Hier stellen wir ein Protokoll zum Nachweis von 5-Hydroxymethylcytosin in Zellen und gehirngeweben mithilfe der Immunfluoreszenz, der neuen Methode und des DNA-Dot-Blots vor. 5-Hydroxymethylcytosin, d.h. 5hmC, gemildert epigenetische Veränderung, spielt eine wichtige Funktion bei der Regulierung der Genexpression und ist an mehreren neurologischen Störungen beteiligt.
Eigentlich können unsere Methoden verwendet werden, um 5hmC in mehreren Zellen und geweben zu erkennen. Es ist bequem und kann mit gemeinsamen Geräten im Labor durchgeführt werden. Beginnen Sie, indem Sie die Maus nach oben auf einem Kunststoffbrett positionieren und jede Gliedmaße mit Klebeband fixieren.
Verwenden Sie eine chirurgische Schere, um die Haut und den Muskel zu durchschneiden und die Brusthöhle zu öffnen. Setzen Sie das Herz aus und schneiden Sie einen kleinen Teil des rechten Vorhofs mit einer feinen chirurgischen Schere ab. Mit einer 10-Milliliter Einweg-, sterilisierten Spritze, durchdringen Sie die Maus aus dem linken Ventrikel mit kalten PBS.
Dann durchdringen Sie die Maus mit 4%PFA, bis sie steif ist. Öffnen Sie dann den Schädel mit Knochenzangen und entfernen Sie das Gehirn. Legen Sie das Gehirn in ein 15-Milliliter-Zentrifugenrohr, gefüllt mit fünf Millilitern 4%PFA, und lagern Sie es bei vier Grad Celsius.
Nach 24 Stunden, übertragen Sie das Gehirn in eine 30%Saccharose-Lösung und lassen Sie es bei vier Grad Celsius für vollständige Dehydrierung. Vor dem Schneiden, einbetten Sie das Gehirn in optimale Schnitttemperatur Verbindung und kühlen auf minus 20 Grad Celsius für mindestens eine Stunde. Schnitt Gehirnproben mit einer Dicke von 20 bis 40 Mikrometern mit einem Kryostat-Mikrotom.
Sammeln Sie Abschnitte in PBS und lagern Bei vier Grad Celsius. Nehmen Sie die Gehirnabschnitte von Interesse und legen Sie sie in eine 24-Well-Platte mit PBS. Abschnitte mit PBS 10 Minuten auf einem Shaker waschen.
Entfernen Sie die PBS und behandeln Sie mit vorgewärmten ein-Molaren-Salzsäure bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten. Salzsäure ist ätzend und bereiten Sie sie bitte im chemischen Laderaum zu. Dann waschen Sie die Proben dreimal mit PBS für fünf Minuten und blockieren Sie sie mit PBS, die 3% normales Ziegenserum und 0,1% Triton X-100 enthalten.
Lassen Sie die Proben auf einem Shaker bei Raumtemperatur für eine Stunde. Fügen Sie den Abschnitten spezifische Primärantikörper hinzu und brüten Sie über Nacht bei vier Grad Celsius auf einem Shaker. Am nächsten Tag nehmen Sie die Proben heraus und lassen Sie sie bei Raumtemperatur für eine Stunde.
Waschen Sie die Proben dreimal mit PBS und fügen Sie sekundäre Antikörper hinzu. Bedecken Sie die Platte mit Aluminium und lassen Sie sie beim Schütteln eine Stunde bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Proben nach der Inkubation dreimal mit PBS und montieren Sie sie auf Dias.
Fügen Sie 100 bis 150 Mikroliter Anti-Fade-Montagemedium, Abdeckung mit einem Premium-Abdeckung Glas, und Versiegelung mit Nagellack. Stellen Sie die Gehirnabschnitte mit einem regelmäßigen oder konfokalen Mikroskop ab. Um genomische DNA zu isolieren, beginnen Sie mit der Zersebung des Hippocampus, des Kortex und des Kleinhirngewebes auf einer eisgekühlten Schale.
Fügen Sie einen Milliliter DNA-Lysepuffer hinzu und mahlen Sie das Gewebe. Übertragen Sie die Probe in ein sauberes Mikrozentrifugenrohr und fügen Sie 250 Mikrogramm Proteinase-K pro 600 Mikroliter Lysepuffer hinzu. Fügen Sie dann etwa 50 Mikrogramm RNase A pro Probe hinzu und brüten sie mindestens 12 Stunden bei 37 Grad Celsius.
Nach der Inkubation ein gleiches Volumen phenolchloroformisoamylalkohol hinzufügen und gründlich mischen. Zentrifugieren Sie die Mischung nach Manuskriptrichtungen und übertragen Sie den Überstand in ein neues Rohr. Fügen Sie dem Überstand 600 Mikroliter Chloroform hinzu, mischen Sie ihn gründlich und zentrifugieren Sie nach Manuskriptanweisungen.
Übertragen Sie den Überstand auf ein neues Rohr und fügen Sie 500 Mikroliter Isopropanol hinzu. Mischen Sie gründlich und Zentrifuge wieder, um die DNA zu fällen. Nach der Zentrifugation den Überstand entsorgen und das DNA-Pellet mit 70% Ethanol nach Manuskriptanweisungen waschen.
Trocknen Sie das DNA-Pellet vollständig und lösen Sie es dann im Tris-HCl-Puffer auf. Vor dem Start die erforderlichen Lösungen und Mustermischung enden nach Manuskriptanweisungen. Denaturen Sie die DNA-Probe, indem Sie sie 10 Minuten lang auf 100 Grad Celsius erhitzen und dann auf Eis legen.
Schneiden Sie die entsprechende Größe einer Nylonmembran und spülen Sie sie mit 6X SSC ab. Legen Sie die Membran auf ein Punkt-Blot-Gerät und schließen Sie die Vakuumpumpe an. Sechs-Mikroliter-Punkte auf die Membran erkennen und 30 Minuten bei 80 Grad Celsius hybridisieren.
Blockieren Sie dann die Probenmembran mit fettfreier Milch und Tris-gepufferter Salin, oder TBS, für eine Stunde. Fügen Sie den polyklonalen Kaninchen Anti-5-Hydroxymethylcytosin-Antikörper in die Membran und inkubieren Über nacht bei vier Grad Celsius. Am nächsten Tag die Probenmembran für eine Stunde bei Raumtemperatur lassen und dann dreimal mit TBS waschen.
Inkubieren Sie die Membran mit dem Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper für 30 Minuten und dann dreimal mit TBS waschen. Visualisieren Sie die Chemilumineszenzsignale und quantifizieren Sie ihre Intensität. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um 5-Hydroxymethylcytosin, oder 5hmC, im Hippocampus von erwachsenen Mäusen zu visualisieren.
Immunfluoreszenz mit Antikörpern gegen neuronale Zellen, die 5hmC zeigt, dass es eine Anreicherung von 5hmC in Neuronen. Die Dynamik von 5hmC während der neuronalen Entwicklung kann mit einem Punkt-Blot-Test von DNA-Proben bestimmt werden, die aus vermehrten und differenzierten adulten neuronalen Stammzellen isoliert wurden. Globale Konzentrationen von 5hmC deutlich während der Differenzierung und das Niveau von 5hmC in Neuronen ist höher als in neuronalen Stammzellen.
Der wichtigste Schritt dieser Methode besteht darin, sicherzustellen, dass die dna-Proben vollständig denaturiert werden.
