedure, which include: brain extraction, brain embedding, vibratome sectioning of brain slices, staining and culturing of slices, and time-lapse imaging. We will then demonstrate and describe in detail how to perform post-acquisition analysis of mitosis. We include representative results from this assay using the vital dye Syto11, transgenic mice (histone H2B-EGFP and centrin-EGFP), and in utero electroporation (mCherry-&#945;-tubulin). We will discuss how this procedure can be best optimized and how it can be modified for study of genetic regulation of mitosis. Live imaging of mitosis in brain slices is a flexible approach to assess the impact of age, anatomy, and genetic perturbation in a controlled environment, and to generate a large amount of data with high temporal and spatial resolution. Hence this protocol will complement existing tools for analysis of neural progenitor mitosis.

Neural progenitor mitosis is a critical parameter of neurogenesis. Much of our understanding of neural progenitor mitosis is based on analysis of fixed tissue. Live imaging in embryonic brain slices is a versatile technique to assess mitosis with high temporal and spatial resolution in a controlled environment.

הדמיה חיה של מיטוזה בCortex עכבר עוברי פיתוח

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Rapid and Efficient Spatiotemporal Monitoring of Normal and Aberrant Cytosine Methylation within Intact Zebrafish Embryos

Cytosine methylation is highly conserved across vertebrate species and, as a key driver of epigenetic programming and chromatin state, plays a critical role in early embryonic development. Enzymatic modifications drive active methylation and demethylation of cytosine into 5-methylcytosine (5-mC) and subsequent oxidation of 5-mC into 5-hydroxymethylcytosine, 5-formylcytosine, and 5-carboxylcytosine. Epigenetic reprogramming is a critical period during in utero development, and maternal exposure to chemicals has the potential to reprogram the epigenome within offspring. This can potentially cause adverse outcomes such as immediate phenotypic consequences, long-term effects on adult disease susceptibility, and transgenerational effects of inherited epigenetic marks. Although bisulfite-based sequencing enables investigators to interrogate cytosine methylation at base-pair resolution, sequencing-based approaches are cost-prohibitive and, as such, preclude the ability to monitor cytosine methylation across developmental stages, multiple concentrations per chemical, and replicate embryos per treatment. Due to the ease of automated in vivo imaging, genetic manipulations, rapid ex utero development time, and husbandry during embryogenesis, zebrafish embryos continue to be used as a physiologically intact model for uncovering xenobiotic-mediated pathways that contribute to adverse outcomes during early embryonic development. Therefore, using commercially available 5-mC-specific antibodies, we describe a cost-effective strategy for rapid and efficient spatiotemporal monitoring of cytosine methylation within individual, intact zebrafish embryos by leveraging whole-mount immunohistochemistry, automated high-content imaging, and efficient data processing using programming language prior to statistical analysis. To current knowledge, this method is the first to successfully detect and quantify 5-mC levels in situ within zebrafish embryos during early development. The method enables the detection of DNA methylation within the cell mass and also has the ability to detect cytosine methylation of yolk-localized maternal mRNAs during the maternal-to-zygotic transition. Overall, this method will be useful for the rapid identification of chemicals that have the potential to disrupt cytosine methylation in situ during epigenetic reprogramming.

This paper describes a protocol for the rapid and efficient spatiotemporal monitoring of normal and aberrant cytosine methylation within intact zebrafish embryos.

ניטור מרחבי-טמפורלי מהיר ויעיל של מתילציה תקינה וחריגה של ציטוזין בתוך עוברים שלמים של דגי זברה

Cytosine methylation is highly conserved across vertebrate species and, as a key driver of epigenetic programming and chromatin state, plays a critical ...

