Questo lavoro è stato supportato da un grant SBIR (1R44EY027654-01A1).

Tutte le procedure con i topi sono state effettuate secondo protocolli approvati dal comitato animale bambini Hospital Oakland Research Institute uso e manutenzione e aderito all'associazione per la ricerca in visione e Oftalmologia (ARVO) istruzione per l'uso degli animali in oftalmica e ricerca di visione.
1. preparazione per l'immunocolorazione
<ol><li>Eutanasia di topi C57 BL/6J al giorno embrionale (E) 16, giorno postnatale (P) 0, P15 e P90 dall'anidride carbonica (CO2) seguita dalla decapitazione (topi E16 e P0).</li>
	<li>Gli occhi del mouse immediatamente enucleata forato con ago 29 1/2 sul lato dorsale dell'occhio. Incubare per 5 minuti (min) in 1 mL di paraformaldeide al 4% (PFA) pH tampone fosfato salino (1x PBS) 8.0 a temperatura ambiente.</li>
	<li>Per rendere conchiglie oculari da P0, P15 e P90, sezionare cornea e lente con forbice oftalmica mentre gli occhi sono in 4% PFA. Nota: Salta questo passaggio per E16 occhi come gli occhi sono troppo piccoli.</li>
	<li>Difficoltà le conchiglie oculari (P0, P15 e P90) e gli occhi tutto (E16) nel 4% PFA per 20 min a temperatura ambiente. Poi lavare il paraocchi e occhi tutto due volte in 1 mL di PBS 1X per 10 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Cryoprotect l'occhio tazze e tutto occhi in 1xPBS, pH 8,0 contenente 10% di saccarosio per 1 ora. Tenere in saccarosio al 20% in PBS 1X per 1 ora e poi saturare in saccarosio 30% in PBS 1X durante la notte a 4 ° C.</li>
	<li>Il giorno successivo, incorporare i paraocchi e gli occhi tutto in taglio ottimale temperatura composto (OCT), (500 µ l) in cryomolds, snap-freeze in un bagno di ghiaccio secco/etanolo e conservare a-80 ° C.</li>
	<li>Togliere gli stampi con paraocchi incorporato e occhi tutto da-80 ° C e far per equilibrare a-20 ° C per 1 ora prima di cryosectioning.</li>
	<li>Tagliare sezioni trasversali retiniche (spessore 12 µm) parallelamente all'asse di temporonasal attraverso la testa del nervo ottico usando un criostato a-20 ° C.</li>
	<li>Montare le sezioni della retina su microscopio diapositive53 e conservare a-80 ° C.</li>
</ol>2. Immunostaining con gli anticorpi 5-mC e 5-hmC
<ol><li>Circondano le sezioni della retina montate su slitte con una penna di barriera idrofoba. La penna di barriera idrofoba riduce il volume di anticorpo richiesto a macchiare il tessuto.</li>
	<li>Lavare le sezioni della retina una volta con 200 µ l di PBS 1X per 10 min.</li>
	<li>Permeabilize le sezioni della retina con 200 µ l di 0.1% Triton X-100 in 1X PBS (PBS-T) per 10 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Denaturare sezioni della retina per 30 min con 200 µ l di appena fatte 2 di acido cloridrico (HCl) N in PBS 1X in un incubatore a 37 ° C. Nota: Un'attenta titolazione di HCl trattamento è necessario per ottimizzare il segnale 5mC.</li>
	<li>Includere sempre replicati biologici (3-4) ottimizzando 5mC segnale54. Nota: Abbiamo fatto il ricupero dell'antigene a 4 punti di tempo (15min, 30min, 1h e 2h) e trovato 30 min di incubazione è ottima per segnale 5mC. Incubazione più lungo con HCl degrada la struttura dei nuclei che conduce all'incapacità di localizzare 5mC segnale al nucleo.</li>
	<li>Dopo denaturazione, neutralizzare retiniche sezioni aggiungendo 100 µ l di 0.1 M Tris-HCl (pH 8.3) sulle sezioni della retina per 10 min.</li>
	<li>Incubare le sezioni in 500 µ l di soluzione bloccante (5% di siero preimmune capra normale nello 0,1% Triton X-100 in PBS 1X) per 1 h a temperatura ambiente in una camera umida.</li>
	<li>Dopo il blocco, aggiungere anti-5mC; gli anticorpi anti-5hmC diluiti 1: 500 in blocco la soluzione alle sezioni della retina.</li>
	<li>Incubare retinica sezioni durante la notte a 4 ° C in camera umida.</li>
	<li>Il lavaggio del giorno successivo, sezioni della retina 3 volte (10-15 minuti ogni volta) con 0,1% PBS-T e poi incubare nella soluzione con i corrispondenti anticorpi secondari di blocco (Goat Anti-Rabbit e Goat Anti-Mouse IgG, diluito; 1: 1000), contenente DAPI (4', 6 - diamidino-2-phenylindole) soluzione (1 µ g/mL) a temperatura ambiente per 1 h nella soluzione di blocco. Nota: Evitare l'essiccazione delle sezioni durante tutte le fasi della immunodetection.</li>
	<li>Lavare i vetrini tre volte con 1 mL di 0,1% PBS-T.</li>
	<li>Dopo l'ultimo lavaggio, montare i profili con il mezzo di montaggio acquoso sotto un vetrino coprioggetto e sigillare con smalto incolore.</li>
</ol>3. confocale Immunohistochemistry
<ol><li>Orientare le sezioni per avere il lato di epitelio retinico del pigmento della Coppa ottica sempre di fronte un modo (per esempio, a), per coerenza.</li>
	<li>Eseguire l'acquisizione di immagini di retinica sezioni immunostained a 63 X (ingrandimento di un obiettivo) con 2 X o zoom 3x.</li>
	<li>Generare più sezioni ottiche di ogni immagine selezionata (z-stack) in tutti i 3 canali (rosso, verde e blu, RGB) utilizzando 0.35 µm passo. Nota: L'ingrandimento finale di un esemplare visualizzato alle 10-20x (ingrandimento di una lente obiettiva) sarà 63 X, rispettivamente, quando combinato con una (in genere usati) 10x lente oculare. Visualizzare stack compresso ottico per individuare il segnale 5mC e 5hmC</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Modificazioni del DNA dinamici e reversibile, che modulatethe la diversificata gamma di meccanismi biologici in uno sviluppo così come in cellule postmitotic hydroxymethylation e metilazione del DNA. Qui, descriviamo una tecnica riproducibile per la rilevazione 5mC 5hmC DNA modifiche e in situ mediante tecnica immunoistochimica (usando gli anticorpi anti-5mC e anti-5hmC) in paraformaldeide sezioni congelate di retina di topo e fornire linee guida per migliorare e standardizzare i risultati, soprattutto quando si confrontano diversi diversi esemplari. All'inizio abbiamo usato questo metodo per delineare 5mC cambiamenti nella retina di topo con retina specifiche targeting di Dnmt1, Dnmt3a e Dnmt3b DNA metiltransferasi geni e segnalato l'esaurimento (previsto) di marchi di 5mC in loro retine7 .
Il passaggio fondamentale nella rilevazione immunohistochemical 5mC è ottimizzazione del trattamento delle sezioni istologiche con HCl: meno di 15 min pretrattamento non dovrebbe produrre risultati riproducibili, mentre eccessivo trattamento con HCl distrugge il nucleare architettura. Abbiamo trovato il miglior risultato dopo un'incubazione di 30 min con HCl. Si consiglia di utilizzare sempre fresco diluito HCl e preparate 4% PFA soluzione per fissaggio del tessuto DNA denaturazione e retinico.
Per risolvere i risultati, si consiglia di includere tre o quattro repliche biologiche ottimizzando 5mC segnale. Mentre ogni singolo set di macchiatura immunohistochemical può generare risultati leggermente diversi (più o meno luminose regioni eterocromatiche), che è previsto in distribuzione immunohistochemical metodo, 5mC e 5hmC nucleare all'interno del set individuo delle sezioni dovrebbe essere molto riproducibili, per fintanto che il protocollo è seguito.
Questa tecnica ha anche limitazione come abbiamo costantemente osservato variabilità nella distribuzione di 5mC nei nuclei delle cellule del fotoricettore all'interno della stessa sezione. Abbiamo trovato alcuni nuclei ha mostrati il segnale forte 5mC mentre i nuclei delle cellule adiacenti ha mostrato nessun segnale di 5mC. Si tratta di limitazione a smascherare 5mC antigene di HCl trattamento nelle sezioni congelate.
Il significato di questa tecnica consente la localizzazione di 5mC senza DNasi e proteinasi K trattamento che porta alla migliore conservazione di cromocentri. Questa tecnica è previsto di lavorare robustamente su tutte le sezioni da tutti i tessuti animali vertebrati, trasportante 5mC, segni di 5hmC e trattata con un approccio simile, non solo la retina di topo, per fintanto che il protocollo è seguito.

