This project was supported by grants NIH NIGMS 8P41 GM103540-28 and P50-GM076516

إعداد 1. عينة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على خلايا CHOK1 في قوارير زراعة الأنسجة باستخدام DMEM تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني و 100 وحدة دولية / مل من البنسلين 50 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين. احتضان الخلايا في حاضنة ترطيب 5٪ CO 2 عند 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصاد ومن ثم لوحة خلايا CHOK1 على 14 مم الصغيرة بشكل جيد مع سمك سطح 0.16 ملم. خلايا البذور لكثافة المثلى للتصوير، حوالي 60-70٪ confluency. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان خلايا بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2. غسل الخلايا ثلاث مرات في HBSS (هانك مخزنة محلول ملحي)، واحتضان الخلايا في محلول يحتوي على 50 نانومتر من Lysotracker DND26 الأخضر و 150 نيوتن متر من تويولين تعقب الأخضر. احتضان الخلايا لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية. خطوة اختيارية: قبل الحضانة، وتؤدي إلى وصمة عار إضافية مع مصفوفة الميتوكوندريا صبغ تلطيخ (25 نانومتر). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا ثلاث مرات في HBSS لإزالة أي صبغة غير منضم. إضافة جديدة متوسطة النمو DMEM قبل ايماججي الخلايا. </li></ol> 2. المجهر تكوينات يتم تجميع المجهر لتتبع الجسيمات موضح في البروتوكول الفيديو على إطار المجهر المقلوب المتاحة تجاريا (الشكل 4). لكن وحدات تجارية ل3D تتبع الجسيمات المداري هي متاحة الآن. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الحرباء-II المتماسك الترا تي: سا الفيمتو ثانية مصدر ضوء الليزر الإثارة، مع الانضباطي نطاق الطول الموجي الناتج بين 690 نانومتر 1،040 نانومتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأكد من أن يتم محاذاة شعاع الليزر في ميناء الخلفي للالمجهر باستخدام المرايا المغلفة الأشعة تحت الحمراء. والموهن شعاع الليزر باستخدام الدورية لوحة نصف موجة تليها المستقطب الخطي الكالسيت. تخفيف شعاع بحيث متوسط ​​القوة في العينة ما بين 0.5 و 2 ميغاواط. ملاحظة: وينعكس شعاع الليزر من قبل زوج من الجلفانومتر الحركية دفعتها المرايا التي تسمح السيطرة على الموقف ومسار شعاع تركيزا في الطائرة العينة. فيتكوين نموذجي يتم توسيع موازى شعاع الليزر الخروج من المرايا الجلفانومتر (10X) يمر شعاع المتوسع، قبل الدخول في الجزء الخلفي من الهدف المجهر بعد التفكير في تمرير القصير مزدوج اللون المرآة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع ضوء مضان من العينة عن طريق وضع الهدف العددي ارتفاع المياه الفتحة (60X، NA 1.2) في مسار الضوء. اختيار مرشح مضان مكعب وفقا لموجات الانبعاثات المطلوبة في التكوين إما واحد أو اثنين من القناة. توظف مرشحات ممر الموجة الانبعاثات لزيادة تحديد النطاق الطيفي مضان المنبعثة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع العينة على مرحلة الآلية، وضبط حركة رائعة من الهدف المجهر باستخدام وحدة تحكم بيزو موضوعي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توجيه الضوء من المكعب مرشح في أنابيب مضخم حيث يتم التمييز الإشارة وإرسالها إلى I / O بطاقة الحصول على البيانات الرقمية. ولدت الحاسوب الطول الموجي هي الناتج التناظرية من بطاقة I / O هي ويقوم بتقديم ملاحظة:إد إلى الماسحات الضوئية السيطرة الإلكترونيات. يتم قياس مدخلات الفوتون عد من photomultipliers وإشارة خرج إلى الماسحات الضوئية والتحكم عن طريق بطاقة I / O عن طريق مختبر ديناميات الإسفار SimFCS البرمجيات. </li></ol> 3. التصوير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الخلايا على المسرح والتركيز باستخدام تنتقل الإضاءة الخفيفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التحول إلى التصوير النقطية مسح لتحديد الخلايا التي أدرجت الصبغة وتصور ميكروتثبول الأساسية. تحديد المنطقة الأولى حيث حركة حويصلة موجودة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة يتم تحديدها لحويصلة معزولة، تعيين المعلمات التالية لتتبع المداري: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد نصف قطر المدار لتحديد حجم مسح دائري وفقا لحجم الجسيمات يجري تعقب. لباعث نقطة، تعيين نصف قطر المدار يساوي وسطه من وظيفة نقطة انتشار (PSF) من شعاع الإثارة لتعظيم حساسية واستجابة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين المحوريتنأى لتحديد المسافة بين اثنين مدارات التي يتم تنفيذها في توطين موقف الجسيمات على طول الاتجاه المحوري. تعيين المسافة المحورية ل1.5-3 أضعاف الخصر قوات الأمن الفلسطينية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد مدة بقاء فقا للسطوع من الجسيمات لضبط الوقت الذي يقضيه في كل نقطة من المدار، التي ستحدد أيضا معدل تبيض صورة. استخدام مدة انتظار بين 10-100 μsec. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين عدد من النقاط في كل المدار إلى 64 أو 128 لانتاج مدار فترات في حدود 4-32 مللي ثانية وتقديم قرار زمنية عالية لتحديد موقف الجسيمات. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغيير العاصمة تعويض إشارة أرسلت إلى المرايا لمركز شعاع على الجسيمات من خلال واجهة المستخدم الرسومية عبر مجموعة المؤشر في الصورة الممسوحة ضوئيا-النقطية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء تتبع عن طريق التحول من وضع المجهر النقطية التصوير لمسح المداري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تفعيل الملاحظات والبيانات المجموعة. </li></ol> 4. Trajectتحليل أوري <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام البرنامج لعرض مضان جمعها في كل نقطة على طول المدار وعند كل نقطة زمنية في شكل &quot;السجاد كثافة. كثافة جمعت على طول السجادة تقدم معلومات عن تفاعل الجسيمات مع أجسام لامعة أخرى. استخدام البرنامج لعرض كل المعلومات الخاصة بالمسارات (أي نزوح DC مع مرور الوقت من س، ذ الماسحات الضوئية وض -piezo) فضلا عن كثافة مضان جمعها من أنبوب مضخم مع مرور الوقت في شكل سلاسل زمنية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام تمثيل السلاسل الزمنية والمعلومات &quot;السجاد كثافة&quot; فقط لتحديد المنطقة ذات الاهتمام في هذا المسار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام البرنامج لعرض الإسقاط 2D من الجزء المحدد من مسار الجسيمات. تحديد الضوابط المناسبة للون رمز مسار وفقا لكثافة الجسيمات مضان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد الخيار لعرض عالمادة مسار في 3D، ولون رمز وفقا لكثافة مضان. تدوير في مسار 3D باستخدام عناصر التحكم على تصور ملامح من الحركة يحلول على طول أنيبيب. </li></ol>

