この作品が支持された SBIR 補助金 (1R44EY027654 01A1)。

子供の病院オークランド研究所動物ケア委員会によって承認され、の使用のためのビジョンと眼科 (ARVO) ステートメントで研究会に付着しプロトコルに従ってマウスとすべてのプロシージャを行った眼の動物の研究のビジョン。
1. 組織免疫染色に備えて
<ol><li>日 (E) 16、生後 (P) C57 BL/6 j マウスを安楽死させる 0、P15 と二酸化炭素 (CO2) 斬首 (E16 と P0 マウス) に続いて、P90。</li>
	<li>すぐに摘出マウスの目は目の背側 29 1/2 針で穴を開けます。4% パラホルムアルデヒド (PFA) の 1 つの mL で 5 分 (分) リン酸緩衝生理食塩水 (1 x PBS) pH 8.0 室温で孵化させなさい。</li>
	<li>P0、P15、P90 から目のカップに、角膜を分析し、上質眼科用ハサミでレンズの目が 4 %pfa。 注: スキップ E16 目目としてのこのステップが小さすぎます。</li>
	<li>4% の目のカップ (P0、P15、P90) と全体の目 (E16) 修正 PFA 室温で 20 分間。1 mL の 1x PBS 室温で 10 分間に二度目のカップと全体の目を洗います。</li>
	<li>Cryoprotect 目カップし、全体 1xPBS、pH 8.0 含む 10% ショ糖 1 時間目します。20% のショ糖 1 × PBS で 1 時間を維持し、一晩 4 ° C で 1 × PBS で 30% ショ糖で飽和し、</li>
	<li>次の日、目のカップや全体の目に最適な切削温度の化合物 (OCT) (500 μ L) cryomolds 埋め込む、スナップ-凍結ドライアイス/エタノールのお風呂で、-80 ° C で保存</li>
	<li>-80 ° C から埋め込まれた目のカップと全体の目で金型を削除、セクショニングの前に 1 時間-20 ° C に釣り合うように。</li>
	<li>-20 ° C でクライオスタットを用いた視神経乳頭を通じて temporonasal 軸に平行な網膜断面 (厚み 12 μ m) をカットします。</li>
	<li>網膜のセクションを顕微鏡スライド53と-80 ° C でストアのマウントします。</li>
</ol>2. 5 mC および 5 hmC の抗体で免疫染色
<ol><li>疎水性障壁のペンを使ってスライドに取付けた網膜のセクションを取り囲みます。疎水性障壁のペンには、組織を染色するために必要な抗体量が軽減されます。</li>
	<li>10 分の 1 × PBS の 200 μ L で一度網膜のセクションを洗います。</li>
	<li>0.1% の 200 μ L で網膜のセクションを permeabilize 1 × PBS (PBS-T) 室温で 10 分間でトリトン X-100。</li>
	<li>37 ° C の定温器の 1x PBS で 2 N 塩酸 (HCl) をたて 200 μ L と 30 分のための網膜のセクションを変化させなさい。 注: 塩酸処理の注意の滴定は、5mC 信号を最適化するために必要です。</li>
	<li>5mC 信号54を最適化しながら生物学的複製 (3-4) が常にあります。 注: 4 時点 (15 分、30 分、1 h、2 h) で抗原検索を行った、発見の 30 分インキュベーション 5mC 信号に最適です。HCl の長い孵化できない核に 5mC 信号をローカライズするに至る核の構造が低下します。</li>
	<li>変性後、0.1 100 μ L を追加することによって網膜のセクションを中和する 10 分の網膜の部分に M トリス-HCl (pH 8.3)。</li>
	<li>解決を妨げるの 500 μ L のセクションを孵化させなさい (0.1% の 5% 効果をもたなかったヤギ血清 1x PBS でトリトン X-100) 室温湿度の室内で 1 時間。</li>
	<li>ブロック後、追加対策-5mC;抗 5hmC 抗体は、網膜部分に解決を妨げるの 1: 500 希釈。</li>
	<li>網膜のセクションが 4 ° c 湿度チャンバーで一晩インキュベートします。</li>
	<li>次の日洗濯、網膜のセクション 3 度 (10-15 分毎回) 0.1% PBS T に対応する二次抗体の解決を妨げる、孵化させなさい、(ヤギ抗うさぎとヤギ抗マウス igg 抗体, 希釈; 1: 1000)、DAPI (4', 6-を含むdiamidino-2-phenylindole) ソリューション ソリューションをブロックで 1 時間室温 (1 μ g/mL)。 注: は、バイオアセッテイの段階ですべてのセクションの乾燥を避けるため。</li>
	<li>1 ml の 0.1% の 3 つの時間スライドを洗う PBS.</li>
	<li>最後の洗浄後、coverslip の下で水土台媒体セクションをマウントし、無色透明のマニキュアで封印します。</li>
</ol>3. 共免疫組織化学
<ol><li>一貫性を保つのため (例えばを)、1 つの方法に常に直面している眼杯の網膜色素上皮側にセクションに合わせます。</li>
	<li>3 X ズームまたは immunostained 網膜にあるセクションの 63 倍 (対物レンズの倍率) 2 X とイメージ キャプチャを実行します。</li>
	<li>選択した各画像の複数の光学セクションを生成 (z-スタック) すべての 3 つのチャネル (赤、緑、青、RGB) に 0.35 μ m のステップを使用して。 注: 10 20 X で可視化試験片の最終倍率 (対物レンズの倍率) 63 X、それぞれされます、(通常使用する) 10 X 接眼レンズと組み合わせる。 5mC と 5hmC の信号を検索する圧縮された光学スタックを視覚化します。</li>
</ol>