Regolazione epigenetica di sviluppo e postmitotic omeostasi della retina di topo è un campo di ricerca, specifici del tipo di cella che promette di portare una nuova comprensione dei meccanismi biologici che controllano determinazione di destino delle cellule e retinogenesis, emozionante la funzione metabolica, nonché patologie cellulare, morte cellulare e rigenerazione1,2,3,4,5,6,7,8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. cromatina subisce cambiamenti dinamici in fase di sviluppo, così come in risposta a segnali esterni variabili che si tratti di stress, metabolico o delle cellule morte stimoli6,14,15, 16 , 17 , 18. nei nuclei del mouse, la cromatina è diviso in euchromatin attivo e inattivo eterocromatina6,19,20. Nel nucleo di interfase, l'eucromatina risiede nella regione interna del nucleo mentre eterocromatina linee la periferia nucleare e nucleolo. Questo modello è chiamato convenzionale ed è altamente conservato negli eucarioti. Al contrario, i nuclei di asta in animali notturni quali topi e ratti invertito modello dove il nucleo è occupato dall'eterocromatina nel centro circondato dall'eucromatina formando il guscio più esterno6,18, 20. Alla nascita, asta nuclei hanno architettura nucleare convenzionale. Inversione dei nuclei di asta si verifica durante lo sviluppo di rimodellamento dell'architettura nucleare convenzionale. Durante questo processo, eterocromatina periferico separa dalla periferia nucleare e cromocentri si fondono insieme per formare un singolo chromocenter nel centro del nucleo6,18.
La metilazione del DNA genomica partecipa nel controllo locale della cromatina conformazione21. Metilazione del DNA avviene nella posizione 5' di residui di citosina di dinucleotidi CpG che sono arricchiti nella regione del promotore di molti geni in mouse genomi22,23,24,25,26 così come in intergenica e regioni introne, che trasportano gli elementi normativi27. La metilazione delle isole CpG prossimale promotori21,24 e sequenze CpG in gene rinforzatori27,28 è importante nella regolazione dello stato dinamico della cromatina bivalente, contenente molti fattori di sviluppo geni/trascrizione che gioca un ruolo importante nello sviluppo, cancro e invecchiamento29,30,31,32,33,34 . Tre DNA metiltransferasi (DNMTs) partecipano nella metilazione del DNA nel corso del mouse sviluppo35. Tutti i tre DNMTs sono espressi durante del mouse sviluppo retinico36 e retina-specifiche modifiche in Dnmt geni impatto sviluppo retinico2,7. Idrossimetilcitosina (5hmC) è il prodotto ossidativo di demetilazione 5-metilcitosina (5mC). I tre enzimi di dieci-undici traslocazione (TET) partecipano a 5mC demetilazione37,38,39. Modifica di idrossimetil-C viene arricchita in promotori, enti di gene e sequenze intergeniche genomic gene ricca e regioni attivamente trascritto27,40.
C'è una varietà di approcci descritti per determinare i mutevoli modelli di metilazione del DNA in cellule41,42,43,44,45,46, alcuni di loro abilitazione quantificare i cambiamenti globali di metilazione del DNA mentre altri focalizzarsi su precisi cambiamenti nelle regioni CpG-ricco all'interno di promotori ed esaltatori di sapidità. Metodi per il rilevamento e la quantificazione di 5hmC sono stati anche segnalati47comprese da immunohistochemistry13. Tecniche immunoistochimiche, che consentono il monitoraggio robusto di 5mC e 5hmC cambiamenti nei nuclei di sviluppo e cellule postmitotic, sono molto ben informato per la delineazione della cromatina dynamics in situ in risposta ai cambiamenti esterni o interni influenzando la cellule4,13,48,49. Tuttavia, questo approccio è incline a sottovalutare la metilazione del DNA e hydroxymethylation modifiche a causa di difficoltà tecniche, connesse con rilevamento modifiche citosina in preparati istologici. Questo è poiché il DNA non polare si basa, compresi 5mC e citosina 5hmC-modificato, sono nascosti all'interno del centro della doppia elica del DNA elica50e richiedono smascheramento. Questo rappresenta una sfida particolare in preparazioni istologiche congelate, che potrebbero perdere rapidamente informativo organizzazione del tessuto originale quando viene applicato il trattamento duro.
Retina di topo è un eccellente modello per sezionare il contributo di metilazione del DNA a sviluppo neurale e omeostasi postmitotic. Ci sono solo 6 tipi di neuroni (rod e cono fotorecettori, amacrine, bipolare, cellule del ganglio e orizzontale), tipo una cellula glial (glia Muller) e uno neuroepithelial delle cellule tipo (epitelio pigmentato retinico)51. Tipi di cellule retiniche sono stati segnalati per avere modelli distinti di DNA metilazione18,19, che recentemente è stato studiato al singolo-base risoluzione1,5,9,12. Recentemente abbiamo riferito applicazione di immunohistochemistry per delineare 5mC pattern di distribuzione all'interno dei nuclei delle cellule retiniche e cambiamenti nei nuclei della retina di topo adulto, dove sono stati rimossi tutti i methyltransferases del DNA tre mirando condizionale 7. rispetto ad una serie di rapporti, dove la presenza di metilazione del DNA in cellule della retina potrebbe essere visto solo come un segnale positivo o negativo segnale in hypermethylated cellule che subiscono apoptosi, il nostro approccio abilitato rilevamento specifico della cromatina disposizione all'interno dei nuclei delle cellule retiniche, che diversi gruppi e abbiamo segnalato e discusso in precedenza5,6,7,18,19,36 , 52. qui, descriviamo la tecnica immunoistochimica (IHC) di individuare 5mC e 5hmC in sezioni istologiche paraformaldeide congelate nei dettagli così come dimostrano i dati, che siamo stati in grado di riprodurre dal nostro rapporto originale7 .