<ol>
	<li>So, P. T., Dong, C. Y., Masters, B. R., Berland, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+photon+excitation+fluorescence+microscopy.">Two photon excitation fluorescence microscopy.</a> Annu Rev Biomed Eng. 2, 399-429 (2000).</li><li>Dupont, A., Lamb, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+three+dimensional+single+particle+tracking.">Nanoscale three dimensional single particle tracking.</a> Nanoscale. 3, 4532-4541 (2011).</li><li>Estrada, L. C., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+nanometer+images+of+biological+fibers+by+directed+motion+of+gold+nanoparticles.">3D nanometer images of biological fibers by directed motion of gold nanoparticles.</a> Nano Lett. 11, 4656-4660 (2011).</li><li>Kis-Petikova, K., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distance+measurement+by+circular+scanning+of+the+excitation+beam+in+the+two+photon+microscope.">Distance measurement by circular scanning of the excitation beam in the two photon microscope.</a> Microscopy Research and Technique. 63, 34-49 (2004).</li><li>Levi, V., Ruan, Q., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3+D+particle+tracking+in+a+two+photon+microscope+application+to+the+study+of+molecular+dynamics+in+cells.">3 D particle tracking in a two photon microscope application to the study of molecular dynamics in cells.</a> Biophys J. 88, 2919-2928 (2005).</li><li>Lund, F. W., Wustner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+single+particle+tracking+and+temporal+image+correlation+spectroscopy+for+quantitative+analysis+of+endosome+motility.">A comparison of single particle tracking and temporal image correlation spectroscopy for quantitative analysis of endosome motility.</a> Journal of Microscopy. 252, 169-188 (2013).</li><li>Nath, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spreading+of+Neurodegenerative+Pathology+via+Neuron+to+Neuron+Transmission+of+beta+Amyloid.">Spreading of Neurodegenerative Pathology via Neuron to Neuron Transmission of beta Amyloid.</a> Journal of Neuroscience. 32, 8767-8777 (2012).</li><li>Balint, S., Vilanova, I. V., Alvarez, A. S., Lakadamyali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+live+cell+and+superresolution+microscopy+reveals+cargo+transport+dynamics+at+microtubule+intersections.">Correlative live cell and superresolution microscopy reveals cargo transport dynamics at microtubule intersections.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 3375-3380 (2013).</li><li>Huotari, J., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endosome+maturation.">Endosome maturation.</a> Embo Journal. 30, 3481-3500 (2011).</li><li>Ragan, T., So, P. T., Kwon, H. S., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+particle+tracking+on+the+two+photon+microscope.">3D particle tracking on the two photon microscope.</a> Multiphoton Microscopy in the Biomedical Sciences. 2, 247-258 (2001).</li><li>Konig, K., So, P. T. C., Mantulin, W. W., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+response+to+near-infrared+femtosecond+laser+pulses+in+two+photon+microscopes.">Cellular response to near-infrared femtosecond laser pulses in two photon microscopes.</a> Optics Letters. 22, 135-136 (1997).</li><li>Caviston, J. P., Holzbaur, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+motors+at+the+intersection+of+trafficking+and+transport.">Microtubule motors at the intersection of trafficking and transport.</a> Trends Cell Biol. 16, 530-537 (2006).</li><li>Cardarelli, F., Lanzano, L., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+directed+molecular+motion+in+the+nuclear+pore+complex+of+live+cells.">Capturing directed molecular motion in the nuclear pore complex of live cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 9863-9868 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

