Bu çalışmada kanser önleme ve Texas Araştırma Enstitüsü (CPRIT) ödül RR150044, Welch Vakfı araştırma hibe C-1930 ve ulusal kurumları, sağlık K22 NVK için layık AI110552 tarafından desteklenmiştir. Fon çalışma tasarım, veri toplama ve analizi, yayımlamaya karar veya el yazması hazırlanması herhangi bir rolü yoktu.

Dikkat: P. aeruginosa ve E. faecalistir seviye 2 patojenler ve yanlışlıkla enfeksiyonu önlemek için ve yüzeylere kontaminasyonu en aza indirmek için uygun güvenlik önlemleri alınmalıdır. Tüm medya ve patojenler ile temas gelen malzemeleri sterilize atılır ve/veya gerekir. Daha fazla yönergeleri CDC yayından Biyogüvenlik təhlillər ve Biyomedikal Laboratuvarı (BMBL), 5 edition mevcuttur.
1. hazırlık ve P. aeruginosa Bakımı
<ol><li>Çizgi P. aeruginosa LB (Lysogeny et suyu) agar plaka üzerine donmuş bir stoktan. 16-24 h 37 ° C'de kuluçkaya Not: P. aeruginosa deneyler bir BSL-2 biyolojik Emanet kısırlık sağlamak için kabine içinde gerçekleştirin. Patojen bulaşma veya bulaşma olasılığını en aza indirmek için uygun güvenlik önlemleri kullanın.</li>
	<li>Bu plaka 4 ° C'ye aktarma Bu plaka 4 ° C'de muhafaza ve kültürleri bir hafta kadar aşılamak için kullanılan. Bir hafta sonra arındırılmasına ve plaka atmak ve yeni bir LB çizgi tabak hazırla. Not: P. aeruginosa virülans sonra uzun süreli depolama azaltır.</li>
	<li>İki gün önce tahlil tabak kadar ayarlama P. aeruginosa bir koloni 1. 1'yapılan plaka ile 3-5 mL steril LB suyu aşılamak. 12-16 h 37 ° C'de kuluçkaya. Not: 16 h daha uzun kuluçkaya değil. Zengin sıvı kültürlerde, P. aeruginosa PA14 lyse başlar.</li>
	<li>Yavaş öldürmek medya ile steril 10 cm tabak hazırlamak (3 g NaCl, 3.5 g pepton, 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, fosfat tampon 25 mL (litre başına miktar: 132 mL K2HPO4 (1 M) ve KH2PO4 (1 M) 868 mL) ve agar 18 g/L). Not: tabak önceden hazırlayın. 3 hafta kadar 4 ° C'de hava geçirmez bir kap içinde depolanma</li>
	<li>Her 10 cm yavaş öldürmek plaka (SK plaka) P. aeruginosa 350 μL taze gecede LB kültür ile tohum. Steril bir bakteri yayıcı kullanarak, bakteri eşit medya yüzeyi boyunca yayılmış ve BSL-2 biyolojik güvenli kabine içinde kurumasını sağlar.</li>
	<li>Plakalar için 24 h 37 ° C'de kuluçkaya.</li>
</ol>2. RNAi bakteri hazırlanması
<ol><li>Çizgi dışarı veya PIN-devret RNAi içeren bakterilerin donmuş stoktan uygun antibiyotik (carbenicillin, 100 µg/mL) ve 15 µg/mL Ahringer ve Vidal kitaplıkları için tetrasiklin içeren LB ağar kaplamalar üzerine istenilen suşların. Not: nonpathogenic bakterilerin ile çalışırken kullanın ya bir BSL-2 A / B biyolojik Emanet kabine veya BSL-1 laminar akış hood kısırlık kültürlerin sağlamak ve Kütüphane çapraz bulaşma olasılığını en aza indirmek için.</li>
	<li>Kaplamalar, 37 ° C'de 24 h için kuluçkaya</li>
	<li>Plakayı 4 ° c ilâ iki hafta için saklayın.<ol>
<li>İki hafta sonra tabakları atmak ve eski yerine koymak onları ile taze yapılmış plakalar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Birden çok RNAi suşları paralel olarak ayrı ayrı bir koloni her klon üzerinden 4 mL de bir 24-şey derin-şey plaka, tek bir carbenicillin takıma lb veya steril tüp bebek aşı sınayın. Not: Tetrasiklin RNAi verimliliğini azaltmak için rapor edildi. Bu ortam kullanmayın.</li>