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Supplies&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>29G1/2 ULTRA-FINE</td><td>BD Biosciences</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>Ophthalmic scissor</td><td>Fine Science tools, Inc.&amp;nbsp;</td><td>15000-03</td><td></td></tr><tr><td>PAP pen</td><td>RPICORP.com</td><td>195505</td><td></td></tr><tr><td>Microslide Superfrost plus</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Reagent&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Electron Microscope Science</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek Optical cutting compound (OCT)</td><td>VWR</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Triton X 100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>6 N HCl</td><td>VWR analytical&amp;nbsp;</td><td>BDH7204-1</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl pH 8.3</td><td>Teknova</td><td>T1083</td><td></td></tr><tr><td>Goat serum</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>005-000-121</td><td></td></tr><tr><td>5mC</td><td>Genway Biotech&amp;nbsp;</td><td>GWB-BD5190</td><td></td></tr><tr><td>5hmC</td><td>Active Motif</td><td>39791</td><td></td></tr><tr><td>LaminB1</td><td>Abcam</td><td>Ab16048</td><td></td></tr><tr><td>Cy2 AffiniPure Goat Ant-Rabbit IgG</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>111-225-1444</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 AffiniPure Goat Ant-Mouse IgG</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>115-585-166</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold Antifade medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MICRM HM 550</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>388114</td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

immunohistochemical detection of 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine in developing and postmitotic mouse retina

L'epigenetica di sviluppo retinico è un campo di ricerca ben studiata, che promette di portare un nuovo livello di comprensione circa i meccanismi di una varietà di malattie degenerative della retina umane e individuare nuovi approcci terapeutici. L'architettura nucleare della retina di topo è organizzato in due modelli differenti: convenzionale e invertito. Modello convenzionale è universale dove eterocromatina è localizzata alla periferia del nucleo, mentre l'eucromatina attiva risiede all'interno di nucleare. Al contrario, invertito modello nucleare è unico ai nuclei delle cellule del fotoricettore adulto asta dove eterocromatina si localizza al centro nucleare, e l'eucromatina risiede nella periferia nucleare. Metilazione del DNA è osservata principalmente in cromocentri. Metilazione del DNA è una modificazione covalente dinamica relativa ai residui di citosina (5-metilcitosina, 5mC) di dinucleotidi CpG che sono arricchiti in regioni promotore di molti geni. Tre DNA metiltransferasi (DNMT1, DNMT3A e DNMT3B) partecipano nella metilazione del DNA durante lo sviluppo. 5mC rilevazione con tecniche immunoistochimiche è molto impegnativo, che contribuiscono alla variabilità nei risultati, come tutte le basi di DNA comprese le basi 5mC per volta sono nascosti all'interno di elica del DNA double-stranded. Tuttavia, dettagliate delineazione di 5mC distribuzione durante lo sviluppo è molto istruttiva. Qui, descriviamo una tecnica riproducibile per rilevazione immunohistochemical robusto di 5mC e un altro epigenetici DNA marker 5-idrossimetilcitosina (5hmC), che colocalizza con la cromatina "apre", trascrizionalmente attiva nello sviluppo e retina di topo postmitotic.