على الرغم من تقدمات هائلة من تقنيات مضان المجهري وأدوات القياس على مدى السنوات الماضية، تحقيق مسارات الجسيمات الفلورية في ثلاثة أبعاد مع قرار زمنية عالية ظلت تحديا في هذا المجال. إذا تم تحقيق ارتفاع القرار الزماني الجسيمات تتبع في بعدين، والإرشاد إلى الاتجاه المحوري يجلب عادة ما يكون انخفاض كبير في استجابة التردد للنظام 10. في هذا البروتوكول الفيديو ركزنا على تطبيق الإيضاح تتبع جسيم الفردية في ثلاثة أبعاد داخل الخلية الحية مع قرار زمنية عالية (32 ميللي ثانية في هذه التجربة) باستخدام مجهر ثنائي الفوتون. الإعداد المطلوبة لأداء هذه التجربة متاحة عادة لأداء مختبرات الفحص المجهري ليزر. كلاهما أداة إضافات ل 3D تتبع المداري فضلا عن برامج التحكم المتاحة في السوق، لالمجليزر ل المجاهر المسح مثل تلك المصنعة من قبل أوليمبوس. استخدام الطاقة العالية مصدر ليزر الأشعة تحت الحمراء نابض، حيث تتوفر المفيد في تصميم الإعداد التجريبية لأنه لا يتطلب إلغاء المسح من مضان المنبعثة. وعلاوة على ذلك وقد تجلى ذلك في الماضي أن التشعيع بالأشعة تحت الحمراء هو أكثر اعتدالا تجاه الخلية، في ظل ظروف معينة 11، وبالنظر إلى الحد من مضان من التركيز والصور التبييض. على الرغم من أن تتبع سريع من الجسيمات الفلورية في بعدين لا يمكن أن يؤديها باستخدام كاميرا حساسة، وغياب أي معلومات ثلاثية الأبعاد يمكن أن يكون في كثير من الأحيان الحد في تفسير معنى فيزيائي حيوي للمعلومات المسار. على سبيل المثال، الحويصلات تتحرك على طول أنيبيب في كثير من الأحيان تشغيل ضد المناطق ميكروتثبول تقاطع 8،12. في هذا الوضع، واستخدام تقنية تتبع 3D يتغلب على الحد من استخدام التوقعات 2D هيكل 3D. نظرا لاستجابة وقت موضوعي جهاز nanopositioner بيزو لدينا، وفترة الحركة في محور Z يقتصر على حوالي 30 ميللي ثانية، بينما في س، ص الاتجاهات يمكن أن تنخفض إلى بضعة ميللي ثانية. دقة توطين طريقة موازين وإشارة إلى نسبة الضوضاء 4،5. القيد الوحيد على ما يبدو من أسلوب، أي فقدان رأي العالمي للبيئة من الجسيمات، يتم تعويض من إمكانية إعادة بناء كثافة السجاد الزمني 13، تتبع تاريخ تفاعلات الجسيمات الفلورية مع مصادر الفلورسنت المجاورة، عرض إما نفسها أو الانبعاثات الطيفية المختلفة. وتبين لنا أن حركة الجسيمات الحالة، الحويصلات التي تخضع لتوجيه الحركة على طول الأنابيب الدقيقة، والمدعوم من قبل أي kinesins أو dyneins، يمكن اتباعها داخل الخلية الحية بعد تلطيخ باستخدام صبغة متوفرة تجاريا. مؤخرا، كان تتبع 2D من الجسيمات الحالة نيوسمعجبا إلى فائقة الدقة التصوير لشبكة أنيبيب، في جهود الكشف عن الطرق التي تأخذ في الحويصلات-أنيبيب أنيبيب التقاطعات 8. مسارات 3D من الجسيمات الحالة تعرض سلوكا أكثر تعقيدا من الحركة أحادي الاتجاه. على الرغم من أن متوسط ​​توجيه ويمكن ملاحظة الحركة، والانحناء، الالتواء ويمكن ملاحظة التناوب المحتملة على طول الأنابيب من هذه المسارات. حددنا اثنين من الخطوات الحاسمة في أداء هذه التجارب: أولا، من الضروري لتحقيق كثافة وضع العلامات من الجسيمات الحالة التي هي في نفس الوقت مرتفعة بما يكفي للحصول على جزيئات الملون بألوان زاهية، وأنه في الوقت نفسه يوفر كثافة الجسيمات منخفضة بما يكفي للسماح تتبع الجزيئات الفردية. في حالة اثنين من جزيئات المعبر، قد المجهر التحول من الجسيمات احد إلى واحد آخر في حين تتبع. الخطوة الحاسمة الثانية تتعلق اختيار الوقت يسكن بكسل، مما يسمح أن يكون توازن معقولتوين إشارة إلى ارتفاع نسبة الضوضاء وسرعة تتبع. وقد لاحظنا أن سرعة تتبع في ترتيب 32 ميللي ثانية لكل دورة تتبع تكفي عادة لمتابعة الجسيمات الحالة تمر الحركة توجه بسرعة بسرعة أقل من 1 ميكرون / ثانية. باختصار، تتبع المداري يسمح لقياس في ثلاثة أبعاد ومع قرار الزمني لل&lt;40 مللي ثانية في الحركة داخل الخلايا حويصلات fluorescently المسمى. تتبع المداري 3D لديه القدرة على أن تستخدم في المستقبل لدراسة مختلف العمليات الخلوية ديناميكية عالية مثل لنا دراسة ديناميات الكروماتين في الوقت الحقيقي النسخ ونشر النانوية plasmonic في الوسط بين الخلايا.

