对斑马鱼幼虫施用挥发性麻醉剂进行行为观察

该协议提供了一种可访问的方法，用于创建气密环境，以对斑马鱼幼虫进行挥发性麻醉剂以进行行为实验。

本研究描述了一种在行为实验中对斑马鱼幼虫施用挥发性麻醉剂（如异氟烷和七氟烷）的独特方法。虽然斑马鱼作为脊椎动物模式生物具有许多优势——包括复杂的行为、遗传易处理性、透明的胚胎和快速发育——但它们在研究挥发性麻醉剂方面的用途一直受到限制。挥发性麻醉剂的给药通常需要复杂或笨重的设备，这些设备可能无法广泛使用，这为水性模式生物中挥发性麻醉剂的药理学研究造成了障碍。该方法提出了一种简单的技术，使用粘性硅胶片在玻璃 96 孔板上形成气密密封。通过评估自发运动进行验证，结果显示密封孔和开放孔在 90 分钟内没有显着差异。此外，通过 HPLC 测量，麻醉剂浓度随着时间的推移保持稳定。代表性结果包括七氟烷中位有效浓度 （EC₅₀） 值的实验测定。本研究为使用挥发性麻醉剂的药理学实验提供了一种简单易行的方法，该方法可以很容易地适应研究其他挥发性药物和实验终点。

非水生动物模型（蠕虫、苍蝇、啮齿动物、兔子、灵长类动物等）历来是研究麻醉药理学最常用的模型。在这些物种中的每一个中，挥发性麻醉剂（通过吸入气体给药）远低于静脉麻醉剂（通过静脉内或腹膜内途径^给药）1 的挑战性。除了简单地静脉注射药物的技术挑战外，使用挥发性药物比静脉注射药物更容易实现稳定的麻醉状态²。

对幼体水生物种进行静脉麻醉可以通过从其周围的水性介质扩散来实现 ^3,4，因此更类似于对非水生物种使用挥发性麻醉剂。多年来，蝌蚪 （Xenopus laevis） 是研究麻醉剂的首选模型，因为它易于给药，并且通过将麻醉剂简单地添加到人工池水中即可实现稳态药代动力学 ^5,6。然而，由于需要气密装置，因此该模型中挥发性麻醉剂的研究示例相对较少 ^7,8.

近年来，斑马鱼已成为静脉麻醉剂研究的首选模型，因为除了其充分描述的复杂行为和商业单位可以观察这些行为之外，还具有同样易于给药的优势⁹。最近的许多研究都使用这种市售的观察装置来筛选神经活性化合物，包括麻醉剂，使用 96 孔和 24 孔板格式来量化斑马鱼幼虫的行为 4,10,11,12,13,14,15 .幼虫阶段特别适合药理学研究，因为它们能够评估许多行为反应、体积小、高通量兼容性和特征明确的神经回路 ^9,16,17。然而，斑马鱼模型中的这些麻醉剂研究的一个显着局限性是挥发性麻醉剂的给药相对困难。这种局限性导致挥发性药物和静脉注射药物之间比较的例子很少 ^4,15,18。能够在单个动物模型中轻松研究和比较两类麻醉剂增加了一个重要工具，以促进所有类别的麻醉药理学研究。

传统上，水生物种静脉麻醉剂的研究需要专门的、通常是定制的设备，这些设备可能难以使用或气密性不足，以防止麻醉剂在实验期间流失。此处描述的程序提供了一种易于获得的替代方法，可在玻璃室中产生气密密封，适用于使用商业观察装置观察斑马鱼幼鱼的行为（见 材料表）。

所有斑马鱼实验均按照机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 批准的动物使用方案进行。成年斑马鱼在宾夕法尼亚大学实验室动物资源 （ULAR） 的监督下被饲养在宾夕法尼亚大学的水生设施中。图宾根长鳍野生型斑马鱼在所有实验中均在内部饲养，并在标准饲养条件下以 13/11 小时的光照/黑暗周期维持，直到它们达到受精后 5 天 （dpf）。使用生物重复进行实验，离合器来自不同的交配对，以确保足够的生物多样性。本研究中使用的试剂和设备的详细信息列在 材料表中。