	<li>Multiwell plakalar için en iyi duruma getirilmiş bir sallayarak kuluçka makinesi 24-şey derin kuyu tabak yerleştirin ve 950 rpm'de sallayarak süre için 16 h 37 ° C'de kuluçkaya. Not: Geleneksel sallayarak kuluçka makinesi kullanarak multiwell plakaları Tekdüzen bakteriyel büyüme elde etmek zordur. Titreyen kuluçka makinesi en az 750 rpm sırayla düzgün büyümeye kültürler için sallamak gerekir. Özel bir shaker yokluğunda, bireysel bir tüp her kültürde büyümeye mümkündür. Kültürler istenirse daha sonra aralıklarla 24-şey plaka içine aktarılabilir.</li>
	<li>Bakteri 2.000 x g az 5 dakika boyunca centrifuging toplamak.</li>
	<li>Süpernatant plaka ters çevirme ve şiddetle sallayarak dikkatle boşaltmak. Bazal S (5.85 g NaCl, 1 g K2HPO4, 6 gr KH2PO4 Ultrasaf Su 1 L çözünmüş ve otoklav tarafından sterilize), 100 µL RNAi bakteri resuspend.</li>
	<li>Resuspended bakteri wells multiwell NGM plaka uygun bir dizi halinde pipet (Yuvarlak solucanlar büyüme medya, 3 g NaCl, 2.5 g pepton, 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, fosfat tampon 25 mL (litre başına miktar: 132 mL K2HPO4 (1 M) ve KH2PO4 (1 M) 868 mL) ve su litre başına 18 g agar) IPTG (1 mM son konsantrasyonu) ve carbenicillin (100 μg/mL nihai toplama) ile desteklenmiştir.<ol>
<li>6-şey plaka, iyi bir 24-şey plaka başına 1 mL veya 96-şey plaka kuyu başına 150 µL kuyu başına 3,5 mL NGM medya kullanın.</li>
		<li>100 μL/iyi bakterilerin 6-şey plaka için kullanın; 24-kuyu 50 μL/iyi; ya da 20 μL/96-şey plaka için iyi. Kurumasını sağlar. Not: Kurutma normalde hızlı, tek kurutma tanıtmak için steril akışı mahallede gerçekleştirilir. Tek tip kurutma çok önemlidir. Kurtlardan burrowing agar çatlaklar teşvik gibi aşırı kurutma, kaçının. Bu kayıp ve potansiyel sıvı işleme sistemleri tıkanma solucan yol açar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hazırlanan tabak hemen kullanın veya onları ilâ iki hafta daha sonra kullanmak için 4 ° C'de depolayın. Not: tabak kurumasını önlemek için onlar plastik parafin film ile mühürlenmiş veya nemli kağıt havlu ile sıkı kapalı bir kapta yerleştirilir.</li>
</ol>3. bakım ve C. elegans hazırlanması
Not: deneyler işlemini başlatmadan önce gravid, Yetişkin hermaphroditic solucanlar eşitlenmiş bir nüfusa aşağıdaki gibi oluşturun.
<ol><li>Yıkama gravid yetişkinlerden (Yani, birden fazla embriyo erbezi içinde görünür ile) 4-6 10 cm NGM tabak tabak, yavaşça dönen ve 15 mL konik tüp içine dökme S bazal 4 mL ekleyerek 15 mL konik tüp içine.</li>
	<li>30 saniye için 1000 x g de Santrifüjü yoluyla solucanlar cips.</li>
	<li>Solucan Pelet bozmaya değil dikkat çekici Aspire edin süpernatant.</li>
	<li>Solucan çamaşır suyu çözüm 3,5 mL ekleyin (son konsantrasyonu 0.5M NaOH, steril su % 1 Sodyum hipoklorit) solucan Pelet ve mix 1 dakikadır ters çevirme tarafından.</li>
	<li>Kısaca girdap ve 30 saniye için 1000 x g, santrifüj.</li>
	<li>Aspire edin veya solucan Pelet bozmamaya dikkat çekici süpernatant, dikkatle boşaltmak.</li>
	<li>3,5 mL taze solucan çamaşır suyu çözeltisi solucan Pelet ekleyin.</li>
	<li>Çamaşır suyu çözüm de solucan kuvvetle karıştırın. Düzenli olarak (yaklaşık 10 saniyede bir) solucanlar diseksiyon mikroskop altında kontrol edin. Solucan cuticles kırmak, yumurta bırakmadan dikkat et. Yetişkin bu solucanların en çözünmüş (~ %95) olmuştur sonra çamaşır suyu ile sindirim durdurmak için bazal S 15 ml seyreltik. Not: Yumurta kabukları yetişkin doku bleach daha dayanıklı olmakla birlikte, uzun süreli pozlama sırasında çözülmüş. Yumurta dağılmasına önlemek için çamaşır suyu çözüm 7 dakika daha uzun süre solucan yumurta maruz bırakmayın. Yumurta kabukları aşırı bozuksa, embriyo ölür.</li>