وقد تم تطوير عدد كبير من النهج حتى الآن لتعقب جزيئات الفلورسنت في ثلاثة أبعاد باستخدام المجهر. معظم المناهج تعتمد على استخدام كاميرات سريعة، مناسبة بشكل مثالي لتتبع في بعدين، جنبا إلى جنب مع التعديلات عادة مخصصة للبصريات انبعاث المجهر لتحقيق تتبع في الاتجاه المحوري. المجاهر المسح بالليزر (إما مبائر أو اثنين من الفوتونات) تقليديا يمكن تتبع الجسيمات الفلورية عن طريق إجراء تسلسل وقت ض مداخن، على الرغم من أن هذه العملية هي عادة وقتا طويلا، وغلة قرار زمنية معقولة (10 هرتز) فقط إذا كانت الجسيمات يجري تعقب هو أبقى في وسط منطقة التصوير النقطية الصغيرة من خلال آلية ردود فعل نشطة 2. فكرة تأمين في أن الجسيمات هي قاعدة تتبع طريقة المداري. بدلا من خطوط المسح مسح يتم تنفيذ مدار دائري حول الجسيمات الفلورية. كثافة مضان على طولالمدار يموضع بالضبط موقف الجسيمات 4. ويمكن بعد ذلك الموقف مترجم من الجسيمات أن تستخدم لتحفيز الماسحات الضوئية المجهر وإعادة مركز المدار على موقف الجسيمات. هي التي تحرك الماسحات الضوئية الجلفانومتر المجهر من قبل الجهد التناظرية. المكون AC هذا الجهد تتيح أداء مدار مع تركيز شعاع الليزر، أي الجيب وجيب التمام موجة تطبيقها على X و Y مسح المرايا سيسمح أداء مدار دائري. العاصمة إزاحة إشارة يسهل تغيير موقف مركز المدار. مرة واحدة يتم تحديد فترة المدار ويتم تكوين الموجي للإشارة AC، يحتاج نظام التغذية المرتدة لتحديث فقط المكون DC للإشارة. مطلوب وهناك برامج قادرة على قراءة إشارة الفلورسنت التي تم جمعها من كشف للسيطرة على الماسحات الضوئية وأجهزة الكشف، لحساب الموقف من الجسيمات وتحديث DC خارجتعيين. عن ردود الفعل الناجح التصوير اختيار دقيق للمعلمات المدار (حجم وتوقيت) مطلوب وهذه المعايير يجب أن يتم تعديلها بناء على خصائص الجسيمات الفلورية أنه من الضروري أن تتبع. وقد وصفت الأسس الفيزيائية والرياضية لهذه التقنية في الماضي 4،5 لكل من 2D و 3D التطبيقات. في هذا البروتوكول وصفنا لفترة وجيزة مكونات الأجهزة الرئيسية للالإعداد، وبمزيد من التفصيل اختيار المعلمات وإعداد العينات اللازمة لتجربة نموذجية السماح لنا بعد النزوح من يحلول في القرار الزماني عالية داخل الخلية الحية.

<table><tbody><tr><td>Lysotracker DND 26</td><td>Life Technologies</td><td>L-7526</td><td></td></tr><tr><td>Tubuline tracker Green</td><td>Life Technologies</td><td>T34075</td><td></td></tr><tr><td>Mitotracker RED</td><td>Life Technologies</td><td>M7512</td><td></td></tr><tr><td>Coherent Chamelon- ultra II TI</td><td>Coherent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glan Taylor Calcite Polarizer</td><td>Melles Griot</td><td>03PTA001</td><td></td></tr><tr><td>Galvanometer-motor mirror</td><td>Cambridge Technologies</td><td>M 6350</td><td></td></tr><tr><td>Dichroic mirror</td><td>Chroma Technologies</td><td>700 DCSPXR</td><td></td></tr><tr><td>Motorized stage</td><td>ASI</td><td>MS2000</td><td></td></tr><tr><td>Piezo&amp;nbsp;</td><td>PI</td><td>P721-LLQ</td><td></td></tr><tr><td>Photomultiplier tube</td><td>Hamamatsu</td><td>H7422P-40</td><td></td></tr><tr><td>Data acquisition card</td><td>IO tech</td><td>PCI 1128-4000</td><td></td></tr><tr><td>Imaging software</td><td>LFD</td><td>Global for images-SimFCS</td><td></td></tr></tbody></table>

3d orbital tracking in a modified two-photon microscope: an application to the tracking of intracellular vesicles

والهدف من هذا البروتوكول هو الفيديو لمناقشة كيفية تنفيذ وتحليل الفلورسنت المدارية التجربة تتبع الجسيمات ثلاثية الأبعاد باستخدام تعديل ثنائي الفوتون المجهر 1. على العكس من الأساليب التقليدية (مسح النقطية أو حقل واسع بناء على كومة من الإطارات)، تتبع المداري 3D يسمح لحصر ومتابعة مع مكانية عالية (10 دقة نانومتر) والقرار الزماني (استجابة التردد 50 هرتز) من تشريد 3D الجسيمات الفلورية تتحرك على طول جداول من مئات ميكرون 2. وتستند هذه الطريقة على خوارزمية ردود الفعل التي تسيطر على الأجهزة من ثنائي الفوتون مجهر المسح بالليزر من أجل أداء مدار دائري حول الكائن لتعقبها: فإن آلية التغذية المرتدة حفاظ على الكائن الفلورسنت في المركز عن طريق التحكم في تشريد مسح شعاع 3-5. للتدليل على مزايا هذه التقنية، تابعنا على عضية تتحرك بسرعة، ويحلول، داخل حركةتعيشان خلية 6،7. كانت مطلية خلايا وفقا لبروتوكولات القياسية، وملطخة باستخدام تجاريا يحلول صباغة. نناقش بإيجاز تكوين الأجهزة وبمزيد من التفصيل برنامج حاسوبي لمراقبة، لإجراء تجربة تتبع المدارية 3D داخل الخلايا الحية. نناقش بالتفصيل المعلمات المطلوبة من أجل السيطرة على مجهر المسح وتمكين الحركة من الحزم في مدار مغلق حول الجسيمات. نستنتج من خلال إظهار كيف أن هذا الأسلوب يمكن استخدامها بشكل فعال لتتبع حركة سريعة من يحلول صفت على طول الأنابيب الدقيقة في 3D داخل الخلية الحية. يمكن أن الجسيمات الحالة تتحرك بسرعات تتراوح بين 0.4-0.5 ميكرون / ثانية، وعرض عادة حركة موجهة على طول شبكة أنيبيب 8.