1. 粘合硅胶片材的制作

注意：这种材料的等效物（硅胶片加粘合剂）可以商业采购，但通常成本更高，可用性更低。

1. 将 0.5 毫米硅胶片铺放在干净、平坦的表面上。
2. 检查床单是否有任何折痕，并尽可能避免它们。
   注意：带有折痕的硅胶片可能无法充分粘附在胶带上，并可能导致孔密封不充分和/或斑马鱼的可视化效果不佳。
3. 用 70% 的酒精清洁床单，去除任何油或碎屑并晾干。
4. 使用涂抹器（如画笔）在硅胶片上涂上一层薄而均匀的粘合剂底漆。为避免过度涂抹，请在胶粘剂促进剂快速干燥时分小段工作（在 1-5 秒内凝固）。
   注意：如果没有这种粘合促进剂，胶带将无法充分粘附在硅胶片上。
5. 应用胶粘剂促进剂后，将双面胶带与硅胶片对齐，使纸背朝上。
6. 使用滚筒将胶带逐渐贴在硅胶上，以平滑表面并去除气泡（初次涂抹后，硅胶面朝上将有助于观察和去除气泡）。
7. 让胶粘剂促进剂在平坦的表面上完全固化 24 小时。
8. 将粘合硅胶切成至少 10 毫米宽的条带（孔径为 7.5 毫米，每侧重叠）。
   注意：当每隔一行使用孔板时，条带的较大差异不会对相邻行中的孔产生负面影响，这不仅可能使应用更容易，而且对于实现孔的整个圆周密封也是必要的。
   1. 确保条带足够长，至少覆盖孔板一行的宽度。
      注：如果使用非 96 孔的孔板，例如 24 孔或 48 孔板，则可以调整或切割联排尺寸以适合板的特定尺寸，从而确保无论板尺寸如何都能得到适当的覆盖。

2. 溶液的制备

注意：挥发性麻醉剂的所有储备液和测定液均在实验前制备，以避免挥发性化合物浓度的损失。

1. 对于每种溶液（储备液或工作溶液），向 HPLC 或闪烁瓶中加入一定体积的非挥发性溶剂（E3 胚胎水、DMSO 等），当与挥发性麻醉剂的最终稀释液混合时，总体积将充分填充小瓶，留下最小的顶部空间（参见 图 1A）。
2. 用 Hamilton 气密注射器添加挥发性麻醉剂并快速密封小瓶。
   注：带隔垫盖的小瓶中的储备液可用于通过气密注射器转移溶液来促进进一步稀释。
3. 然后，根据需要混合小瓶（涡旋、超声处理），并在准备斑马鱼板时暂时储存它们。

3. 行为实验的设置

注意：协议的这一步可能需要一些练习。建议在没有鱼或含有贵重材料的溶液的情况下工作，直到对该技术感到满意为止。

1. 将一只幼虫斑马鱼 （5 dpf） 转移到玻璃 96 孔板的每隔一行中。
   注意：将每隔一行留空可以减少溢出对相邻孔造成污染的可能性，因为孔在步骤 3.4 中被密封。
2. 小心地从每个孔中取出 E3 溶液。这可以一次一行完成，也可以在整个板子上完成，如果它能够快速工作。
   注意：幼虫从溶液中脱离的持续时间被最小化，以减少潜在的压力。可以根据不同的实验需要使用替代程序，包括在添加含药物的溶液之前仅部分去除溶液以尽量减少压力。该方案应适应实验的需要，包括给予动物的平衡时间以补偿任何潜在的压力、溶液混合效率和含药物溶液浓度的准确性，如果在添加工作溶液之前没有去除所有 E3。
3. 接下来，使用移液管用实验溶液填充行中的每个孔。注意不要引入气泡。每个井都溢出（图 1B）。
4. 使用步骤 1 中制作的粘性硅胶条，快速向下按压硅胶条（图 1C）。这有助于防止气泡形成并防止鱼溢出到相邻的井中。
5. 用力按压板的顶部，确保每个孔都密封。
6. 重复步骤 2-5，直到更换溶液并且孔板每隔一行的孔被密封（图 1D）。
7. 轻轻翻转板并检查是否有气泡。
   注意：气泡的存在会掩盖斑马鱼运动的可视化。
8. 将板放入行为观察单元（硅胶粘合剂面朝下）并进行行为实验（有关详细信息，请参见结果部分）。

与传统开孔观察的比较
为了评估粘性密封是否对自发运动有任何影响，对开放孔和密封孔中的对照进行了比较。如图 2A 所示，在本文描述的实验中使用的标准 ~30 分钟持续时间内，这些组之间的运动没有观察到统计学上的显着差异。认识到其他实验范式可能需要更长的实验暴露，进行了 2 小时的时间过程，显示直到 2 小时标记之前运动没有统计差异（参见 图 2B）。较长的实验持续时间可能会导致更大的运动差异。以前的研究已经量化了缺氧对游泳行为的不利影响¹⁹，最终损害了实验结果的完整性。因此，据推测，与开井对照相比，缺氧和/或 CO₂ 的产生是 SM 中这种偏差的最可能原因。不幸的是，防止挥发性麻醉剂从封闭井中损失的气密密封也阻止了其他气体扩散到封闭溶液中或从封闭溶液中扩散出来。当然，这意味着 CO₂ 和氧气的扩散受到限制，因为它们分别由鱼产生和消耗。对于此方法可能的实验长度，这是一个重要的限制。同样重要的是要注意，随着时间的推移，以前没有气泡的孔中开始形成小气泡，这可能是由于新陈代谢。然而，在测试过程中，这些气泡并没有阻碍软件对斑马鱼的追踪。长达 1.5 小时（加上平衡时间）的实验似乎对这些野生型斑马鱼的 SM 跟踪没有显着影响，但表现出更多运动或其他代谢需求增加的鱼可能不适合这种长度的实验。