	<li>30 saniye boyunca embriyo 1000 x g de cips ve Aspire edin veya embriyo Pelet kaldırmadan süpernatant dikkatle boşaltmak.</li>
	<li>Solucanlar kalan çamaşır suyu çözüm sulandırmak için S 15 mL nihai bir birime bazal resuspend.</li>
	<li>Çamaşır adımları (3,9-3.10) üç kez daha 4 ardışık yıkar toplam için yineleyin.</li>
	<li>Dördüncü yıkama sonra süpernatant Aspire edin ve 5 veya 6 mL steril S bazal 15 mL konik tüp içine kadar ekleyin. ~ 50 solucanlar µL başına bir konsantrasyon için embriyo resuspend için hedeftir. Not: S bazal yumurta Pelet boyutu üzerine bağlıdır; büyük Pelet daha fazla S bazal gereklidir.</li>
	<li>Konik tüp gecede bir masa üstü rotator oda sıcaklığında veya 15 ° C'de 48 h kuluçkaya Larvalar yumurtadan ama larva geliştirme besin yoksunluğu nedeniyle (L1 diapause) L1 aşamada tutuklayacağım.</li>
	<li>Embriyoların çoğu yumurtadan sahip ve geliştirme L1 aşamasında tutuklanan doğrulamak için diseksiyon mikroskop altında incelemek.</li>
	<li>Solucan hazırlık 20 µL alarak ve ile S bazal, 80 µL sulandrarak solucan sayısı belirler. Seyreltilmiş solucan çözüm doğrudan boş NGM plaka üzerine 10 µL pipet. Tekrarlayın 2 kez daha.<ol>
<li>Her yerde larva sayısı ve belirlemek. Bu ortalama 2 solucanlar solucan hazırlık µL başına yaklaşık sayısı elde bölün. Solucan preps sonra yayılma plakaları için veya deneyler için kullanılabilir. Not: 4-5 gün sonra Aç larva ölmeye başlayacak; Hazırlık bu noktada atmak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Zorlanma yayma için L1 solucanlar (5000-6000) 3-4 10 cm NGM plakalar üzerine uygun sayıda benekli ile pipet konsantre OP50 E. coli- "superfood" (E. coli OP50 benekli 25 X konsantrasyonu (Yani, 1 L gecede OP50, LB içinde yetiştirilen kültür girilen 25 X OP50 superfood 40 mL); Bu konsantre bakteriyel süspansiyon 2 mL her 10 cm NGM tabağa lekeli).</li>
	<li>Levha deneyler için hazırlamak için ("Temel Protokolü" kullanım 3.17.1 Kur, için belgili tanımlık "kurmak RNAi ekran" kullanım merdiven 3.17.2 - 3.17.4 uygun olarak için) aşağıdakilerden birini yapın:<ol>
<li>Pipet ~ 5.000 solucanlar/10 cm plaka numaralı seribaşı RNAi veya OP50 superfood ile.</li>
		<li>Pipet ~ 500 solucanlar/iyi bir 6-şey plaka numaralı seribaşı RNAi ile.</li>
		<li>Pipet ~ 300 solucanlar/iyi bir 24-şey tabak içinde RNAi ile seçilir.</li>
		<li>Pipet ~ 100 solucanlar/iyi bir 96-şey tabak içinde RNAi ile seçilir. Not: Nasıl RNAi seribaşı yönergeleri için hazırlık RNAi bakteri 2,7-2,9 adımda başvurun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Solucanlar verimli bir tür kullanılıyorsa, solucanlar 25 ° c ~ 44-48 h. kullanım için uygun yaş nüfus ulaştığında bu solucanları mümkün olduğunca çabuk kuluçkaya. Bu solucanlar içinde tahlil sırasında kuluçkalık yumurta etkisini en aza indirir.</li>
	<li>Eğer kullanılan zorlanma sıcaklık steril (Örneğin, fer-15(b26); FEM-1(hc17) veya glp-4(bn2)), solucanlar 15 ° c ~ 16 h için kuluçkaya ve geliştirme tamamlamak ve embriyo önlemek 44 h için 25 ° c aktarın.</li>
</ol>4. sıvı tahlil Kur (temel Protokolü) öldürmek
Not: Bu bir bakteriyel zorlanma ve solucanlar bir kaynak için bir protokoldür.