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DNA メチル化と hydroxymethylation は、動的かつ可逆的 DNA 変更、後細胞と同様に、同様に開発の生物学的メカニズムの modulatethe 多様な範囲です。ここでは、マウス網膜のパラホルムアルデヒド固定凍結切片における免疫組織化学的手法 (抗 5mC, 抗 5hmC 抗体を使用) で 5mC と 5hmC DNA の変更その場で検出するため再現性のある手法について述べる提供改善し、いくつかの異なる標本を比較するときに特に、結果を標準化するためのガイドライン。我々 は以前網膜固有のターゲットでDnmt1、 Dnmt3aとDnmt3b DNA メチル基転移酵素遺伝子のマウス網膜における 5mC の変化を記述するこのメソッドを使用し、網膜7 の 5mC マークの (予想される) の枯渇を報告.
5mC 免疫組織化学的検出の重要なステップは、HCl で組織学的セクションの処理の最適化: HCl で過剰な治療は核破壊するのに対し、再現性のある結果に 15 分前処理は見込まれないよりも少ないアーキテクチャです。塩酸で 30 分インキュベート後最高の結果がわかった。DNA 変性および網膜組織固定用たて希釈 HCl、たて 4 %pfa ソリューションを常に使用するをお勧めします。
結果をトラブルシューティングするには、3 〜 4 5mC 信号を最適化しながら生物の複製を含めることお勧めします。個々 の設定中免疫組織化学染色が若干異なる結果を生成 (もっとまたはより少なく明るいヘテロクロマチン領域)、個々 のセット内で免疫組織化学的方法、5mC、5hmC 核分布の予想されます。セクションのプロトコルが続いている限り、非常に再現する予定です。
我々 は一貫して同じセクション内の光受容体細胞核の 5mC 分布の変動を観察するとこの手法も制限があります。隣接する細胞核は 5mC 信号を示した強い 5mC 信号を示したいくつかの核を発見しました。これは凍結切片における塩酸処理によるマスキング 5mC 抗原の検出の制限のためです。
この手法の重要性 chromocenters のより良い保全につながる DNase、プロテイナーゼ K 処理なし 5mC のローカライズが可能です。このテクニックは、脊椎動物の動物組織、運ぶ 5mC 5hmC マークから任意のセクションに確実に動作するように期待は、プロトコルが続く限りのマウス網膜だけでなく、同様の方法で処理します。