随时间变化的挥发性麻醉剂浓度
为了确保挥发性麻醉剂的浓度随时间保持一致，使用不含斑马鱼的孔来测量通过 HPLC 确定的麻醉剂浓度的时间进程。向每个孔中加入相同的溶液，每 15 分钟测量一次七氟烷或异氟烷的浓度，持续 3 小时（每次测量来自不同的孔，而不是从同一孔重复测量）。如图 3 所示，七氟烷（25 °C 时蒸气压为 197 mmHg）在整个时间过程中几乎没有麻醉剂损失，其蒸气压低于异氟烷（25 °C 时蒸气压为 238 mmHg），后者在 3 小时时损失 4%。两种挥发性麻醉剂在 30 分钟到 60 分钟的间隔内都没有显示出明显的损失，这是许多行为实验的典型特征。

七氟烷在斑马鱼幼虫中的效力
该技术已用于测量斑马鱼中挥发性麻醉剂的效力¹⁵，并且可能优于以前使用的其他方法⁴。通过自发运动 （SM） 和诱发运动 （EM） 的测量，七氟烷的中位有效浓度 （EC₅₀） 如图 4 所示。采用密封孔技术，测定 SM 的 EC₅₀ 值为 62 μM （95% CI： 49-81），EM 的 EC 值为 126 μM （95% CI： 81-193）。SM 值与先前报道的 76 μM 的 EC₅₀ 相当 （95% CI： 50-114）。然而，先前报道的 EM 值 240 μM （95% CI： 169-328） 几乎是此处获得的值的两倍⁴。如果不对这种方法进行类似的 HPLC 研究（真空润滑脂和玻璃盖玻片以形成气密密封），则无法确定这种差异是否是由于挥发性麻醉剂随着时间的推移而损失造成的。然而，这是一个合理的假设，特别是考虑到 EM（声学敲击）的刺激是在行为观察时间结束时记录的。无论采用何种密封孔的方法，七氟烷浓度的任何损失都会在以后的时间点产生最大的影响。当然，这些差异可能是由于其他潜在因素造成的，例如斑马鱼的遗传背景。

图 1：关键程序步骤。 （A） 当使用挥发性溶液时，应进行稀释计划，以尽量减少每个样品瓶的顶部空间。（B） 在向含有斑马鱼的实验溶液中加入实验溶液以消除气泡时，会对孔进行过量填充。（C） 硅胶胶条从板的一侧贴到另一侧，以防止空气滞留。（D） 每隔一行用于实验，以防止污染相邻孔。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 2：密封井与开放井的运动比较。 （A） 比较行为单位平衡 15 分钟后从 0 分钟到 4 分钟的总自发运动。受精后 5 天 （dpf） 斑马鱼在开放井 （254 mm， 95% CI： 185-322） 和密封井 （257 mm， 95% CI： 186-326） 中的移动未显示显着差异 （P = 0.374）。（B） 在斑马鱼行为系统中经过 15 分钟的驯化期后，在每半小时开始时，在 4 分钟内观察鱼 （N ≥ 36） 的自发运动（总行进距离）。数据显示为百分比对照（开放井），并与 0 小时时间点进行统计比较 （ANOVA）。使用 <0.05 的 P 值阈值，在 2 小时标记处观察到开放孔和密封孔之间移动的显着差异 （P = 0.0139），以红色突出显示。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 3：七氟烷随时间推移的恢复率。 通过高效液相色谱 （HPLC） 在 3 小时内测定硅酮粘合剂密封玻璃孔板中七氟烷和异氟烷的浓度。回收率百分比（计算为 3 次重复的平均值）显示在图表的下半部分。异氟醚在 3 小时时表现出高达 4% 的浓度损失，这可能是由于与七氟烷（25 °C 时 197 mmHg）相比，其蒸气压（25 °C 时为 238 mmHg）更高。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 4：七氟烷 EC₅₀ 曲线。 密封井中的七氟烷 EC₅₀ 曲线是根据 5 dpf 斑马鱼的自发运动（超过 4 分钟）和引发的运动（声拍后 1 秒）确定的。移动缩放到仅 DMSO 控件。最终的 EC₅₀ 值计算为自发运动 （SM） 为 62 μM （95% CI： 49-81） 和引发运动 （EM） 为 126 μM （95% CI： 81-193）。 请单击此处查看此图的较大版本。