<ol><li>Bir hücre kazıyıcı kullanarak, P. aeruginosa bir SK plaka kaldırmak ve içinde resuspend ~ S bazal 5 mL. Gerekirse büyütmek. Spektrofotometre (OD600) kullanarak bakteriyel süspansiyon optik yoğunluğunu ölçmek</li>
	<li>P. aeruginosa , OD600 ≈ 0.09 S bazal (3 X son konsantrasyonu) içinde seyreltilmiş hisse senedi 24 mL hazırlayın. 4.6.2 son içeriği iyi ücret için görmek ve buna göre bakteriyel seyreltme hacmi ölçek.</li>
	<li>21 mL sıvı yavaş öldürmek medya (3 g NaCl, pepton/m CaCl2 ve MgSO4 ' e 1 mM son bir konsantrasyon ile takıma 3.5 g) ekleyin. Bir çok kanallı pipet kullanarak, bakteri ve medya 45 µL 384-şey plaka her şey için transfer.</li>
	<li>50 mL konik tüp içine kaynaklarını (yani, adım 3.17.1) dan solucanlara yıkama ve solucanlar yerçekimi kuvveti altında yerleşmek izin. 5 ml süpernatant Aspire edin. Toplam 50 mL S bazal resuspend.</li>
	<li>Adım 4.4 iki kez tekrarlayın.</li>
	<li>Bir solucan sıralayıcısı kullanarak, yaklaşık 22 solucanlar 384-şey plaka her kuyuya sıralamak. Not: Kurulum her solucan ~1.1 µL sıvı içinde bırakır. 22 solucanlar 25 µL, toplam tahlil cilt 70 µL/iyi getirmek için miktar olacaktır.<ol>
<li>70-in her şey son kompozisyon oluşur µL. 45 µL bu birimin bakteriyel aracı olarak eklenir (24 µL S bazal ve 21 µL SK 0,03 OD600 bakteri takıma CaCl2 ve MgSO4ile). Diğer 25 µL 22 kurtlarla eklenir.</li>
		<li>Sıralayıcı kullandıysanız ( Tablo malzemelerigörmek) işte kullanılamaz, solucanlar bir son konsantrasyon 1 solucan/µL S bazal içinde ve pipetted 25 µL/iyi bir çok kanallı pipet kullanarak seyreltilmiş. Ancak, sonuçlar artan değişkenlik sergileyebilirler. Alternatif olarak, bu Leung ve meslektaşları19tarafından açıklandığı gibi peristaltik Sıvı Sabunluk, kullanmak mümkündür.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Solucanlar 384-şey plaka sıralanmış sonra gaz geçirgen bir film ile plaka mühür ve plakaları için 24-48 h 25 ° C'de kuluçkaya.</li>
	<li>İstediğiniz saatte Mikroplaka yıkayıcı 5 kez toplam 384-şey plaka ile S bazal yıkamak için kullanın.<ol>
<li>Sonra ikinci yıkama, medya çoğunu Aspire, bırakarak ~ 20 µL. şiddetle sallamayın plakaları herhangi bir enkaz kuyu dibinden gevşetmek için en az 30 saniye Mikroplaka vortexer kullanarak).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Son yıkama aspiratı süpernatant aşağı 20 µL. Ekle 50 µL 0,98 µM nükleik asit leke sonra ( Tablo malzemelerigörmek) / 384-şey plaka, 0.7 µM son bir konsantrasyon, iyi.</li>
	<li>12-16 saat için oda sıcaklığında kuluçkaya. Bu boya sadece ölü solucanlar leke. İstenen kuluçka dönemi sonra (3 yıkar en az) Mikroplaka yıkayıcı kullanarak herhangi bir aşırı kaldırmak için yıkama plakalar leke.</li>
	<li>Veri toplama için iletilen ışık ve floresan (531 nm uyarma ve 593 emisyon) görüntü için bir spektrofotometre veya otomatik bir mikroskop kullanın.<ol>
<li>Düşük büyütme objektif görüntünün yakalanması için tüm iyi kullanın.</li>
		<li>Alternatif olarak, akış vermimetry kullanın. Bu teknik bir büyük nesne akış sitometresi floresans organizmanın bütün (Yani, C. elegans) akış sitometresi için güçlü benzer bir moda ve boyutu ölçüm bir solucan fluorimeter olarak kullanır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Otomatik görüntü analiz yazılımı (örneğin, CellProfiler, MatLab <a href="http://cellprofiler.org/">http://cellprofiler.org/</a>üzerinde bir ücretsiz görüntü analiz stüdyosu) kullanmak iyi tarafsız bir biçimde başına floresan ve toplam solucan alanları hesaplamak için. Not: Bu sayının kesir ölüm her şey için temsil eder. De olsaydı o zaman kesir ölüm 0,35 veya % 35 oluşur 7 20 dışarı solucanlar, toplam lekeli.<ol>
<li>İlk kullanımdan önce otomatik görüntü işleme boru hattı el ile Puanlama tarafından doğrulanması gerekir. Bu görsel olarak görüntüleri teftiş ve kesirler ölü solucanlar her biri için kayıt tarafından elde edilen puanlar otomatik boru hattı sonuçları karşılaştırarak yapılır. Doğrulama işlemi otomatik görüntü işleme parametrelerini doğru olduğundan ve verilerin doğru şekilde temsil sağlar.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. uyum için eleme birden çok C. elegans suşları veya nakavtlar (RNAi ekran kurulumu)
Not: Bu bir 24-şey plaka kurulum için açıklanan bir RNAi ekran olduğunu.