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene expression, maintenance of genome integrity, parental imprinting, X-chromosome inactivation, regulation of development, aging, and cancer1. Recently, the presence of an oxidized 5-mC, 5-hydroxymethylcytosine (5-hmC), was discovered in mammalian cells, in particular in embryonic stem (ES) cells and neuronal cells2-4. 5-hmC is generated by oxidation of 5-mC catalyzed by TET family iron (II)/&alpha;-ketoglutarate-dependent dioxygenases2, 3. 5-hmC is proposed to be involved in the maintenance of embryonic stem (mES) cell, normal hematopoiesis and malignancies, and zygote development2, 5-10. To better understand the function of 5-hmC, a reliable and straightforward sequencing system is essential. Traditional bisulfite sequencing cannot distinguish 5-hmC from 5-mC11. To unravel the biology of 5-hmC, we have developed a highly efficient and selective chemical approach to label and capture 5-hmC, taking advantage of a bacteriophage enzyme that adds a glucose moiety to 5-hmC specifically12.
Here we describe a straightforward two-step procedure for selective chemical labeling of 5-hmC. In the first labeling step, 5-hmC in genomic DNA is labeled with a 6-azide-glucose catalyzed by &beta;-GT, a glucosyltransferase from T4 bacteriophage, in a way that transfers the 6-azide-glucose to 5-hmC from the modified cofactor, UDP-6-N3-Glc (6-N3UDPG). In the second step, biotinylation, a disulfide biotin linker is attached to the azide group by click chemistry. Both steps are highly specific and efficient, leading to complete labeling regardless of the abundance of 5-hmC in genomic regions and giving extremely low background. Following biotinylation of 5-hmC, the 5-hmC-containing DNA fragments are then selectively captured using streptavidin beads in a density-independent manner. The resulting 5-hmC-enriched DNA fragments could be used for downstream analyses, including next-generation sequencing.
Our selective labeling and capture protocol confers high sensitivity, applicable to any source of genomic DNA with variable/diverse 5-hmC abundances. Although the main purpose of this protocol is its downstream application (i.e., next-generation sequencing to map out the 5-hmC distribution in genome), it is compatible with single-molecule, real-time SMRT (DNA) sequencing, which is capable of delivering single-base resolution sequencing of 5-hmC.

Described is a two-step labeling process using &beta;-glucosyltransferase (&beta;-GT) to transfer an azide-glucose to 5-hmC, followed by click chemistry to transfer a biotin linker for easy and density-independent enrichment. This efficient and specific labeling method enables enrichment of 5-hmC with extremely low background and high-throughput epigenomic mapping via next-generation sequencing.

לכידה סלקטיבית של 5-hydroxymethylcytosine מהדנ&quot;א הגנומי

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...

Biology

The Detection of 5-Hydroxymethylcytosine in Neural Stem Cells and Brains of Mice

Multiple&#160;DNA modifications have been identified in the mammalian genome. Of that, 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic mechanisms have been intensively studied. 5-hydroxymethylcytosine displays dynamic features during embryonic and postnatal development of the brain, plays a regulatory function in gene expression, and is involved in multiple neurological disorders. Here, we describe the detailed methods including immunofluorescence staining and&#160;DNA dot-blot to detect 5-hydroxymethylcytosine in cultured cells and brain tissues of mouse.

Here, we present a protocol to detect 5-hydroxymethylcytosine in cells and brain tissues, utilizing immunofluorescence staining and DNA dot-blot methods.

זיהוי של 5-הידרוגרד מתילציטוסין בתאי גזע עצביים ומוחות של עכברים

Multiple&#160;DNA modifications have been identified in the mammalian genome. Of that, 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic ...

Detection of Modified Forms of Cytosine Using Sensitive Immunohistochemistry

Methylation of cytosine bases (5-methylcytosine, 5mC) occurring in vertebrate genomes is usually associated with transcriptional silencing. 5-hydroxylmethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC), and 5-carboxylcytosine (5caC) are the recently discovered modified cytosine bases produced by enzymatic oxidation of 5mC, whose biological functions remain relatively obscure. A number of approaches ranging from biochemical to antibody based techniques have been employed to study the genomic distribution and global content of these modifications in various biological systems. Although some of these approaches can be useful for quantitative assessment of these modified forms of 5mC, most of these methods do not provide any spatial information regarding the distribution of these DNA modifications in different cell types, required for correct understanding of their functional roles. Here we present a highly sensitive method for immunochemical detection of the modified forms of cytosine. This method permits co-detection of these epigenetic marks with protein lineage markers and can be employed to study their nuclear localization, thus, contributing to deciphering their potential biological roles in different experimental contexts.