開発のエピジェネティック制御とマウス網膜の後の恒常性は、研究、retinogenesis と細胞の運命決定制御する生物学的メカニズムの新しい理解をもたらす約束する携帯型固有のエキサイティングな分野代謝機能と同様、細胞病理学、細胞死と再生1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13クロマチン開発だけでなく、変数の外部信号への応答のダイナミックな変化を経るは、ストレス、代謝や細胞死の刺激6,14,15, 。16,17,18. マウス核クロマチンがアクティブ ユークロマチンと非アクティブなヘテロクロマチン6,,1920に分割されています。間期核異質染色質線核周囲と核小体に対しユークロマチンは核の内部の地域で存在します。このパターンは従来と呼ばれる、真核生物で保存性が高い。対照的に、マウスやラットなど夜行性動物にロッド核が核がヘテロクロマチン ユークロマチン外側シェル6,18の形成に囲まれた中心部で占められているパターンを反転します。 20。出生時、ロッド核従来原子力建築があります。ロッド核の反転は、従来の核構造の改造によって開発中に発生します。この過程で、周辺ヘテロクロマチンを核の周辺部から分離、核6,18の形で、中心の単一の chromocenter に chromocenters が融合。
ゲノム DNA のメチル化は、ローカルのクロマチン構造21を制御するに参加しています。5' の位置に濃縮されている CpG ジヌクレオチドのチトジンの残余のマウスのゲノム22,23,24,25,26で多くの遺伝子のプロモーター領域 DNA のメチル化が発生します間だけでなく、規制要素27を運ぶイントロン領域。近位プロモーター21,24の CpG の島と遺伝子エンハンサー27,28の CpG 配列のメチル化は多くを含む二価のクロマチンの動態の調節に重要です発達の遺伝子/転写因子の開発、がん、老化29,30,31,32,33,34で重要な役割を果たして.3 DNA メチル基転移酵素 (種) は、マウス開発35中に DNA のメチル化に参加します。すべての 3 つの種はマウス網膜発生36とDnmt遺伝子影響を与える網膜開発2,7の網膜特異的変化の中に表されます。ヒドロキシメチルシトシン (5hmC) は、5-メチルシトシン (5mC) メチルの酸化の製品です。3 10 11 転流 (テト) 酵素 5mC 脱メチル化37,38,39に参加します。ヒドロキシメチル C 変更は、プロモーター、遺伝子体間ゲノム遺伝子リッチと活発に転写される領域27,40内で濃縮されています。
様々 な細胞41,42,43,44,45,46で変化する DNA メチル化のパターンを決定するため記述されているアプローチは、それらのいくつかを有効にします。他のプロモーターやエンハンサー内の CpG の豊富な領域の正確な変化に焦点を当てながら DNA のメチル化のグローバルな変更を定量化します。検知・ 5hmC の定量化法のまた報告された47, 免疫組織化学13を含む.免疫組織化学的技術は、堅牢な開発の核における 5mC と 5hmC の変更の監視を有効にして後細胞がクロマチン動態その場の外部または内部の変化に対応した線で囲むため非常に有益セル4,13,48,49に影響を与えます。ただし、この方法は、DNA のメチル化と組織学的準備のシトシンの変更の検出に関連する技術的な問題のための hydroxymethylation 変化を過小評価しがちです。これは、非極性の DNA の基礎、5mC など 5hmC 変更シトシン、二本鎖 DNA ヘリックス50のセンター内で隠されているし、マスキングが必要があります。これは特に過酷な治療が適用されるときは、元の組織の有益な組織を失う可能性があります急速に冷凍の組織学的準備に挑戦。
マウス網膜は神経系の発達と後恒常性する DNA のメチル化の貢献を分析する優れたモデルです。6 種類のニューロンがのみ (桿体と錐体光受容細胞、アマクリン細胞、双極、水平および神経節の細胞)、タイプ 1 つのグリア細胞 (グリア ・ ミュラー)、1 つの上皮細胞内の細胞型 (網膜色素上皮)51。網膜細胞の種類は、DNA メチル化18,19, 最近単一ベース解像度1,5,9,12時勉強してきたの明確なパターンがあると報告されました。我々 は最近、網膜細胞とすべて 3 DNA メチル基転移酵素が条件付きターゲットによって削除された成体マウス網膜の核の変化の核内での分布の 5mC パターンを区切るために免疫組織化学アプリケーションを報告7. 検出特定クロマチンを有効に我々 のアプローチ、網膜細胞の DNA メチル化の有無は陽性としてだけ見なすことができるまたは病勢の負の信号細胞アポトーシスを受ける、レポートの数と比較して私たちといくつかのグループ報告し、前述の網膜細胞核内配置5,6,7,18,19,36,52ですここでは、私たちの元のレポート7 から再現することができました、のデータを示すと同様詳細冷凍パラホルムアルデヒド固定標本で 5mC と 5hmC を検出する免疫組織化学 (IHC) 手法について述べる。.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Supplies&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>29G1/2 ULTRA-FINE</td><td>BD Biosciences</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>Ophthalmic scissor</td><td>Fine Science tools, Inc.&amp;nbsp;</td><td>15000-03</td><td></td></tr><tr><td>PAP pen</td><td>RPICORP.com</td><td>195505</td><td></td></tr><tr><td>Microslide Superfrost plus</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Reagent&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Electron Microscope Science</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek Optical cutting compound (OCT)</td><td>VWR</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Triton X 100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>6 N HCl</td><td>VWR analytical&amp;nbsp;</td><td>BDH7204-1</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl pH 8.3</td><td>Teknova</td><td>T1083</td><td></td></tr><tr><td>Goat serum</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>005-000-121</td><td></td></tr><tr><td>5mC</td><td>Genway Biotech&amp;nbsp;</td><td>GWB-BD5190</td><td></td></tr><tr><td>5hmC</td><td>Active Motif</td><td>39791</td><td></td></tr><tr><td>LaminB1</td><td>Abcam</td><td>Ab16048</td><td></td></tr><tr><td>Cy2 AffiniPure Goat Ant-Rabbit IgG</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>111-225-1444</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 AffiniPure Goat Ant-Mouse IgG</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>115-585-166</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold Antifade medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MICRM HM 550</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>388114</td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

immunohistochemical detection of 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine in developing and postmitotic mouse retina

網膜の開発のエピジェネティクス研究は、人間の網膜変性疾患の様々 なメカニズムについての理解の新しいレベルをもたらす、新しい処置のアプローチを特定することを約束よく研究分野です。マウス網膜の核のアーキテクチャは 2 つの異なるパターンで組織される: 従来と逆。従来のパターンはユニバーサル アクティブ ユークロマチンは核の内部に存在するとき、核の周囲に異質染色質はローカライズです。対照的に、反転の核パターンは大人棒光受容体細胞核原子力センターに局在する異質染色質、核の周辺部に存在するエピジェネティックに固有です。DNA のメチル化は、chromocenters で主に観察されます。DNA のメチル化は、多くの遺伝子のプロモーター領域で濃縮され CpG ジヌクレオチドのチトジンの残余 (5-メチルシトシン, 5mC) の動的共有結合修飾です。3 DNA メチル基転移酵素 (DNMT1、DNMT3A と DNMT3B) は、開発中に DNA のメチル化に参加します。免疫組織化学的手法で検出 5mC は、非常にチャレンジングな二本鎖 DNA の螺旋形内で非表示に変更 5mC 基地を含むすべての DNA 塩基として、結果の可変性への貢献です。ただし、開発中の 5mC 分布の詳細な描写は非常に有益ではありません。ここでは、5mC と別エピジェネティックな DNA マーカー 5-ヒドロキシメチルシトシン (5hmC) の開発に「オープン」、転写活性状態のクロマチンと colocalizes が強力な免疫組織化学的検出のため再現性のある手法について述べると後マウス網膜。