<ol><li>S bazal 24-şey plaka kuyu başına 1 mL ekleyin (bkz. Adım 3.17.3). Yavaşça plaka sallayarak solucanlar kışkırtmak, sonra solucanlar bir boş, steril 24 derin-şey plaka için transfer. Solucanlar kütleçekimsel (~ 5 dakika) yerleşmek izin verir.</li>
	<li>Yaklaşık 1 mL bırakarak süpernatant Aspire edin. S bazal 7 mL her şey için ekleyin.</li>
	<li>Adımları 5.1-5.2 en az 2 kez daha yineleyin. Son yıkama sonra yaklaşık 400 µL bırakarak süpernatant Aspire edin.</li>
	<li>Solucan sıralayıcısı Örnekleyicinin işlevini kullanarak, 22 24-şey plaka solucan süspansiyon 384-şey plaka (384-şey plaka bir 24-şey plaka verimi 8-12 kuyu her de) her kuyuya solucanlar sıralayın.<ol>
<li>Açlık önlemek için bakteri 384-şey kalıplara (yalnızca OP50 gibi gıda olarak hizmet veren bir zorlanma veya patojenik bir yük) sıralama öncesinde pipet. Not: Aşağıdaki adımları 2.3-2.5 veya 6.4-6.5 ve besin kaynağı bakteri seyreltilmiş ve P. aeruginosagelince aynı düzeni izleyerek eklendi patojenler eklenebilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Solucanlar 384-şey plaka sıralanmış sonra küçük moleküller veya diğer özel deney malzemeleri ekleyin.</li>
</ol>6. uyum E. faecalistir için
Not: Sadece P. aeruginosa tahlil ile arasındaki farklar açıklanmıştır.
<ol><li>E. faecalistir taze kaynağı BHI (beyin kalp infüzyon) agar plaka üzerine donmuş bir stoktan bakteri çizgiler ve 16-24 h 37 ° C'de için kuluçka hazırlayın Not: E. faecalistir deneyler bir BSL-2 biyolojik Emanet kısırlık sağlamak için kabine içinde gerçekleştirin. Patojen bulaşma veya bulaşma olasılığını en aza indirmek için uygun güvenlik önlemleri kullanın.</li>
	<li>Tabaklar 4 ° C'de bir hafta kadar saklanabilir. Bu sürenin sonunda, taze bir plaka ile değiştirin.</li>
	<li>Solucanlar, sıralama önce gece 3-5 mL aşılamak bir tek koloni ile steril BHI E. faecalistir. 12-16 saat ajitasyon ile 37 ° C'de kuluçkaya.</li>
	<li>Bakteri wells gelince P. aeruginosa (3 x bakteri bazal S, OD600≈0.09) ekleyin. Not: E. faecalistiriçin son iyi kompozisyon ise: E. faecalistir (OD600≈0.03), BHI = % 10 v/v, S bazal oluşan kalan güç ile. Unutmayın s bazal 25 µL solucanlar ile teslim edilecektir. Not: E. faecalistir floresan leke absorbe kalın biyofilmler bulanık görüntüleri neden üretir. Geniş çamaşır bu biyofilm kaldırmak için yetersiz olabilir. Bu durumda, solucanlar bir çok kanallı pipet kullanarak boş bir levha için transfer edilebilir. Aktarımı gerçekleştirmek için ara 20 S bazal için %0,1 (v/v) ara 20 S bazal son bir konsantrasyon eklenebilir. Bu biyofilm solucanlara giderilmesinde yardımcı olur.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Falagas, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pandrug-resistant+Klebsiella+pneumoniae,+Pseudomonas+aeruginosa+and+Acinetobacter+baumannii+infections:+Characteristics+and+outcome+in+a+series+of+28+patients.">Pandrug-resistant Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii infections: Characteristics and outcome in a series of 28 patients.</a> International Journal of Antimicrobial Agents. 32 (5), 450-454 (2008).</li><li>Hsueh, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pandrug-resistant+Acinetobacter+baumannii+causing+nosocomial+infections+in+a+university+hospital,+Taiwan.">Pandrug-resistant Acinetobacter baumannii causing nosocomial infections in a university hospital, Taiwan.</a> Emerging Infectious Diseases. 8 (8), 827-832 (2002).</li><li>Wang, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pandrug-resistant+Pseudomonas+aeruginosa+among+hospitalised+patients:+clinical+features,+risk-factors+and+outcomes.">Pandrug-resistant Pseudomonas aeruginosa among hospitalised patients: clinical features, risk-factors and outcomes.</a> Clinical Microbiology and Infection. 12 (1), 63-68 (2006).</li><li>Yao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Draft+genome+sequences+of+pandrug-resistant+Serratia+marcescens+clinical+isolates+harboring+blaNDM-1.">Draft genome sequences of pandrug-resistant Serratia marcescens clinical isolates harboring blaNDM-1.</a> Genome Announcements. 5 (3), (2017).