Per determinare la distribuzione di 5-metilcitosina (5mC) e 5-idrossimetilcitosina (5hmC) durante lo sviluppo della retina e nella retina postmitotic, abbiamo immunostained C57BL/6J retinica sezione mouse da E16, P0, P15 e P90 con anticorpi specifici per 5mC e 5hmC.
A E16 la macchiatura 5mC era forte in cromocentri dei nuclei delle cellule mentre colorazione debole è stata osservata nei nuclei intera cellula (Figura 1a). La macchiatura di 5hmC è stata limitata ai nuclei delle cellule ed era assente da cromocentri (Figura 1b).
Nella retina P0, il segnale di 5mC è stato localizzato la cromocentri dei nuclei delle cellule e periferia nucleare (Figura 2a, freccia e punta di freccia). Inoltre abbiamo osservato colorazione debole di 5mC tra i cromocentri dei nuclei delle cellule. Il segnale di 5hmC era fortemente presente nei nuclei delle cellule ad eccezione di cromocentri (Figura 2b). Abbiamo trovato che più nuclei sono macchiati con 5mC e 5hmC nello strato interno neuroblasto (INBL) (Figura 2 c, linea tratteggiata)
Nella retina P15, abbiamo trovato forte macchiatura di 5mC e 5hmC in strato nucleare esterno (ONL), strato nucleare interno (INL) e strato delle cellule del ganglio (GCL) (Figura 3). In ONL (fotoricettori dell'asta), il segnale di 5mC era presente in cromocentri dei nuclei delle cellule e periferia nucleare (figure 3a-3C, 3G). Il segnale di 5hmC è stato trovato nei nuclei di cellule intere ad eccezione di cromocentri (figure 3d-3f). La microscopia elettronica di trasmissione fatta P15 retina Mostra distribuzione di domini eterocromatici nei nuclei delle cellule asta simile a quella trovata con segnale di anticorpo 5mC (figure 3 h e 3i).
La macchiatura di 5mC in INL e GCL era forte in cromocentri dei nuclei delle cellule e colorazione debole è stata osservata anche nei nuclei di cellule intere (figure 3j-3L e 3r-3t). A differenza di 5mC, il segnale di 5hmC è stato localizzato dei nuclei di cellule intere ad eccezione di cromocentri in INL e GCL (figure 3 m-3o e 3u-3w). Abbiamo osservato un forte segnale di 5hmC alla periferia dei nuclei delle cellule GCL.
Nei fotorecettori adulti rod, il segnale di 5mC era limitato allo chromocenter e alla periferia nucleare dei nuclei delle cellule (figure 4a-4c) mentre 5hmc segnale è stato limitato alla periferia nucleare (figure 4 d-4f).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58274/58274fig1.jpg"> Figura 1. Localizzazione di 5-metilcitosina e 5-idrossimetilcitosina nella retina di topo al giorno embrionale 16. Immunostaining di C57BL/6J retina con gli anticorpi a 5mC (rosso) e 5hmC (verde, b). E16, 5mC segnale è molto forte in cromocentri dei nuclei delle cellule e anche presenti nei nuclei di cellule intere al livello più basso. 5hmC macchiatura è stata limitata esclusivamente ai nuclei delle cellule. C pannello rappresenta 5mC Unite e 5hmC immagine. I nuclei sono controcolorati con DAPI (blu, c). Inserti rappresentano ingrandimento dell'area contrassegnato da asterisco nelle immagini. Barra della scala: 5 µm. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/58274/58274fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58274/58274fig2.jpg"> Nella figura 2. La macchiatura di Immunohistochemical di 5-metilcitosina e 5-idrossimetilcitosina nella retina di topo postnatale giorno 0. Immunolabeling della retina C57BL/6J con gli anticorpi a 5mC (rosso) e 5hmC (verde, b). Nella retina P0, 5mC e 5hmC sono presenti nel livello esterno neuroblasto (ONBL) e strato interno neuroblasto (INBL). ) segnale di 5mC è fortemente presente nel cromocentri (freccia) e periferia nucleare dei nuclei delle cellule (punta di freccia). Inoltre si osserva una colorazione debole di 5mC tra i cromocentri dei nuclei delle cellule. b) 5hmC macchiatura è limitata al nucleo della cellula e segnale forte è osservata in INBL (linea tratteggiata nel pannello c). C pannello rappresenta 5mC Unite e 5hmC immagine. I nuclei sono controcolorati con DAPI (blu, c). Inserti rappresentano ingrandimento dell'area contrassegnato da asterisco nelle immagini. Barra della scala: 5 µm. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/58274/58274fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58274/58274fig3.jpg"> Nella figura 3. distribuzione 5-metilcitosina e 5-idrossimetilcitosina nella retina di topo postnatale giorno 15. Immunostaining di C57BL/6J retina con anticorpi anti-5mC e 5hmC (a-g, j-y). Nello strato nucleare esterno (ONL) (fotoricettori dell'asta), 5mC segnale (rosso) solitamente coincide con il cromocentri dei nuclei delle cellule (punta di freccia, b) e anche si localizza alla periferia nucleare (freccia, b). Pannello b (rosso) e c (grigio) rappresentano ingrandimento dell'area contrassegnato da asterisco nell'immagine di una. Il segnale di 5hmC (verde, d) è limitato ai nuclei cellulari tutto tranne i cromocentri. Pannello e (verde) e f (grigio) rappresentano ingrandimento dell'area contrassegnato da asterisco nella immagine d. pannello g rappresenta 5mC Unite e 5hmC immagine. I nuclei sono controcolorati con DAPI. Pannello h ed io siamo immagine di microscopio elettronico a trasmissione dei nuclei del fotoricettore a postnatale giorno 15 visualizzando distribuzione dei domini eterocromatici. Punta di freccia nera in pannello h punta a stelo singolo fotorecettore nucleo allargato nei. pannello rosse frecce nel pannello che indico heterochromatic domini all'interno di nucleo del fotoricettore asta mentre le frecce rosse al punto di eterocromatina nella periferia nucleare. In INL (j-q) e nuclei delle cellule GCL (r-y), il segnale di 5mC (rosso) è localizzato il cromocentri presenti nella periferia e colorazione debole viene rilevato anche nel resto dei nuclei delle cellule. Pannello k (rosso) e i (grigio) rappresentano ingrandimento dell'area contrassegnato da asterisco nella figura j. La macchiatura di 5hmC (verde) nei nuclei delle cellule INL e GCL è limitata al nucleo della cellula intera. Nota 5hmC forte colorazione nella periferia nucleare delle cellule GCL. X e pannello p rappresentano 5mC Unite e 5hmC immagine mentre y e pannello q rappresentano ingrandimento dell'area contrassegnato da asterisco nel immagine p e x rispettivamente. I nuclei sono controcolorati con DAPI. Barra della scala: 5 µm. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/58274/58274fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58274/58274fig4.jpg"> Nella figura 4. 5-metilcitosina e 5-idrossimetilcitosina distribuzione nei nuclei del fotoricettore asta di retina di topo C57BL/6J al 90 ° giorno postnatale. La macchiatura di 5mC (rosso, un) è fortemente presente in chromocenter dei nuclei delle cellule e anche debolmente presente nella periferia nucleare. Pannello b (rosso) e c (grigio) rappresentano ingrandimento dell'area contrassegnato da asterisco nell'immagine di una. La macchiatura di 5hmC (verde, d) è esclusivamente limitata alla periferia nucleare e pannello (verde) e f (grigio) rappresentano ingrandimento dell'area contrassegnato da asterisco nella immagine d. pannello g rappresenta 5mC Unite e 5hmC immagine mentre h del pannello è di ingrandimento della zona indicata con asterisco nell'immagine che g. Nuclei sono controcolorati con DAPI (blu). Barra della scala: 5 µm. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/58274/58274fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Immunohistochemical Detection of 5-Methylcytosine and 5-Hydroxymethylcytosine in Developing and Postmitotic Mouse Retina at JoVE.com