وفقا لهذا البروتوكول سريع 3D تتبع جسيم واحد لا يمكن أن يؤديها داخل الخلايا الحية باستخدام تعديل المجهر ثنائي الفوتون لتعقب النزوح من الجسيمات الحالة fluorescently المسمى. التجربة أجريت تتكون من تتبع ويحلول معزولة تتحرك داخل الخلية بعد عملية النضج دخلول؛ جسيم داخلي 9. كانت ملطخة الجسيمات الحالة باستخدام صبغة الفلورسنت الأخضر والسعادة في 930 نانومتر استغلال 2 الفوتون الإثارة. وتشير البيانات المتوفرة لدينا أنه من الممكن الحصول على س، ص، ض مسارات النزوح مع القرار الزماني من 32 ميللي ثانية (الشكل 1A). يعرض تحليل السجاد كثافة سجلت على طول كل المدار على مر الزمن (الشكل 1B). خلال تتبع شدة متكاملة من مضان المنبعثة يمكن تسجيل (الشكل 2A). يعرض 3D مسار أعيد بناؤها حركة موجهة، كما يمكن أن يتوقع من حويصلة تتحرك على شبكة أنيبيب. وdditionally، فمن الممكن لربط مسار 3D إلى صورة النقطية مسح للمنطقة المحيطة (الشكل 2B). هذا يؤكد أن حركة الجسيمات على طول اتجاه حزمة أنيبيب. الخلايا كانت ملطخة بالإضافة إلى ذلك مع علامة حمراء لالميتوكوندريا لتسجيل تفاعل نهاية المطاف الحويصلة مع هذه العضيات أثناء حركتهم. فمن الممكن لربط مسار 3D من الجسيمات داخل الخلية (الشكل 3A) إلى السجاد كثافة المسجلة من الانبعاثات mitotracker مضان (الشكل 3B). وهذا يسمح لنا لتسجيل التفاعلات القرب من حويصلة مع شبكة الميتوكوندريا بوصفها وظيفة من وضعها داخل الخلية. ذروة الانبعاثات المسجلة في &quot;قناة الميتوكوندريا&quot; لا تعطي معلومات وظيفية حول الطريقة التي تتفاعل العضيات. يمكن أن توفر المعلومات الوحيدة على الوقت من تفاعلهموموقف المكاني النسبي الكائن الفلورسنت فيما يتعلق الجسيمات التي تتبعها. يتم استخراج هذا الموقف النسبي من زاوية داخل المدار حيث سجلت ذروة الانبعاثات. ويمكن ملاحظة تمثيل تخطيطي للالمجهر استخدمنا لتنفيذ هذه التجربة في الشكل 4. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/51794/51794fig1highres.jpg" /> الرقم 1. المهجرين مقابل مسارات الوقت وكثافة السجاد. أ) X، Y و z يحلول النزوح مقابل آثار الزمن. ب) مسار كثافة (أي شدة جمعت على طول كل محور عمودي مدار دائري هي الوقت) يوفر معلومات عن المناطق المحيطة بها مضان من الجسيمات. النقاط المضيئة خارج محاصر تتوافق مع تفاعلات الجسيمات مع أجسام لامعة أخرى، وترتبط ليقفز في مسار والعشرين<html> مدارات البريد إعادة مراكز على مصدر ألمع مضان. يتوافق المنطقة محاصر إلى جزء من مسار في بين اثنين من القفزات. <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/51794/51794fig2highres.jpg" /> الشكل 2. بعد مسار 3D من يحلول. أ) إعادة الإعمار 3D من جزء من مسار وجمع يحلول باستخدام تتبع الجسيمات. المسار هو ونا مميزا لكثافة مضان جمعها من الجسيمات (أحمر، وارتفاع، الزرقاء، التهم الفوتون منخفضة). جداول محاور هي في نانومتر. لاحظ أن س، ص، ض محاور نطاقات مختلفة. الإسقاط ب) 2D من مسار 3D، وعرض تراكب مسار على رأس أنيبيب تصويرها في خطوط المسح مسح على الفور بعد أن تم جمع مسار. ج) الميتوكوندريا ملطخة mitotracker . إعادة 3 &quot;SRC =&quot; / الملفات / ftp_upload / 51794 / 51794fig3highres.jpg &quot;/&gt; الرقم 3. تمديد تتبع المداري لأكثر من قناة (الإثارة في 930 نانومتر). أ) يستخدم مسار 3D من يحلول داخل الخلية. ب) السجاد كثافة في القناة الخضراء (مضان التي تم جمعها في هذه القناة لتتبع). ج) السجاد كثافة في القناة الحمراء، حيث كانت ملطخة الميتوكوندريا مع مصفوفة الحمراء الفلورسنت صبغ المستهدفة. تظهر المناطق التي يحصل على مسار في اتصال مع الميتوكوندريا (السهام)، والمطبات كثافة في السجاد، وشعاع تدور حول يحلول الصلبان في مصفوفة الميتوكوندريا. <img alt="الرقم 4" src="/files/ftp_upload/51794/51794fig4highres.jpg" /> الرقم 4. الخطط من الإعداد التجريبية: تعديل مجهر ثنائي الفوتون. كان لنا سا الليزر مع مجموعة 690-1،040 نانومتر: التمثيل التخطيطي ليزر انشاء: 2 فوتون تيوتستخدم الطبعه، المستقطب ونصف waveplate للسيطرة على السلطة الإثارة. يتم سرد كافة البنود الأخرى في الشكل باستخدام الاختصارات المشار إليها. استخدمنا الهدف 60X مع NA 1.2.