後の網膜、網膜発生における 5-メチルシトシン (5mC)、(5hmC) の 5-ヒドロキシメチルシトシンの分布を決定する我々 immunostained c57bl/6 j マウス網膜セクション E16、P0、P15、P90 から特異抗体を 5mC と 5hmC に。
全体の細胞核 (図 1 a) で認められた弱い染色しながら E16 で 5mC 染色細胞核の chromocenters に強いあった。5hmC 染色は細胞核に限られ、欠席したから chromocenters (図 1 b)。
P0 網膜における 5mC 信号は細胞の核や核周囲 (図 2 a矢印、矢印) の chromocenters にローカライズされました。また、細胞核の chromocenters 間 5mC の弱い染色を見ました。5hmC 信号 chromocenters (図 2 b) を除いて細胞核に強く存在していた。5mC と内側神経層 (INBL) (図 2 c点線) の 5hmC より多くの核が染色がわかった
P15 網膜 5mC と核外層 (ONL)、内部の核層 (INL)、神経節細胞層 (GCL) (図 3) で 5hmC の強い染色を発見しました。ONL (杆) の 5mC の信号細胞核と核周辺 (図 3 a-3 c、3 g) の chromocenters に存在していた。5hmC 信号は、chromocenters (数字 3 d-3 f) を除く全細胞核で発見されました。P15 網膜、透過型電子顕微鏡 5mC 抗体信号 (図 3 hと3 i) と同様の棒細胞核ヘテロクロマチンのドメインの分布を示します。
INL と GCL の 5mC 染色は細胞核の chromocenters に強く、全体の細胞核 (数字 3j-3 lと3 r 3 t) でも観察された弱い染色します。5mC と対照をなして 5hmC 信号は INL と GCL (図 3 m 3oと3 u 3 w) で chromocenters を除いて全体の細胞核にローカライズされました。我々 は強力な観察 GCL 細胞核の周囲に 5hmC 信号。
大人の棒の光受容体の 5mC 信号は、5hmc 信号は核周辺 (図 4 d-4 階) に限られ、chromocenter および細胞核 (図 4 a-4 c) の核周囲に制限されました。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58274/58274fig1.jpg"> 図 1。16 日 5-メチルシトシンとマウス網膜における 5-ヒドロキシメチルシトシンのローカリゼーション。 C57bl/6 j 網膜 5mC 抗体の免疫染色 (赤) と 5hmC (緑、b)。E16 では、5mC 信号は細胞核の chromocenters で非常に強いとはるかに低いレベルで全体の細胞核にも存在。5hmC 染色は細胞核にのみ限られていた。パネル c は、差し込み印刷の 5mC と 5hmC のイメージを表します。核は、DAPI (青、c) と counterstained です。インセットは、画像内のアスタリスクで表示エリアの表示倍率を表しています。スケール バー: 5 μ m.<a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/58274/58274fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58274/58274fig2.jpg"> 図 2。5-メチルシトシンの 5-ヒドロキシメチルシトシン マウス網膜における生後 0 で染色。 C57bl/6 j 網膜 5mC 抗体との反応 (赤) と 5hmC (緑、b)。P0 網膜における 5mC と 5hmC、外側神経層 (ONBL) と内側の神経層 (INBL) の両方に存在。a) 5mC 信号が強く chromocenters (矢印) と核周辺の細胞核 (矢印)。5mC の弱い染色も細胞核の chromocenters の間に観察されます。b) 5hmC 染色は細胞核に限定されて、INBL (パネル c の点線) に強いシグナルが観察されます。パネル c は、差し込み印刷の 5mC と 5hmC のイメージを表します。核は、DAPI (青、c) と counterstained です。インセットは、画像内のアスタリスクで表示エリアの表示倍率を表しています。スケール バー: 5 μ m.<a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/58274/58274fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58274/58274fig3.jpg"> 図 3。生後 15 日目のマウス網膜における 5-メチルシトシンと 5-ヒドロキシメチルシトシンの分布。 反 5mC と 5hmC 抗体 (g、j-y) を c57bl/6 j 網膜の免疫染色。外の核層 (ONL) (杆)、5mC 信号で (赤) 通常 (矢印 b) 細胞核の chromocenters と一致しても (矢印 b) 核周囲に局在します。パネル b (赤) と c (グレー) を表すイメージ内のアスタリスクで表示領域の拡大。5hmC 信号 (緑、d) は、chromocenters を除いて全体の細胞核に限定されます。パネル e (緑) と f (グレー) g を表す差し込み印刷の 5mC と 5hmC の画像イメージ d. パネル内のアスタリスクで表示エリアの表示倍率を表しています。核は、DAPI で counterstained です。H パネルは、ヘテロクロマチンのドメインの生後 15 示す分布を光受容体核の透過電子顕微鏡像。パネル h で黒い矢印が指す片ロッド視細胞の核パネル i. に拡大私は棒の光受容体の核内のヘテロクロマチンのドメインをポイント核周囲のヘテロクロマチンを赤い矢印でポイントし、パネルで赤矢印。INL (j q) と GCL 細胞核 (r y)、(赤) 5mC 信号は chromocenters の周囲に存在するローカライズし、弱い染色は細胞の核の残りの部分でまた検出されます。パネル k (赤) と私 (グレー) 画像 j にアスタリスクが付いた表示エリアの表示倍率を表しています。INL と GCL の細胞核の 5hmC 染色 (グリーン) は、細胞核に限定されます。強力な 5hmC の GCL 細胞の核周囲の汚損に注意してください。パネル p と x を表し差し込み印刷の 5mC と 5hmC の画像パネル q と y それぞれイメージ p と x にアスタリスクが付いた表示エリアの表示倍率。核は、DAPI で counterstained です。スケール バー: 5 μ m.<a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/58274/58274fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58274/58274fig4.jpg"> 図 4。5-メチルシトシンと 5-ヒドロキシメチルシトシン ロッド視細胞の核の分布 c57bl/6 j マウス網膜生後 90 日目で。 5mC 染色 (赤、) が核の周囲の細胞核とも弱の現在の chromocenter で強く存在します。パネル b (赤) と c (グレー) を表すイメージ内のアスタリスクで表示領域の拡大。核周囲パネル e (緑) に専ら限られている 5hmC 染色 (緑、d) と f (グレー) 表す倍率 g を表す結合された 5mC と 5hmC パネル h 画像画像 d パネル内のアスタリスクが表示エリアの表示領域の拡大g. 核を DAPI (青) と counterstained がイメージにアスタリスクします。スケール バー: 5 μ m.<a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/58274/58274fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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Immunohistochemical Detection of 5-Methylcytosine and 5-Hydroxymethylcytosine in Developing and Postmitotic Mouse Retina