Herein we describe a sensitive immunochemical method for mapping the spatial distribution of 5mC oxidation derivatives based on the use of peroxidase-conjugated secondary antibodies and tyramide signal amplification.

איתור של טפסים השתנו ציטוזין שימוש אימונוהיסטוכימיה רגיש

Methylation of cytosine bases (5-methylcytosine, 5mC) occurring in vertebrate genomes is usually associated with transcriptional silencing. ...

Cryosectioning and Immunostaining of Mouse Retina

Tissue sectioning and immunohistochemistry are essential techniques in histological and pathological studies of retinal diseases using animal models. These methods enable detailed examinations of tissue morphologies and the localization of specific proteins within the tissue, which provide valuable insights into disease processes and mechanisms. Mice are the most widely used model for this purpose. However, because mouse eyeballs are small and mouse retinas are extremely delicate tissues, obtaining high-quality retinal sections and immunostaining images from mouse eyeballs is typically challenging. This study describes an improved protocol for cryosectioning mouse retinas and performing immunohistochemistry. An essential point of this protocol involves coating the eyeball with a layer of super glue, which prevents deformation of the eyeballs during the processes of cornea removal, lens extraction, and embedding. This step ensures the integrity of retinal morphologies is well preserved. This protocol highlights critical technical considerations and optimization strategies for consistently producing high-quality retinal sections and achieving excellent immunostaining results.

A protocol for preparing mouse retinal cryosections and performing immunostaining on photoreceptors is described. This article enables researchers to consistently produce mouse retinal frozen sections with well-preserved morphology and high-quality immunostaining results.

הקפאה וצביעה חיסונית של רשתית העכבר

Tissue sectioning and immunohistochemistry are essential techniques in histological and pathological studies of retinal diseases using animal models. ...

5-Methylcytosine Dot Blot to Determine the Extent of DNA Methylation

Start this procedure by denaturing the isolated DNA in 0.1 molar sodium hydroxide for 10 minutes at 95 degrees Celsius. Neutralize the DNA with 1 molar ammonium acetate on ice, and then dilute two-fold with double-distilled water.
The most critical step in the dot blot is the spotting of the samples onto the membrane, do it slowly, and carefully. Try to minimize each spotted area to 3 to 4 millimeters in diameter.
Using a narrow-mouth pipette tip, carefully spot 2 microliters of the serial diluted genomic DNA onto a positively-charged nylon membrane at the center of the grid. Blot the membrane at 80 degrees Celsius for 30 minutes. Next, block the non-specific antibody binding sites by soaking the membrane in 5% BSA in TBST in a 10-centimeter Petri dish for 1 hour at room temperature with gentle shaking.
After 1 hour, wash the membrane three times in TBST for 5 minutes each time. Incubate the membrane with a mouse anti-5-methylcytosine monoclonal antibody in TBST at 4 degrees Celsius overnight. On the following day, wash the membrane three times in TBST for 5 minutes each time.
Then, incubate with a secondary antibody &#8212; horseradish peroxidase-conjugated sheep anti-mouse immunoglobulin G in TBST for one hour at room temperature. After washing the membrane in TBST as before, add the enzyme substrate to the membrane, and incubate for 5 to 10 minutes. Finally, visualize the secondary antibody signal using a chemiluminescence kit according to the manufacturer&#39;s instructions.

Immunohistochemical זיהוי של 5-Methylcytosine, 5-Hydroxymethylcytosine בפיתוח ואת הרשתית העכבר Postmitotic

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video