</li><li>Utari, P. D., Quax, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+reveals+novel+Pseudomonas+aeruginosa+virulence+mechanism.">Caenorhabditis elegans reveals novel Pseudomonas aeruginosa virulence mechanism.</a> Trends in Microbiology. 21 (7), 315-316 (2013).</li><li>Conery, A. L., Larkins-Ford, J., Ausubel, F. M., Kirienko, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+for+novel+anti-infectives+using+a+C.+elegans+pathogenesis+model.">High-throughput screening for novel anti-infectives using a C. elegans pathogenesis model.</a> Current Protocols in Chemical Biology. 6 (1), 25-37 (2014).</li><li>Kirienko, N. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+disrupts+Caenorhabditis+elegans+iron+homeostasis,+causing+a+hypoxic+response+and+death.">Pseudomonas aeruginosa disrupts Caenorhabditis elegans iron homeostasis, causing a hypoxic response and death.</a> Cell Host &amp; Microbe. 13 (4), 406-416 (2013).</li><li>Kirienko, D. R., Revtovich, A. V., Kirienko, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-content,+phenotypic+screen+identifies+fluorouridine+as+an+inhibitor+of+pyoverdine+biosynthesis+and+pseudomonas+aeruginosa+virulence.">A high-content, phenotypic screen identifies fluorouridine as an inhibitor of pyoverdine biosynthesis and pseudomonas aeruginosa virulence.</a> mSphere. 1 (4), (2016).</li><li>Manning, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+content+microscopy+assay+to+determine+drug+activity+against+intracellular+Mycobacterium+tuberculosis.">A high content microscopy assay to determine drug activity against intracellular Mycobacterium tuberculosis.</a> Methods. 127, 3-11 (2017).</li><li>Marwaha, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-acylated+derivatives+of+sulfamethoxazole+and+sulfafurazole+inhibit+intracellular+growth+of+Chlamydia+trachomatis.">N-acylated derivatives of sulfamethoxazole and sulfafurazole inhibit intracellular growth of Chlamydia trachomatis.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (5), 2968-2971 (2014).</li><li>Kota, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+high-content+imaging+and+chemical+genetics+to+probe+host+cellular+pathways+critical+for+Yersinia+pestis+infection.">Integrating high-content imaging and chemical genetics to probe host cellular pathways critical for Yersinia pestis infection.</a> PLoS One. 8 (1), e55167 (2013).</li><li>Arif, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+cell+infection+caused+by+Listeria+monocytogenes+invasion.">Quantification of cell infection caused by Listeria monocytogenes invasion.</a> Journal of Biotechnology. 154 (1), 76-83 (2011).</li><li>Jayamani, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+Francisella+tularensis-Caenorhabditis+elegans+pathosystem+for+the+evaluation+of+therapeutic+compounds.">Characterization of a Francisella tularensis-Caenorhabditis elegans pathosystem for the evaluation of therapeutic compounds.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 61 (9), (2017).</li><li>Moy, T. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screen+for+novel+antimicrobials+using+a+whole+animal+infection+model.">High-throughput screen for novel antimicrobials using a whole animal infection model.</a> ACS Chemical Biology. 4 (7), 527-533 (2009).</li><li>Rajamuthiah, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+automated+platform+for+drug+discovery+against+multi-drug+resistant+Staphylococcus+aureus.">Whole animal automated platform for drug discovery against multi-drug resistant Staphylococcus aureus.</a> PLoS One. 9 (2), e89189 (2014).</li><li>Breger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antifungal+chemical+compounds+identified+using+a+C.+elegans+pathogenicity+assay.">Antifungal chemical compounds identified using a C. elegans pathogenicity assay.</a> PLoS Pathogens. 3 (2), e18 (2007).</li><li>Garvis, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+semi-automated+liquid+screen+reveals+a+specialized+role+for+the+chemotaxis+gene+cheB2+in+Pseudomonas+aeruginosa+virulence.">Caenorhabditis elegans semi-automated liquid screen reveals a specialized role for the chemotaxis gene cheB2 in Pseudomonas aeruginosa virulence.</a> PLoS Pathogens. 5 (8), e1000540 (2009).