5-メチルシトシンと開発の 5-ヒドロキシメチルシトシンの免疫組織化学的検出と後マウス網膜

このレポートの目的は、エピジェネティックな遺伝子マーカーの堅牢な免疫組織化学的検出のためのプロトコルを記述するためです、5-メチルシトシン (5mC) および 5-ヒドロキシメチルシトシン (5hmC) の開発と後マウス網膜。

The epigenetics of retinal development is a well-studied research field, which promises to bring a new level of understanding about the mechanisms of a ...

immunohistochemical-detection-5-methylcytosine-5

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.9K ビュー.  BioTime, Inc. このレポートの目的は、エピジェネティックな遺伝子マーカーの堅牢な免疫組織化学的検出のためのプロトコルを記述するためです、5-メチルシトシン (5mC) および 5-ヒドロキシメチルシトシン (5hmC) の開発と後マウス網膜。

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Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of enzymatic oxidation of 5mC to 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) and 5-carboxylcytosine (5caC) as well as detection of N6-methyladenine (6mA) in the DNA of multicellular organisms provided additional degrees of complexity to the epigenetic research. According to a growing body of experimental evidence, these novel DNA modifications may play specific roles in different cellular and developmental processes. Importantly, as some of these marks (e. g. 5hmC, 5fC and 5caC) exhibit tissue- and developmental stage-specific occurrence in vertebrates, immunochemistry represents an important tool allowing assessment of spatial distribution of DNA modifications in different biological contexts. Here the methods for computational analysis of DNA modifications visualized by immunostaining followed by confocal microscopy are described. Specifically, the generation of 2.5 dimension (2.5D) signal intensity plots, signal intensity profiles, quantification of staining intensity in multiple cells and determination of signal colocalization coefficients are shown. Collectively, these techniques may be operational in evaluating the levels and localization of these DNA modifications in the nucleus, contributing to elucidating their biological roles in metazoans.

Newly discovered oxidized forms of 5-methylcytosine (oxi-mCs), 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) and 5-carboxylcytosine (5caC) may represent distinct DNA modifications with unique functional roles. Here a semi-quantitative workflow for visualization of oxi-mCs' spatial distribution, signal intensity profiling and colocalization is described.

DNA 変更染色: 共焦点画像の数値解析

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of ...

