Maus Netzhaut-Sektion ist ein wirklich empfindlicher Prozess aufgrund der Größe und Form der Augen und die Fragilität der Netzhaut abschnitt. Imperative zu üben, mit einem detaillierten Protokoll, das effiziente Methode und Tipps bieten ist der Schlüssel zu qualitativ hochwertigen Netzhaut-Sektion und Abschnitt. Wir geben Tipps und Ratschläge, um Forschern zu helfen, häufige Fallstricke zu vermeiden und einige hochwertige Netzhautabschnitte zu erhalten, die für die Immunhistochemie geeignet sind.
Markieren Sie den zeitlichen Teil des Auges einer eingeschläferten Maus mit einem Schwanzkauterizer, indem Sie die Hornhaut sehr leicht und für nicht mehr als eine Sekunde berühren, um die Hornhaut leicht zu verbrennen und ein Loch zu vermeiden. Unmittelbar danach verwendet gekrümmte Dumont 545 Zangen, um Mausaugen zu enukleatisieren. Die Augen in ein 1,5-Milliliter-Kryotube mit einem Milliliter 4%PFA und PBS legen und 15 Minuten auf Eis brüten.
Dann übertragen Sie die fixierten Augen mit den gekrümmten Dumont 545 Zangen auf eine modifizierte 35-Millimeter-Sektionsschale, die mit PBS gefüllt ist, und unter das Sezieren des Mikroskops stellen. Verwenden Sie ein Mikromesser, um einen kleinen Schnitt an der Brandmarke senkrecht und knapp über der Limbusgrenze der Hornhaut zu machen. Fügen Sie eine gekrümmte Schere in den Schnitt ein und führen Sie einen Umfangsschnitt der Hornhaut nach dem Limbus durch.
Dann, mit dünnen Dumont 5 Zangen, entfernen Sie die Hornhaut, extrahieren Sie die Linse, und heben Sie es zart weg von der hinteren Teil des Auges. Der Glaskörper wird mit der Linse herauskommen und die Netzhaut wird als weiße Oberfläche sichtbar sein, die die Innenseite der hinteren Augentasse bedeckt. Waschen Sie die isolierten Augenbecher zweimal in einem Milliliter PBS für 10 Minuten bei Raumtemperatur.
Um die Augenbecher kryo-schützen, gleicht sie in 15% Saccharose und PBS über Nacht bei vier Grad Celsius aus, bis sie sinken. Dann die Augenbecher für zwei bis drei Stunden auf 30% Saccharose und PBS übertragen, bis sie sinken. Legen Sie die Augenbecher in OCT in 10 mal 10 Millimeter Kryo-Formen zum Einbetten.
Richten Sie das Auge in der Kryoform unter einem Sezierendes Mikroskop entlang seiner dorsalen ventralen Achse aus, indem Sie das Auge so lange drehen, bis sich die Brandmarke oben befindet. Der Sehnerv ist einer links und der ausgeschnittene Teil der Form nach rechts. Um das Netzhautgewebe einzufrieren, tauchen Sie die Kryoform für mindestens fünf Minuten in einen Metallbecher mit Isopentan ein und legen Sie das Becherglas dann bis zu einem Drittel der Höhe des Becherglases in flüssigen Stickstoff.
Entfernen Sie den gefrorenen Block, wickeln Sie ihn in Aluminiumfolie und lagern Sie ihn bei minus 80 Grad Celsius. Verwenden Sie einen Stift oder Sharpie, um den eingefrorenen Block zu markieren, um seine Ausrichtung aufzuzeichnen. Nach der Einstellung der Kryostattemperatur zwischen minus 20 und minus 25 Grad Celsius, legen Sie die Formen mit den eingebetteten Augenbechern innen und lassen Sie sie auf die Kryostattemperatur für eine Stunde ausgrenzen.
Installieren Sie den Block im Kryostat mit der dorsalen ventralen Ausrichtung und beginnen Sie, 10 Mikrometer dicke serielle Abschnitte zu schneiden. Stellen Sie die Netzhautabschnitte vorsichtig auf kommentierte und nummerierte Mikroskopdias und lagern Sie dann in Diaboxen bei minus 20 Grad Celsius oder minus 80 Grad Celsius, bis sie zum Immunstainieren bereit sind. Immunhistochemie mit Antikörpern gegen Rhodopsin, einen Photorezeptormarker, Glutaminsäure-Decarboxylase 65 und Amacrine-Zellmarker, Glutamin-Synthetase und Muller-Zellmarker und Calbindin, ein horizontaler Zellmarker, wurde an Netzhautabschnitten durchgeführt.
Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass dieses Protokoll hohe Qualität und gut erhaltene Netzhautabschnitte liefert, im Gegensatz zu schlechter Qualität Netzhautabschnitte aus einem anderen Protokoll erhalten. Rhodopsin reiche innere und äußere Segmente bleiben vertikal und intakt mit wenig bis gar keine Trennung vom Überlegen des retinalen pigmentierten Epithels. Interneuronen, wie Gad65-positive Amacrinzellen, bleiben innerhalb der inneren Kernschicht und der inneren Plexiformschicht richtig geschichtet.
Außerdem bleiben Muller-Zellen gut erhalten mit Soma, der in zytoplasmatischen Prozessen, die sich von der Ganglienzellschicht bis zur äußeren Kernschicht erstrecken, richtig ausgerichtet ist. Darüber hinaus sind gut definierte horizontale Zellen an der inneren Kernschicht und dem äußeren Plexiformschichtrahmen nachweisbar. Es ist wichtig, den Topperbereich der Augen zu markieren und die Orientierung während der Einbettung zu behalten.
Bereiten Sie Paraformaldehyd unter der Haube immer mit der entsprechenden persönlichen Schutzausrüstung vor.