Immunohistochemical Detection of 5-Methylcytosine and 5-Hydroxymethylcytosine in Developing and Postmitotic Mouse Retina

Rilevazione di Immunohistochemical di 5-metilcitosina e 5-idrossimetilcitosina nello sviluppo e Retina di topo Postmitotic

L'obiettivo di questo rapporto è di descrivere il protocollo per rilevazione immunohistochemical robusto di marcatori epigenetici, 5-metilcitosina (5mC) e 5-idrossimetilcitosina (5hmC) nello sviluppo e postmitotic mouse retina.

The epigenetics of retinal development is a well-studied research field, which promises to bring a new level of understanding about the mechanisms of a ...

immunohistochemical-detection-5-methylcytosine-5

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.9K Views.  BioTime, Inc. L'obiettivo di questo rapporto è di descrivere il protocollo per rilevazione immunohistochemical robusto di marcatori epigenetici, 5-metilcitosina (5mC) e 5-idrossimetilcitosina (5hmC) nello sviluppo e postmitotic mouse retina.

Video: Immunohistochemical Detection of 5-Methylcytosine and 5-Hydroxymethylcytosine in Developing and Postmitotic Mouse Retina

Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of enzymatic oxidation of 5mC to 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) and 5-carboxylcytosine (5caC) as well as detection of N6-methyladenine (6mA) in the DNA of multicellular organisms provided additional degrees of complexity to the epigenetic research. According to a growing body of experimental evidence, these novel DNA modifications may play specific roles in different cellular and developmental processes. Importantly, as some of these marks (e. g. 5hmC, 5fC and 5caC) exhibit tissue- and developmental stage-specific occurrence in vertebrates, immunochemistry represents an important tool allowing assessment of spatial distribution of DNA modifications in different biological contexts. Here the methods for computational analysis of DNA modifications visualized by immunostaining followed by confocal microscopy are described. Specifically, the generation of 2.5 dimension (2.5D) signal intensity plots, signal intensity profiles, quantification of staining intensity in multiple cells and determination of signal colocalization coefficients are shown. Collectively, these techniques may be operational in evaluating the levels and localization of these DNA modifications in the nucleus, contributing to elucidating their biological roles in metazoans.

Newly discovered oxidized forms of 5-methylcytosine (oxi-mCs), 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) and 5-carboxylcytosine (5caC) may represent distinct DNA modifications with unique functional roles. Here a semi-quantitative workflow for visualization of oxi-mCs' spatial distribution, signal intensity profiling and colocalization is described.

Immunostaining per modificazioni del DNA: analisi computazionale delle immagini Confocal

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of ...