Watch this Scientific Journal Video about 3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles at JoVE.com

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

In this video protocol we track - at high speed and in three dimensions - fluorescently labeled lysosomes within living cells, using the orbital tracking method in a modified two-photon microscope.

3D تتبع المداري في التعديل المجهر ثنائي الفوتون: دراسة تطبيقية على تتبع من بين الخلايا الحويصلات

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

3d-orbital-tracking-modified-two-photon-microscope-an-application-to

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.2K Views.  University of California, Irvine. In this video protocol we track - at high speed and in three dimensions - fluorescently labeled lysosomes within living cells, using the orbital tracking method in a modified two-photon microscope. 

Video: 3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

Visualization of Endosome Dynamics in Living Nerve Terminals with Four-dimensional Fluorescence Imaging

Four-dimensional (4D) light imaging has been used to study behavior of small structures within motor nerve terminals of the thin transversus abdominis muscle of the garter snake. Raw data comprises time-lapse sequences of 3D z-stacks. Each stack contains 4-20 images acquired with epifluorescence optics at focal planes separated by 400-1,500 nm. Steps in the acquisition of image stacks, such as adjustment of focus, switching of excitation wavelengths, and operation of the digital camera, are automated as much as possible to maximize image rate and minimize tissue damage from light exposure. After acquisition, a set of image stacks is deconvolved to improve spatial resolution, converted to the desired 3D format, and used to create a 4D "movie" that is suitable for variety of computer-based analyses, depending upon the experimental data sought. One application is study of the dynamic behavior of two classes of endosomes found in nerve terminals-macroendosomes (MEs) and acidic endosomes (AEs)-whose sizes (200-800 nm for both types) are at or near the diffraction limit. Access to 3D information at each time point provides several advantages over conventional time-lapse imaging. In particular, size and velocity of movement of structures can be quantified over time without loss of sharp focus. Examples of data from 4D imaging reveal that MEs approach the plasma membrane and disappear, suggesting that they are exocytosed rather than simply moving vertically away from a single plane of focus. Also revealed is putative fusion of MEs and AEs, by visualization of overlap between the two dye-containing structures as viewed in each three orthogonal projections.

Four-dimensional (4D) imaging is utilized to study the behavior and interactions among two types of endosomes in living vertebrate nerve terminals. Movement of these small structures is characterized in three dimensions, permitting confirmation of events such as endosome fusion and exocytosis.

تصور جسيم داخلي حيوية في محطات عصب المعيشة مع رباعية الابعاد التصوير الإسفار

Four-dimensional (4D) light imaging has been used to study behavior of small structures within motor nerve terminals of the thin transversus abdominis ...

Neuroscience

Visualizing Cytoskeleton-Dependent Trafficking of Lipid-Containing Organelles in Drosophila Embryos

Early Drosophila embryos are large cells containing a vast array of conventional and embryo-specific organelles. During the first three hours of embryogenesis, these organelles undergo dramatic movements powered by actin-based cytoplasmic streaming and motor-driven trafficking along microtubules. The development of a multitude of small, organelle-specific fluorescent probes (FPs) makes it possible to visualize a wide range of different lipid-containing structures in any genotype, allowing live imaging without requiring a genetically encoded fluorophore. This protocol shows how to inject vital dyes and molecular probes into Drosophila embryos to monitor the trafficking of specific organelles by live imaging. This approach is demonstrated by labeling lipid droplets (LDs) and following their bulk movement by particle image velocimetry (PIV). This protocol provides a strategy amenable to the study of other organelles, including lysosomes, mitochondria, yolk vesicles, and the ER, and for tracking the motion of individual LDs along microtubules. Using commercially available dyes brings the benefits of separation into the violet/blue and far-red regions of the spectrum. By multiplex co-labeling of organelles and/or cytoskeletal elements via microinjection, all the genetic resources in Drosophila are available for trafficking studies without the need to introduce fluorescently tagged proteins. Unlike genetically encoded fluorophores, which have low quantum yields and bleach easily, many of the available dyes allow for rapid and simultaneous capture of several channels with high photon yields.

Visualizing Cytoskeleton-Dependent Trafficking of Lipid-Containing Organelles in Drosophila Embryos

In the early Drosophila embryo, many organelles are motile. In principle, they can be imaged live via specific fluorescent probes, but the eggshell prevents direct application to the embryo. This protocol describes how to introduce such probes via microinjection, and then analyze bulk organelle motion via particle image velocimetry.

تصور الاتجار المعتمد على الهيكل الخلوي للعضيات المحتوية على الدهون في أجنة ذبابة الفاكهة

Early Drosophila embryos are large cells containing a vast array of conventional and embryo-specific organelles. During the first three hours of ...