遺伝学

High Sensitivity 5-hydroxymethylcytosine Detection in Balb/C Brain Tissue

DNA hydroxymethylation is a long known modification of DNA, but has recently become a focus in epigenetic research. Mammalian DNA is enzymatically modified at the 5th carbon position of cytosine (C) residues to 5-mC, predominately in the context of CpG dinucleotides. 5-mC is amenable to enzymatic oxidation to 5-hmC by the Tet family of enzymes, which are believed to be involved in development and disease. Currently, the biological role of 5-hmC is not fully understood, but is generating a lot of interest due to its potential as a biomarker. This is due to several groundbreaking studies identifying 5-hydroxymethylcytosine in mouse embryonic stem (ES) and neuronal cells. Research techniques, including bisulfite sequencing methods, are unable to easily distinguish between 5-mC and 5-hmC . A few protocols exist that can measure global amounts of 5-hydroxymethylcytosine in the genome, including liquid chromatography coupled with mass spectrometry analysis or thin layer chromatography of single nucleosides digested from genomic DNA. Antibodies that target 5-hydroxymethylcytosine also exist, which can be used for dot blot analysis, immunofluorescence, or precipitation of hydroxymethylated DNA, but these antibodies do not have single base resolution.In addition, resolution depends on the size of the immunoprecipitated DNA and for microarray experiments, depends on probe design. Since it is unknown exactly where 5-hydroxymethylcytosine exists in the genome or its role in epigenetic regulation, new techniques are required that can identify locus specific hydroxymethylation. The EpiMark 5-hmC and 5-mC Analysis Kit provides a solution for distinguishing between these two modifications at specific loci. The EpiMark 5-hmC and 5-mC Analysis Kit is a simple and robust method for the identification and quantitation of 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine within a specific DNA locus. This enzymatic approach utilizes the differential methylation sensitivity of the isoschizomers MspI and HpaII in a simple 3-step protocol. Genomic DNA of interest is treated with T4-BGT, adding a glucose moeity to 5-hydroxymethylcytosine. This reaction is sequence-independent, therefore all 5-hmC will be glucosylated; unmodified or 5-mC containing DNA will not be affected. This glucosylation is then followed by restriction endonuclease digestion. MspI and HpaII recognize the same sequence (CCGG) but are sensitive to different methylation states. HpaII cleaves only a completely unmodified site: any modification (5-mC, 5-hmC or 5-ghmC) at either cytosine blocks cleavage. MspI recognizes and cleaves 5-mC and 5-hmC, but not 5-ghmC. The third part of the protocol is interrogation of the locus by PCR. As little as 20 ng of input DNA can be used. Amplification of the experimental (glucosylated and digested) and control (mock glucosylated and digested) target DNA with primers flanking a CCGG site of interest (100-200 bp) is performed. If the CpG site contains 5-hydroxymethylcytosine, a band is detected after glucosylation and digestion, but not in the non-glucosylated control reaction. Real time PCR will give an approximation of how much hydroxymethylcytosine is in this particular site. In this experiment, we will analyze the 5-hydroxymethylcytosine amount in a mouse Babl/C brain sample by end point PCR.

The EpiMark 5-hmC and 5-mC Analysis Kit can be used to analyze and quantitate 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine within a spe cific locus. The kit distinguishes 5-mC from 5-hmC by the addition of glucose to the hydroxyl group of 5-hmC via an enzymatic reaction utilizing &beta;-glucosyltransferase (T4-BGT). When 5-hmC occurs In the context of CCGG, this modification converts a cleavable MspI site to a non-cleavable site.

のBalb / Cの脳組織の高感度5 hydroxymethylcytosine検出

DNA hydroxymethylation is a long known modification of DNA, but has recently become a focus in epigenetic research.   Mammalian DNA is enzymatically ...

神経科学

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

Angiogenesis is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting of new blood vessels from a pre-existing vessel network. Angiogenesis plays a key role not only in normal development of organs and tissues, but also in many diseases in which blood vessel formation is dysregulated, such as cancer, blindness and ischemic diseases. In adult life, blood vessels are generally quiescent so angiogenesis is an important target for novel drug development to try and regulate new vessel formation specifically in disease. In order to better understand angiogenesis and to develop appropriate strategies to regulate it, models are required that accurately reflect the different biological steps that are involved. The mouse neonatal retina provides an excellent model of angiogenesis because arteries, veins and capillaries develop to form a vascular plexus during the first week after birth. This model also has the advantage of having a two-dimensional (2D) structure making analysis straightforward compared with the complex 3D anatomy of other vascular networks. By analyzing the retinal vascular plexus at different times after birth, it is possible to observe the various stages of angiogenesis under the microscope. This article demonstrates a straightforward procedure for analyzing the vasculature of a mouse retina using fluorescent staining with isolectin and vascular specific antibodies.

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

The neonatal murine retina provides a well characterized physiological model of angiogenesis, which permits investigations of the roles of different genes or drugs that modulate angiogenesis in an in vivo context. Immunofluorescent staining to accurately visualize the vascular plexus is pivotal to the success of these types of studies.

血管新生を調査するために新生児マウス網膜の全体のマウント免疫蛍光染色<em生体内で&gt;</em

Angiogenesis  is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting  of new blood vessels from a pre-existing vessel network. ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the developing cerebral cortex, abnormal mitosis of neural progenitors can cause defects in brain size and function. Hence, there is a critical need for tools to understand the mechanisms of neural progenitor mitosis. Cortical development in rodents is an outstanding model for studying this process. Neural progenitor mitosis is commonly examined in fixed brain sections. This protocol will describe in detail an approach for live imaging of mitosis in ex vivo embryonic brain slices. We will describe the critical steps for this procedure, which include: brain extraction, brain embedding, vibratome sectioning of brain slices, staining and culturing of slices, and time-lapse imaging. We will then demonstrate and describe in detail how to perform post-acquisition analysis of mitosis. We include representative results from this assay using the vital dye Syto11, transgenic mice (histone H2B-EGFP and centrin-EGFP), and in utero electroporation (mCherry-&#945;-tubulin). We will discuss how this procedure can be best optimized and how it can be modified for study of genetic regulation of mitosis. Live imaging of mitosis in brain slices is a flexible approach to assess the impact of age, anatomy, and genetic perturbation in a controlled environment, and to generate a large amount of data with high temporal and spatial resolution. Hence this protocol will complement existing tools for analysis of neural progenitor mitosis.

Neural progenitor mitosis is a critical parameter of neurogenesis. Much of our understanding of neural progenitor mitosis is based on analysis of fixed tissue. Live imaging in embryonic brain slices is a versatile technique to assess mitosis with high temporal and spatial resolution in a controlled environment.