Ricerca

Genetica

High Sensitivity 5-hydroxymethylcytosine Detection in Balb/C Brain Tissue

DNA hydroxymethylation is a long known modification of DNA, but has recently become a focus in epigenetic research. Mammalian DNA is enzymatically modified at the 5th carbon position of cytosine (C) residues to 5-mC, predominately in the context of CpG dinucleotides. 5-mC is amenable to enzymatic oxidation to 5-hmC by the Tet family of enzymes, which are believed to be involved in development and disease. Currently, the biological role of 5-hmC is not fully understood, but is generating a lot of interest due to its potential as a biomarker. This is due to several groundbreaking studies identifying 5-hydroxymethylcytosine in mouse embryonic stem (ES) and neuronal cells. Research techniques, including bisulfite sequencing methods, are unable to easily distinguish between 5-mC and 5-hmC . A few protocols exist that can measure global amounts of 5-hydroxymethylcytosine in the genome, including liquid chromatography coupled with mass spectrometry analysis or thin layer chromatography of single nucleosides digested from genomic DNA. Antibodies that target 5-hydroxymethylcytosine also exist, which can be used for dot blot analysis, immunofluorescence, or precipitation of hydroxymethylated DNA, but these antibodies do not have single base resolution.In addition, resolution depends on the size of the immunoprecipitated DNA and for microarray experiments, depends on probe design. Since it is unknown exactly where 5-hydroxymethylcytosine exists in the genome or its role in epigenetic regulation, new techniques are required that can identify locus specific hydroxymethylation. The EpiMark 5-hmC and 5-mC Analysis Kit provides a solution for distinguishing between these two modifications at specific loci. The EpiMark 5-hmC and 5-mC Analysis Kit is a simple and robust method for the identification and quantitation of 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine within a specific DNA locus. This enzymatic approach utilizes the differential methylation sensitivity of the isoschizomers MspI and HpaII in a simple 3-step protocol. Genomic DNA of interest is treated with T4-BGT, adding a glucose moeity to 5-hydroxymethylcytosine. This reaction is sequence-independent, therefore all 5-hmC will be glucosylated; unmodified or 5-mC containing DNA will not be affected. This glucosylation is then followed by restriction endonuclease digestion. MspI and HpaII recognize the same sequence (CCGG) but are sensitive to different methylation states. HpaII cleaves only a completely unmodified site: any modification (5-mC, 5-hmC or 5-ghmC) at either cytosine blocks cleavage. MspI recognizes and cleaves 5-mC and 5-hmC, but not 5-ghmC. The third part of the protocol is interrogation of the locus by PCR. As little as 20 ng of input DNA can be used. Amplification of the experimental (glucosylated and digested) and control (mock glucosylated and digested) target DNA with primers flanking a CCGG site of interest (100-200 bp) is performed. If the CpG site contains 5-hydroxymethylcytosine, a band is detected after glucosylation and digestion, but not in the non-glucosylated control reaction. Real time PCR will give an approximation of how much hydroxymethylcytosine is in this particular site. In this experiment, we will analyze the 5-hydroxymethylcytosine amount in a mouse Babl/C brain sample by end point PCR.

The EpiMark 5-hmC and 5-mC Analysis Kit can be used to analyze and quantitate 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine within a spe cific locus. The kit distinguishes 5-mC from 5-hmC by the addition of glucose to the hydroxyl group of 5-hmC via an enzymatic reaction utilizing &beta;-glucosyltransferase (T4-BGT). When 5-hmC occurs In the context of CCGG, this modification converts a cleavable MspI site to a non-cleavable site.

High Sensitivity 5-hydroxymethylcytosine rilevamento in Balb / C tessuto cerebrale

DNA hydroxymethylation is a long known modification of DNA, but has recently become a focus in epigenetic research.   Mammalian DNA is enzymatically ...

Neuroscienze

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

Angiogenesis is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting of new blood vessels from a pre-existing vessel network. Angiogenesis plays a key role not only in normal development of organs and tissues, but also in many diseases in which blood vessel formation is dysregulated, such as cancer, blindness and ischemic diseases. In adult life, blood vessels are generally quiescent so angiogenesis is an important target for novel drug development to try and regulate new vessel formation specifically in disease. In order to better understand angiogenesis and to develop appropriate strategies to regulate it, models are required that accurately reflect the different biological steps that are involved. The mouse neonatal retina provides an excellent model of angiogenesis because arteries, veins and capillaries develop to form a vascular plexus during the first week after birth. This model also has the advantage of having a two-dimensional (2D) structure making analysis straightforward compared with the complex 3D anatomy of other vascular networks. By analyzing the retinal vascular plexus at different times after birth, it is possible to observe the various stages of angiogenesis under the microscope. This article demonstrates a straightforward procedure for analyzing the vasculature of a mouse retina using fluorescent staining with isolectin and vascular specific antibodies.

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

The neonatal murine retina provides a well characterized physiological model of angiogenesis, which permits investigations of the roles of different genes or drugs that modulate angiogenesis in an in vivo context. Immunofluorescent staining to accurately visualize the vascular plexus is pivotal to the success of these types of studies.

Tutta Monte immunofluorescenza del mouse Retina neonatale per Indagare Angiogenesi<em&gt; In vivo</em

Angiogenesis  is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting  of new blood vessels from a pre-existing vessel network. ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the developing cerebral cortex, abnormal mitosis of neural progenitors can cause defects in brain size and function. Hence, there is a critical need for tools to understand the mechanisms of neural progenitor mitosis. Cortical development in rodents is an outstanding model for studying this process. Neural progenitor mitosis is commonly examined in fixed brain sections. This protocol will describe in detail an approach for live imaging of mitosis in ex vivo embryonic brain slices. We will describe the critical steps for this procedure, which include: brain extraction, brain embedding, vibratome sectioning of brain slices, staining and culturing of slices, and time-lapse imaging. We will then demonstrate and describe in detail how to perform post-acquisition analysis of mitosis. We include representative results from this assay using the vital dye Syto11, transgenic mice (histone H2B-EGFP and centrin-EGFP), and in utero electroporation (mCherry-&#945;-tubulin). We will discuss how this procedure can be best optimized and how it can be modified for study of genetic regulation of mitosis. Live imaging of mitosis in brain slices is a flexible approach to assess the impact of age, anatomy, and genetic perturbation in a controlled environment, and to generate a large amount of data with high temporal and spatial resolution. Hence this protocol will complement existing tools for analysis of neural progenitor mitosis.