Developmental Biology

A Protocol for Real-time 3D Single Particle Tracking

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although various RT-3D-SPT methods have been put forward in recent years, tracking high speed 3D diffusing particles at low photon count rates remains a challenge. Moreover, RT-3D-SPT setups are generally complex and difficult to implement, limiting their widespread application to biological problems. This protocol presents a RT-3D-SPT system named 3D Dynamic Photon Localization Tracking (3D-DyPLoT), which can track particles with high diffusive speed (up to 20 &#181;m2/s) at low photon count rates (down to 10 kHz). 3D-DyPLoT employs a 2D electro-optic deflector (2D-EOD) and a tunable acoustic gradient (TAG) lens to drive a single focused laser spot dynamically in 3D. Combined with an optimized position estimation algorithm, 3D-DyPLoT can lock onto single particles with high tracking speed and high localization precision. Owing to the single excitation and single detection path layout, 3D-DyPLoT is robust and easy to set up. This protocol discusses how to build 3D-DyPLoT step by step. First, the optical layout is described. Next, the system is calibrated and optimized by raster scanning a 190 nm fluorescent bead with the piezoelectric nanopositioner. Finally, to demonstrate real-time 3D tracking ability, 110 nm fluorescent beads are tracked in water.

This protocol details the construction and operation of a real-time 3D single particle tracking microscope capable of tracking nanoscale fluorescent probes at high diffusive speeds and low photon count rates.

بروتوكول لتتبع في الوقت الحقيقي 3D الجسيمات مفردة

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although ...

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, survival, and glial communications. To date, numerous studies have reported that defects in these systems cause various neuronal diseases. Thus, understanding the mechanisms underlying vesicle dynamics may provide influential clues that could aid in the treatment of several neuronal disorders. Here, we describe a method for quantifying vesicle motilities, such as motility distance and rate of movement, using a software plug-in for the ImageJ platform. To obtain images for quantification, we labeled neuronal endosome-lysosome structures with EGFP-tagged vesicle marker proteins and observed the movement of vesicles using a time-lapse microscopy. This method is highly useful and simplify measuring vesicle motility in neurites, such as axons and dendrites, as well as in the soma of both neurons and glial cells. Furthermore, this method can be applied to other cell lines, such as fibroblasts and endothelial cells. This approach could provide a valuable advancement of our understanding of membrane trafficking.

The investigation of membrane trafficking is crucial for understanding neuronal functions. Here, we introduce a method for quantifying vesicle motility in neurons. This is a convenient method that can be adapted to the quantification of membrane trafficking in the nervous system.

كمي من إندوسوم و ليسوسوم التحركات في الخلايا العصبية المستزرعة باستخدام تحقيقات الفلورسنت

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. Single-molecule imaging is gaining momentum as it provides exceptional access to the visualization of individual molecules in living cells. Here, we describe a technique that we developed to perform single-particle tracking photo-activated localization microscopy (sptPALM) in Drosophila larvae. Synaptic communication relies on key presynaptic proteins that act by docking, priming, and promoting the fusion of neurotransmitter-containing vesicles with the plasma membrane. A range of protein-protein and protein-lipid interactions tightly regulates these processes and the presynaptic proteins therefore exhibit changes in mobility associated with each of these key events. Investigating how mobility of these proteins correlates with their physiological function in an intact live animal is essential to understanding their precise mechanism of action. Extracting protein mobility with high resolution in vivo requires overcoming limitations such as optical transparency, accessibility, and penetration depth. We describe how photoconvertible fluorescent proteins tagged to the presynaptic protein Syntaxin-1A can be visualized via slight oblique illumination and tracked at the motor nerve terminal or along the motor neuron axon of the third instar Drosophila larva.

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

Here we illustrate how single molecule photo-activated localization microscopy can be carried out on the motor nerve terminal of a live Drosophila melanogaster third instar larva.

في فيفو تتبع في محطة Presynaptic الأعصاب الحركية المورفولوجية جزيء واحد

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. ...

3D Particle Tracking for Noninvasive In Vivo Analysis of Synaptic Microtubule Dynamics in Dendrites and Neuromuscular Junctions of Drosophila

Microtubules (MTs) play critical roles in neuronal development, but many questions remain about the molecular mechanisms of their regulation and function. Furthermore, despite progress in understanding postsynaptic MTs, much less is known about the contributions of presynaptic MTs to neuronal morphogenesis. In particular, studies of in vivo MT dynamics in Drosophila sensory dendrites yielded significant insights into polymer-level behavior. However, the technical and analytical challenges associated with live imaging of the fly neuromuscular junction (NMJ) have limited comparable studies of presynaptic MT dynamics. Moreover, while there are many highly effective software strategies for automated analysis of MT dynamics in vitro and ex vivo, in vivo data often necessitate significant operator input or entirely manual analysis due to inherently inferior signal-to-noise ratio in images and complex cellular morphology. &#160;To address this, this study optimized a new software platform for automated and unbiased in vivo particle detection. Multiparametric analysis of live time-lapse confocal images of EB1-GFP labeled MTs was performed in both dendrites and the NMJ of Drosophila larvae and found striking differences in MT behaviors. MT dynamics were furthermore analyzed following knockdown of the MT-associated protein (MAP) dTACC, a key regulator of Drosophila synapse development, and identified statistically significant changes in MT dynamics compared to wild type. These results demonstrate that this novel strategy for the automated multiparametric analysis of both pre- and postsynaptic MT dynamics at the polymer-level significantly reduces human-in-the-loop criteria. The study furthermore shows the utility of this method in detecting distinct MT behaviors upon dTACC-knockdown, indicating a possible future application for functional screens of factors that regulate MT dynamics in vivo. Future applications of this method may also focus on elucidating cell type and/or compartment-specific MT behaviors, and multicolor correlative imaging of EB1-GFP with other cellular and subcellular markers of interest.&#160;

This study presents a noninvasive intravital neuronal imaging strategy combined with a new software strategy to achieve automated, unbiased tracking and analysis of in vivo microtubule (MT) plus-end dynamics in the sensory dendrites and the neuromuscular junctions of Drosophila.