発生中のマウス胚性皮質における有糸分裂のライブイメージング

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Rapid and Efficient Spatiotemporal Monitoring of Normal and Aberrant Cytosine Methylation within Intact Zebrafish Embryos

Cytosine methylation is highly conserved across vertebrate species and, as a key driver of epigenetic programming and chromatin state, plays a critical role in early embryonic development. Enzymatic modifications drive active methylation and demethylation of cytosine into 5-methylcytosine (5-mC) and subsequent oxidation of 5-mC into 5-hydroxymethylcytosine, 5-formylcytosine, and 5-carboxylcytosine. Epigenetic reprogramming is a critical period during in utero development, and maternal exposure to chemicals has the potential to reprogram the epigenome within offspring. This can potentially cause adverse outcomes such as immediate phenotypic consequences, long-term effects on adult disease susceptibility, and transgenerational effects of inherited epigenetic marks. Although bisulfite-based sequencing enables investigators to interrogate cytosine methylation at base-pair resolution, sequencing-based approaches are cost-prohibitive and, as such, preclude the ability to monitor cytosine methylation across developmental stages, multiple concentrations per chemical, and replicate embryos per treatment. Due to the ease of automated in vivo imaging, genetic manipulations, rapid ex utero development time, and husbandry during embryogenesis, zebrafish embryos continue to be used as a physiologically intact model for uncovering xenobiotic-mediated pathways that contribute to adverse outcomes during early embryonic development. Therefore, using commercially available 5-mC-specific antibodies, we describe a cost-effective strategy for rapid and efficient spatiotemporal monitoring of cytosine methylation within individual, intact zebrafish embryos by leveraging whole-mount immunohistochemistry, automated high-content imaging, and efficient data processing using programming language prior to statistical analysis. To current knowledge, this method is the first to successfully detect and quantify 5-mC levels in situ within zebrafish embryos during early development. The method enables the detection of DNA methylation within the cell mass and also has the ability to detect cytosine methylation of yolk-localized maternal mRNAs during the maternal-to-zygotic transition. Overall, this method will be useful for the rapid identification of chemicals that have the potential to disrupt cytosine methylation in situ during epigenetic reprogramming.

This paper describes a protocol for the rapid and efficient spatiotemporal monitoring of normal and aberrant cytosine methylation within intact zebrafish embryos.

無傷ゼブラフィッシュ胚における正常および異常なシトシンメチル化の迅速かつ効率的な時空間モニタリング

Cytosine methylation is highly conserved across vertebrate species and, as a key driver of epigenetic programming and chromatin state, plays a critical ...

発生生物学

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene expression, maintenance of genome integrity, parental imprinting, X-chromosome inactivation, regulation of development, aging, and cancer1. Recently, the presence of an oxidized 5-mC, 5-hydroxymethylcytosine (5-hmC), was discovered in mammalian cells, in particular in embryonic stem (ES) cells and neuronal cells2-4. 5-hmC is generated by oxidation of 5-mC catalyzed by TET family iron (II)/&alpha;-ketoglutarate-dependent dioxygenases2, 3. 5-hmC is proposed to be involved in the maintenance of embryonic stem (mES) cell, normal hematopoiesis and malignancies, and zygote development2, 5-10. To better understand the function of 5-hmC, a reliable and straightforward sequencing system is essential. Traditional bisulfite sequencing cannot distinguish 5-hmC from 5-mC11. To unravel the biology of 5-hmC, we have developed a highly efficient and selective chemical approach to label and capture 5-hmC, taking advantage of a bacteriophage enzyme that adds a glucose moiety to 5-hmC specifically12.
Here we describe a straightforward two-step procedure for selective chemical labeling of 5-hmC. In the first labeling step, 5-hmC in genomic DNA is labeled with a 6-azide-glucose catalyzed by &beta;-GT, a glucosyltransferase from T4 bacteriophage, in a way that transfers the 6-azide-glucose to 5-hmC from the modified cofactor, UDP-6-N3-Glc (6-N3UDPG). In the second step, biotinylation, a disulfide biotin linker is attached to the azide group by click chemistry. Both steps are highly specific and efficient, leading to complete labeling regardless of the abundance of 5-hmC in genomic regions and giving extremely low background. Following biotinylation of 5-hmC, the 5-hmC-containing DNA fragments are then selectively captured using streptavidin beads in a density-independent manner. The resulting 5-hmC-enriched DNA fragments could be used for downstream analyses, including next-generation sequencing.
Our selective labeling and capture protocol confers high sensitivity, applicable to any source of genomic DNA with variable/diverse 5-hmC abundances. Although the main purpose of this protocol is its downstream application (i.e., next-generation sequencing to map out the 5-hmC distribution in genome), it is compatible with single-molecule, real-time SMRT (DNA) sequencing, which is capable of delivering single-base resolution sequencing of 5-hmC.

Described is a two-step labeling process using &beta;-glucosyltransferase (&beta;-GT) to transfer an azide-glucose to 5-hmC, followed by click chemistry to transfer a biotin linker for easy and density-independent enrichment. This efficient and specific labeling method enables enrichment of 5-hmC with extremely low background and high-throughput epigenomic mapping via next-generation sequencing.

ゲノムDNAから5  - ヒドロキシの選択的捕獲

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...