本文介绍了一种对斑马鱼幼鱼轻松施用挥发性麻醉剂（如七氟烷）的方法，该方法用于量化野生型鱼的挥发性麻醉药效力。虽然这种技术在概念上很简单，但需要练习才能确保在短时间内形成一排充分密封、无气泡的井，以最大限度地减少挥发性试剂的损失。由于该方法适用于挥发性化合物，因此不仅需要将有机硅粘合剂小心地涂抹在孔板上，还需要仔细制备实验溶液，以优化挥发性化合物浓度的准确性。

空气滞留会妨碍准确的可视化和跟踪。除了练习密封外，仔细填充和检查每个孔也至关重要，因为密封前存在的任何气泡都不太可能在密封过程中去除。井的过量填充也有助于防止空气滞留在每个井中。然而，过多的溢出会导致鱼意外转移到相邻的井中。如果发生这种情况，请尝试减少过度填充。最大限度地减少过量的溢出不仅有助于鱼无意中转移到相邻的孔中，而且可以提高在存在大量过量溶液的情况下用于密封的粘合剂的有效性。虽然选择这种胶粘剂的部分原因是它能够粘附在潮湿的表面，但从干净干燥的板开始，可以确保没有其他物质干扰粘附，从而提高实验装置的整体完整性。如果在胶粘剂应用、优化过度填充和有机硅胶粘剂应用技术之前很久就没有气泡，气泡仍然存在，这可能是由于使用了太窄的胶条。不够宽的条带可能无法密封，或者密封不充分，无法防止在施工过程中或之后引入空气。该技术的另一个潜在错误是硅胶条产生的密封质量，这可能是由硅胶中的折痕、胶粘剂密封不足（胶粘剂底漆、固化时间不足或应用硅胶前的表面清洁）引起的。尽管胶粘剂本身似乎提供了足够紧密的密封，但如果没有有机硅作为保护背衬，胶粘剂本身可能无法提供足够的防水性，无法在实验期间防止循环水浴。

玻璃板非常适合这种应用，因为与许多塑料²⁰ 不同，它们与挥发性麻醉剂等疏水性物质相容，它们的表面是平坦的（与典型的塑料孔板不同），允许硅胶条粘合，并具有透明底部（与特氟龙和一些塑料板不同）。石英孔板可以为需要更高分辨率成像的实验提供更高的光学清晰度。此处提供的所有示例数据均在 96 孔玻璃板中获得，其他类似板以更大的孔规格在市场上提供，但作者未对这些板进行测试。由于氧气的可用性增加，在更大的井中加入更多的溶液可能会增加使用这种技术进行实验的潜在持续时间，并且也可能促进对老斑马鱼的实验，但以这种方式修改实验需要进一步验证。该技术的其他修改包括将该技术应用于其他行为范式（例如，光等刺激）²¹、各种遗传模型、其他类型的药理学研究（例如，药物的共同给药），甚至可能适应成像研究。

该方法提供了一种简单易用的方法，用于向斑马鱼施用挥发性化合物以进行行为观察。斑马鱼是一种越来越受欢迎的麻醉剂研究模型，特别是静脉内 （IV） 麻醉剂（丙泊酚、依托咪酯、氯胺酮等）。这部分是由于药物给药的便利性，但与对需要目标控制输注模型进行稳态给药的非水生动物模型（蠕虫、苍蝇、啮齿动物、人类等）进行静脉麻醉相比，药代动力学考虑也减少了²。这类似于在这些动物中施用挥发性试剂，就像将动物放入盒子中并让它们吸入与氧气/空气混合的试剂一样简单。对水生动物（斑马鱼、蝌蚪）施用挥发性试剂更为复杂，因为它需要密封的水环境。这种差异往往会划分某些动物模型对某些麻醉剂的使用，但通过这里介绍的方法，两类麻醉剂都可以很容易地输送到同一动物模型。尽管给药途径不同，但能够轻松地在单个模型中比较各种实验范式。这也可以适应挥发性麻醉剂的使用，以利用斑马鱼的其他优势，包括它们的遗传易处理性、快速发育和透明胚胎，这有助于实时观察生理反应。了解挥发性麻醉剂（如异氟烷和七氟烷）对斑马鱼的影响可以增强对其作用机制和副作用的理解。这种新方法为研究斑马鱼中的挥发性麻醉剂提供了一个强大的框架。

作者没有要披露的冲突。

这项工作由麻醉教育与研究基金会 （FAER） 资助。 图 1 是在 BioRender.com 中创建的。