Neural progenitor mitosis is a critical parameter of neurogenesis. Much of our understanding of neural progenitor mitosis is based on analysis of fixed tissue. Live imaging in embryonic brain slices is a versatile technique to assess mitosis with high temporal and spatial resolution in a controlled environment.

Immagini dal vivo della mitosi in via di sviluppo embrionali di topo Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Rapid and Efficient Spatiotemporal Monitoring of Normal and Aberrant Cytosine Methylation within Intact Zebrafish Embryos

Cytosine methylation is highly conserved across vertebrate species and, as a key driver of epigenetic programming and chromatin state, plays a critical role in early embryonic development. Enzymatic modifications drive active methylation and demethylation of cytosine into 5-methylcytosine (5-mC) and subsequent oxidation of 5-mC into 5-hydroxymethylcytosine, 5-formylcytosine, and 5-carboxylcytosine. Epigenetic reprogramming is a critical period during in utero development, and maternal exposure to chemicals has the potential to reprogram the epigenome within offspring. This can potentially cause adverse outcomes such as immediate phenotypic consequences, long-term effects on adult disease susceptibility, and transgenerational effects of inherited epigenetic marks. Although bisulfite-based sequencing enables investigators to interrogate cytosine methylation at base-pair resolution, sequencing-based approaches are cost-prohibitive and, as such, preclude the ability to monitor cytosine methylation across developmental stages, multiple concentrations per chemical, and replicate embryos per treatment. Due to the ease of automated in vivo imaging, genetic manipulations, rapid ex utero development time, and husbandry during embryogenesis, zebrafish embryos continue to be used as a physiologically intact model for uncovering xenobiotic-mediated pathways that contribute to adverse outcomes during early embryonic development. Therefore, using commercially available 5-mC-specific antibodies, we describe a cost-effective strategy for rapid and efficient spatiotemporal monitoring of cytosine methylation within individual, intact zebrafish embryos by leveraging whole-mount immunohistochemistry, automated high-content imaging, and efficient data processing using programming language prior to statistical analysis. To current knowledge, this method is the first to successfully detect and quantify 5-mC levels in situ within zebrafish embryos during early development. The method enables the detection of DNA methylation within the cell mass and also has the ability to detect cytosine methylation of yolk-localized maternal mRNAs during the maternal-to-zygotic transition. Overall, this method will be useful for the rapid identification of chemicals that have the potential to disrupt cytosine methylation in situ during epigenetic reprogramming.

This paper describes a protocol for the rapid and efficient spatiotemporal monitoring of normal and aberrant cytosine methylation within intact zebrafish embryos.

Monitoraggio spaziotemporale rapido ed efficiente della metilazione della citosina normale e aberrante all'interno di embrioni di zebrafish intatti

Cytosine methylation is highly conserved across vertebrate species and, as a key driver of epigenetic programming and chromatin state, plays a critical ...

Biologia dello sviluppo

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene expression, maintenance of genome integrity, parental imprinting, X-chromosome inactivation, regulation of development, aging, and cancer1. Recently, the presence of an oxidized 5-mC, 5-hydroxymethylcytosine (5-hmC), was discovered in mammalian cells, in particular in embryonic stem (ES) cells and neuronal cells2-4. 5-hmC is generated by oxidation of 5-mC catalyzed by TET family iron (II)/&alpha;-ketoglutarate-dependent dioxygenases2, 3. 5-hmC is proposed to be involved in the maintenance of embryonic stem (mES) cell, normal hematopoiesis and malignancies, and zygote development2, 5-10. To better understand the function of 5-hmC, a reliable and straightforward sequencing system is essential. Traditional bisulfite sequencing cannot distinguish 5-hmC from 5-mC11. To unravel the biology of 5-hmC, we have developed a highly efficient and selective chemical approach to label and capture 5-hmC, taking advantage of a bacteriophage enzyme that adds a glucose moiety to 5-hmC specifically12.
Here we describe a straightforward two-step procedure for selective chemical labeling of 5-hmC. In the first labeling step, 5-hmC in genomic DNA is labeled with a 6-azide-glucose catalyzed by &beta;-GT, a glucosyltransferase from T4 bacteriophage, in a way that transfers the 6-azide-glucose to 5-hmC from the modified cofactor, UDP-6-N3-Glc (6-N3UDPG). In the second step, biotinylation, a disulfide biotin linker is attached to the azide group by click chemistry. Both steps are highly specific and efficient, leading to complete labeling regardless of the abundance of 5-hmC in genomic regions and giving extremely low background. Following biotinylation of 5-hmC, the 5-hmC-containing DNA fragments are then selectively captured using streptavidin beads in a density-independent manner. The resulting 5-hmC-enriched DNA fragments could be used for downstream analyses, including next-generation sequencing.
Our selective labeling and capture protocol confers high sensitivity, applicable to any source of genomic DNA with variable/diverse 5-hmC abundances. Although the main purpose of this protocol is its downstream application (i.e., next-generation sequencing to map out the 5-hmC distribution in genome), it is compatible with single-molecule, real-time SMRT (DNA) sequencing, which is capable of delivering single-base resolution sequencing of 5-hmC.