生物学

The Detection of 5-Hydroxymethylcytosine in Neural Stem Cells and Brains of Mice

Multiple&#160;DNA modifications have been identified in the mammalian genome. Of that, 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic mechanisms have been intensively studied. 5-hydroxymethylcytosine displays dynamic features during embryonic and postnatal development of the brain, plays a regulatory function in gene expression, and is involved in multiple neurological disorders. Here, we describe the detailed methods including immunofluorescence staining and&#160;DNA dot-blot to detect 5-hydroxymethylcytosine in cultured cells and brain tissues of mouse.

Here, we present a protocol to detect 5-hydroxymethylcytosine in cells and brain tissues, utilizing immunofluorescence staining and DNA dot-blot methods.

マウスの神経幹細胞と脳における5-ヒドロキシメチルシトシンの検出

Multiple&#160;DNA modifications have been identified in the mammalian genome. Of that, 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic ...

Detection of Modified Forms of Cytosine Using Sensitive Immunohistochemistry

Methylation of cytosine bases (5-methylcytosine, 5mC) occurring in vertebrate genomes is usually associated with transcriptional silencing. 5-hydroxylmethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC), and 5-carboxylcytosine (5caC) are the recently discovered modified cytosine bases produced by enzymatic oxidation of 5mC, whose biological functions remain relatively obscure. A number of approaches ranging from biochemical to antibody based techniques have been employed to study the genomic distribution and global content of these modifications in various biological systems. Although some of these approaches can be useful for quantitative assessment of these modified forms of 5mC, most of these methods do not provide any spatial information regarding the distribution of these DNA modifications in different cell types, required for correct understanding of their functional roles. Here we present a highly sensitive method for immunochemical detection of the modified forms of cytosine. This method permits co-detection of these epigenetic marks with protein lineage markers and can be employed to study their nuclear localization, thus, contributing to deciphering their potential biological roles in different experimental contexts.

Herein we describe a sensitive immunochemical method for mapping the spatial distribution of 5mC oxidation derivatives based on the use of peroxidase-conjugated secondary antibodies and tyramide signal amplification.

高感度免疫組織化学を使用してシトシンの修飾された形態の検出

Methylation of cytosine bases (5-methylcytosine, 5mC) occurring in vertebrate genomes is usually associated with transcriptional silencing. ...

Cryosectioning and Immunostaining of Mouse Retina

Tissue sectioning and immunohistochemistry are essential techniques in histological and pathological studies of retinal diseases using animal models. These methods enable detailed examinations of tissue morphologies and the localization of specific proteins within the tissue, which provide valuable insights into disease processes and mechanisms. Mice are the most widely used model for this purpose. However, because mouse eyeballs are small and mouse retinas are extremely delicate tissues, obtaining high-quality retinal sections and immunostaining images from mouse eyeballs is typically challenging. This study describes an improved protocol for cryosectioning mouse retinas and performing immunohistochemistry. An essential point of this protocol involves coating the eyeball with a layer of super glue, which prevents deformation of the eyeballs during the processes of cornea removal, lens extraction, and embedding. This step ensures the integrity of retinal morphologies is well preserved. This protocol highlights critical technical considerations and optimization strategies for consistently producing high-quality retinal sections and achieving excellent immunostaining results.

A protocol for preparing mouse retinal cryosections and performing immunostaining on photoreceptors is described. This article enables researchers to consistently produce mouse retinal frozen sections with well-preserved morphology and high-quality immunostaining results.

マウス網膜の凍結切片および免疫染色

Tissue sectioning and immunohistochemistry are essential techniques in histological and pathological studies of retinal diseases using animal models. ...

5-Methylcytosine Dot Blot to Determine the Extent of DNA Methylation

Start this procedure by denaturing the isolated DNA in 0.1 molar sodium hydroxide for 10 minutes at 95 degrees Celsius. Neutralize the DNA with 1 molar ammonium acetate on ice, and then dilute two-fold with double-distilled water.
The most critical step in the dot blot is the spotting of the samples onto the membrane, do it slowly, and carefully. Try to minimize each spotted area to 3 to 4 millimeters in diameter.
Using a narrow-mouth pipette tip, carefully spot 2 microliters of the serial diluted genomic DNA onto a positively-charged nylon membrane at the center of the grid. Blot the membrane at 80 degrees Celsius for 30 minutes. Next, block the non-specific antibody binding sites by soaking the membrane in 5% BSA in TBST in a 10-centimeter Petri dish for 1 hour at room temperature with gentle shaking.
After 1 hour, wash the membrane three times in TBST for 5 minutes each time. Incubate the membrane with a mouse anti-5-methylcytosine monoclonal antibody in TBST at 4 degrees Celsius overnight. On the following day, wash the membrane three times in TBST for 5 minutes each time.
Then, incubate with a secondary antibody &#8212; horseradish peroxidase-conjugated sheep anti-mouse immunoglobulin G in TBST for one hour at room temperature. After washing the membrane in TBST as before, add the enzyme substrate to the membrane, and incubate for 5 to 10 minutes. Finally, visualize the secondary antibody signal using a chemiluminescence kit according to the manufacturer&#39;s instructions.

5-メチルシトシンと開発の 5-ヒドロキシメチルシトシンの免疫組織化学的検出と後マウス網膜

要約

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