Microtubules (MTs) play critical roles in neuronal development, but many questions remain about the molecular mechanisms of their regulation and function. ...

Application of High-speed Super-resolution SPEED Microscopy in Live Primary Cilium

The primary cilium is a microtubule-based protrusion on the surface of many eukaryotic cells and contains a unique complement of proteins that function critically in cell motility and signaling. Since cilia are incapable of synthesizing their own protein, nearly 200 unique ciliary proteins need to be trafficked between the cytosol and primary cilia. However, it is still a technical challenge to map three-dimensional (3D) locations of transport pathways for these proteins in live primary cilia due to the limitations of currently existing techniques. To conquer the challenge, recently we have developed and employed a high-speed virtual 3D super-resolution microscopy, termed single-point edge-excitation sub-diffraction (SPEED) microscopy, to determine the 3D spatial location of transport pathways for both cytosolic and membrane proteins in primary cilia of live cells. In this article, we will demonstrate the detailed setup of SPEED microscopy, the preparation of cells expressing fluorescence-protein-labeled ciliary proteins, the real-time single-molecule tracking of individual proteins in live cilium and the achievement of 3D spatial probability density maps of transport routes for ciliary proteins.

Recently we mapped the three-dimensional (3D) spatial locations of transport routes for various proteins translocating inside primary cilia in live cells. Here this paper details the experimental setup, the process of biological samples and the data analyses for the 3D super-resolution fluorescence imaging approach newly applied in live primary cilia.

تطبيق القرار فائقة السرعة سرعة الفحص المجهري في هدب الأولية الحية

The primary cilium is a microtubule-based protrusion on the surface of many eukaryotic cells and contains a unique complement of proteins that function ...

Biology

4D Microscopy of Yeast

The goal of this protocol is to characterize how membrane compartments form and transform in live cells of budding yeast. Many intracellular compartments in yeast are dynamic, and a full understanding of their properties requires time-lapse imaging. Multi-color 4D confocal fluorescence microscopy is a powerful method for tracking the behavior and composition of an intracellular compartment on a time scale of 5-15 min. Rigorous analysis of compartment dynamics requires the capture of thousands of optical sections. To achieve this aim, photobleaching and phototoxicity are minimized by scanning rapidly at very low laser power, and the pixel dimensions and Z-step intervals are set to the largest values that are compatible with sampling the image at full resolution. The resulting 4D data sets are noisy but can be smoothed by deconvolution. Even with high quality data, the analysis phase is challenging because intracellular structures are often numerous, heterogeneous, and mobile. To meet this need, custom ImageJ plugins were written to array 4D data on a computer screen, identify structures of interest, edit the data to isolate individual structures, quantify the fluorescence time courses, and make movies of the projected Z-stacks. 4D movies are particularly useful for distinguishing stable compartments from transient compartments that turn over by maturation. Such movies can also be used to characterize events such as compartment fusion, and to test the effects of specific mutations or other perturbations.

This protocol describes the analysis of fluorescently labeled intracellular compartments in budding yeast using multi-color 4D (time-lapse 3D) confocal microscopy. The imaging parameters are chosen to capture adequate signals while limiting photodamage. Custom ImageJ plugins allow labeled structures to be tracked and quantitatively analyzed.

4D مجهرية الخميرة

The goal of this protocol is to characterize how membrane compartments form and transform in live cells of budding yeast. Many intracellular compartments ...

Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy of Extracellular Vesicles in Three Dimensions

Extracellular vesicles (EVs) are released by all cell types and play an important role in cell signaling and homeostasis. The visualization of EVs often require indirect methods due to their small diameter (40-250 nm), which is beneath the diffraction limit of typical light microscopy. We have developed a super-resolution microscopy-based visualization of EVs to bypass the diffraction limit in both two and three dimensions. Using this approach, we can resolve the three-dimensional shape of EVs to within +/- 20 nm resolution on the XY-axis and +/- 50 nm resolution along the Z-axis. In conclusion, we propose that super-resolution microscopy be considered as a characterization method of EVs, including exosomes, as well as enveloped viruses.

Direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM) is used to bypass the typical diffraction limit of light microscopy and to view exosomes at the nanometer scale. It can be employed in both two and three dimensions to characterize exosomes.

المجهر المباشر لإعادة البناء البصري العشوائي للحوالق خارج الخلية في ثلاثة أبعاد

Extracellular vesicles (EVs) are released by all cell types and play an important role in cell signaling and homeostasis. The visualization of EVs often ...

Visualization of Vesicle Motilities in Neurons Using Fluorescence Imaging

Source: Tsuruta, F., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/55488">Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes.</a> J. Vis. Exp. (2017).
This video demonstrates how neuronal vesicles are labeled with specific fluorescent proteins to visualize their movement. First, a plasmid coding for a fluorescent protein is incubated with a transfection agent and then introduced into a culture of neurons. Subsequently, images of the neurons are acquired and analyzed to track the vesicles&#39; movement.

تصور حركة الحويصلة في الخلايا العصبية باستخدام التصوير الفلوري

1. Imaging Vesicle Motility

	Prepare the plasmids that will label each type of vesicle. For instance, use EGFP-Rab5 for early endosomes, EGFP-Rab7 for ...