</li><li>Zhou, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+and+novel+screening+model+for+assessing+the+bioactivity+of+extracts+against+multidrug-resistant+Pseudomonas+aeruginosa+using+Caenorhabditis+elegans.">An efficient and novel screening model for assessing the bioactivity of extracts against multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa using Caenorhabditis elegans.</a> Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 75 (9), 1746-1751 (2011).</li><li>Leung, C. K., Deonarine, A., Strange, K., Choe, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+and+biosensing+with+fluorescent+C.+elegans+strains.">High-throughput screening and biosensing with fluorescent C. elegans strains.</a> Journal of Visual Experiments. (51), (2011).</li><li>Kirienko, N. V., Ausubel, F. M., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitophagy+confers+resistance+to+siderophore-mediated+killing+by+Pseudomonas+aeruginosa.">Mitophagy confers resistance to siderophore-mediated killing by Pseudomonas aeruginosa.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (6), 1821-1826 (2015).</li><li>Kirienko, N. V., Cezairliyan, B. O., Ausubel, F. M., Powell, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+PA14+pathogenesis+in+Caenorhabditis+elegans.">Pseudomonas aeruginosa PA14 pathogenesis in Caenorhabditis elegans.</a> Methods in Molecular Biology. 1149, 653-669 (2014).</li><li>Kang, D., Kirienko, D. R., Webster, P., Fisher, A. L., Kirienko, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyoverdine,+a+siderophore+from+Pseudomonas+aeruginosa,+translocates+into+C.+elegans,+removes+iron,+and+activates+a+distinct+host+response.">Pyoverdine, a siderophore from Pseudomonas aeruginosa, translocates into C. elegans, removes iron, and activates a distinct host response.</a> Virulence. , 1-41 (2018).</li><li>Garsin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-lived+C.+elegans+daf-2+mutants+are+resistant+to+bacterial+pathogens.">Long-lived C. elegans daf-2 mutants are resistant to bacterial pathogens.</a> Science. 300 (5627), 1921 (2003).</li><li>Estes, K. A., Dunbar, T. L., Powell, J. R., Ausubel, F. M., Troemel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=bZIP+transcription+factor+zip-2+mediates+an+early+response+to+Pseudomonas+aeruginosa+infection+in+Caenorhabditis+elegans.">bZIP transcription factor zip-2 mediates an early response to Pseudomonas aeruginosa infection in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (5), 2153-2158 (2010).</li><li>Tjahjono, E., Kirienko, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+mitochondrial+surveillance+pathway+is+required+for+defense+against+Pseudomonas+aeruginosa.">A conserved mitochondrial surveillance pathway is required for defense against Pseudomonas aeruginosa.</a> PLoS Genetics. 13 (6), e1006876 (2017).</li><li>Moy, T. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+antimicrobials+using+a+live-animal+infection+model.">Identification of novel antimicrobials using a live-animal infection model.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (27), 10414-10419 (2006).</li><li>Henderson, S. T., Bonafe, M., Johnson, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=daf-16+protects+the+nematode+Caenorhabditis+elegans+during+food+deprivation.">daf-16 protects the nematode Caenorhabditis elegans during food deprivation.</a> The Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences and Medical Sciences. 61 (5), 444-460 (2006).</li><li>Beanan, M. J., Strome, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+germ-line+proliferation+mutation+in+C.+elegans.">Characterization of a germ-line proliferation mutation in C. elegans.</a> Development. 116 (3), 755-766 (1992).</li></ol>

Yazarlar onlar ifşa etmek yok çatışmalarını var bildirin.

Bu tahlil (veya benzer deneyleri P. aeruginosa veya E. faecalistiriçin diğer patojenleri nerede yerine) amaçlı ilaç keşfi de dahil olmak üzere, çeşitli için yararlı olur. Virülans faktörleri, konak savunma yolları, aydınlatma belirlenmesi ve düzenleyici makine ana bilgisayar-patojen etkileşimde yer alan ilgili belirleme gibi temel biyolojik soru ele almak için yararlıdır.