Described is a two-step labeling process using &beta;-glucosyltransferase (&beta;-GT) to transfer an azide-glucose to 5-hmC, followed by click chemistry to transfer a biotin linker for easy and density-independent enrichment. This efficient and specific labeling method enables enrichment of 5-hmC with extremely low background and high-throughput epigenomic mapping via next-generation sequencing.

Cattura selettiva di 5 hydroxymethylcytosine dal DNA genomico

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...

Biologia

The Detection of 5-Hydroxymethylcytosine in Neural Stem Cells and Brains of Mice

Multiple&#160;DNA modifications have been identified in the mammalian genome. Of that, 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic mechanisms have been intensively studied. 5-hydroxymethylcytosine displays dynamic features during embryonic and postnatal development of the brain, plays a regulatory function in gene expression, and is involved in multiple neurological disorders. Here, we describe the detailed methods including immunofluorescence staining and&#160;DNA dot-blot to detect 5-hydroxymethylcytosine in cultured cells and brain tissues of mouse.

Here, we present a protocol to detect 5-hydroxymethylcytosine in cells and brain tissues, utilizing immunofluorescence staining and DNA dot-blot methods.

Il rilevamento di 5-Hydroxytethylcytosine in cellule staminali neurali e cervelli di topi

Multiple&#160;DNA modifications have been identified in the mammalian genome. Of that, 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic ...

Detection of Modified Forms of Cytosine Using Sensitive Immunohistochemistry

Methylation of cytosine bases (5-methylcytosine, 5mC) occurring in vertebrate genomes is usually associated with transcriptional silencing. 5-hydroxylmethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC), and 5-carboxylcytosine (5caC) are the recently discovered modified cytosine bases produced by enzymatic oxidation of 5mC, whose biological functions remain relatively obscure. A number of approaches ranging from biochemical to antibody based techniques have been employed to study the genomic distribution and global content of these modifications in various biological systems. Although some of these approaches can be useful for quantitative assessment of these modified forms of 5mC, most of these methods do not provide any spatial information regarding the distribution of these DNA modifications in different cell types, required for correct understanding of their functional roles. Here we present a highly sensitive method for immunochemical detection of the modified forms of cytosine. This method permits co-detection of these epigenetic marks with protein lineage markers and can be employed to study their nuclear localization, thus, contributing to deciphering their potential biological roles in different experimental contexts.

Herein we describe a sensitive immunochemical method for mapping the spatial distribution of 5mC oxidation derivatives based on the use of peroxidase-conjugated secondary antibodies and tyramide signal amplification.

Il rilevamento di forme modificate di Citosina Uso Sensitive immunoistochimica

Methylation of cytosine bases (5-methylcytosine, 5mC) occurring in vertebrate genomes is usually associated with transcriptional silencing. ...

Cryosectioning and Immunostaining of Mouse Retina

Tissue sectioning and immunohistochemistry are essential techniques in histological and pathological studies of retinal diseases using animal models. These methods enable detailed examinations of tissue morphologies and the localization of specific proteins within the tissue, which provide valuable insights into disease processes and mechanisms. Mice are the most widely used model for this purpose. However, because mouse eyeballs are small and mouse retinas are extremely delicate tissues, obtaining high-quality retinal sections and immunostaining images from mouse eyeballs is typically challenging. This study describes an improved protocol for cryosectioning mouse retinas and performing immunohistochemistry. An essential point of this protocol involves coating the eyeball with a layer of super glue, which prevents deformation of the eyeballs during the processes of cornea removal, lens extraction, and embedding. This step ensures the integrity of retinal morphologies is well preserved. This protocol highlights critical technical considerations and optimization strategies for consistently producing high-quality retinal sections and achieving excellent immunostaining results.

A protocol for preparing mouse retinal cryosections and performing immunostaining on photoreceptors is described. This article enables researchers to consistently produce mouse retinal frozen sections with well-preserved morphology and high-quality immunostaining results.

Criosezione e immunocolorazione della retina del topo

Tissue sectioning and immunohistochemistry are essential techniques in histological and pathological studies of retinal diseases using animal models. ...

5-Methylcytosine Dot Blot to Determine the Extent of DNA Methylation

Start this procedure by denaturing the isolated DNA in 0.1 molar sodium hydroxide for 10 minutes at 95 degrees Celsius. Neutralize the DNA with 1 molar ammonium acetate on ice, and then dilute two-fold with double-distilled water.
The most critical step in the dot blot is the spotting of the samples onto the membrane, do it slowly, and carefully. Try to minimize each spotted area to 3 to 4 millimeters in diameter.
Using a narrow-mouth pipette tip, carefully spot 2 microliters of the serial diluted genomic DNA onto a positively-charged nylon membrane at the center of the grid. Blot the membrane at 80 degrees Celsius for 30 minutes. Next, block the non-specific antibody binding sites by soaking the membrane in 5% BSA in TBST in a 10-centimeter Petri dish for 1 hour at room temperature with gentle shaking.
After 1 hour, wash the membrane three times in TBST for 5 minutes each time. Incubate the membrane with a mouse anti-5-methylcytosine monoclonal antibody in TBST at 4 degrees Celsius overnight. On the following day, wash the membrane three times in TBST for 5 minutes each time.
Then, incubate with a secondary antibody &#8212; horseradish peroxidase-conjugated sheep anti-mouse immunoglobulin G in TBST for one hour at room temperature. After washing the membrane in TBST as before, add the enzyme substrate to the membrane, and incubate for 5 to 10 minutes. Finally, visualize the secondary antibody signal using a chemiluminescence kit according to the manufacturer&#39;s instructions.

Rilevazione di Immunohistochemical di 5-metilcitosina e 5-idrossimetilcitosina nello sviluppo e Retina di topo Postmitotic

Riepilogo

Esplora Altri Video

Capitoli in questo video