P. aeruginosa sıvı öldürme tahlil sağlam olsa da, nerede dikkat başarısızlık olasılığını en aza indirmek için ödenmesi gereken birkaç nokta vardır. Diye bakteri virülans LB gecede büyüme rağmen kaybetmek önce belirtildiği gibi P. aeruginosa Aşılamalar bakteriyel kaynak plaka taze, kalmalıdır. İkinci olarak, kalsiyum ve magnezyum deneyleri öldürme P. aeruginosa için eklenir emin olmak için anahtardır. O olmadan, önemli ölçüde virülans tehlikeye girer. Son olarak, bu HT115 üzerinde (RNAi tabanlı deneyleri için) yetiştirilen solucanlar solucan OP50 yetiştirilen daha önemli ölçüde geç ölecek dikkati çeker (N. Kirienko, kişisel iletişim). Bu nedenle, RNAi tabanlı çalışmalar için geçiş Eğer, ampirik olarak tahlil için en iyi zaman noktası belirlemek önemlidir.
Deneyleri P. aeruginosa veya E. faecalistirile öldürmek için bu kadar assay olarak kullanılmak üzere hazır L1 sahne alanı'ndan solucanlar gelişimi için yeterli gıda olduğundan emin olmak önemlidir. Açlık, hatta kısa vadeli, DAF-2/DAF-16 insülin/IGF ağ27sinyal gibi ana savunma yolları bir dizi etkinleştirmek için bilinir. Bizim verileri DAF-16/FOXO zaten biraz sıvı20dakika sonra kültürlü tarafından etkinleştirilir ve daha fazla harekete geçirmek şiddetle istenmeyen, çünkü geniş spektrumlu patojen direnç23DAF-16/FOXO teşvik göstermektedir.
Son olarak, ölüm bir okuma olarak dayanan herhangi bir tahlil tamamen steril solucanlar kullanmak çok önemlidir. Solucanlar verimli iseniz, sıvı içinde olmak yumurta döşeme zorluğa neden oluyor. Sonuç olarak, bazı embriyoların sonunda onun ölümüne neden olan üst içinde hatch. Bu nedenle, genellikle bu deneyleri için tamamen penetrant steril fenotip gösteren glp-4(bn2)28, gibi genetik bir lezyon kullanın. Onlar da bakteriyel büyüme ve gelişme ile girişime neden olabilir bu embriyonik gelişim engellemek, ancak yumurta, 5-fluorodeoxyuridine gibi (FUdR), döşeme izin kimyasalların kullanımı kaçınılmalıdır.
Genel olarak, bu analiz için birkaç saat puan planlamak oldukça yararlı bulduk. Tahlil sağlam zamanlama genellikle tutarlı olmasına rağmen Stokastik ve algılanamaz değişiklikleri zamanlama ölüm 2-4 saat içinde tahlil değiştirebilirsin. Sorun giderme gerekli olduğunda, genellikle ilk basit cevaplar düşünün yararlıdır; Yani, taze ortam hazırlamak, en son bakteriyel kültürlerde atmak ve sadece çok nadiren bu önlemlerin tahlil işlevsellik geri yüklerim bakteri suşları donmuş hisse senetleri, vb yeniden çizgi.
Yöntem göreli kolaylık nedeniyle, çok çeşitli değişiklikler kolayca gerçekleştirilebilir. Solucanlar bir üniforma glp-4(bn2) arka plan yüksek üretilen iş RNAi ekranlar için aşağıdaki gibi bu biz burada, tarif değişiyor ana bilgisayar yanıt yollar çok çeşitli xenobiotics ve toksik kimyasallar için tanımlanması için yararlı. Örneğin, aynı kimyasal veya toksin RNAi tabak (Örneğin, Cry5B toksini, pH, vb) her kuyunun içine ekleyerek, bu toksinler karşı hassasiyetini değiştirme yolları kolayca tespit edilebilir. Bu tür ekranları C. elegansbulaştırmak patojenler yelpazesine hiçbirine karşı savunma ağları tanımlamak için de kullanılabilir.

Şimdi neredeyse bir yüzyıl önce liderliğindeki bir dönüm noktası an kamu sağlığı için kimlik ve etkili, geniş spektrumlu antibiyotikler, yaygın inanç bu bulaşıcı olduğu yere hastalığı belası geçmiş olurdu. Kısa birkaç on yıl içinde bu iyimserlik, küçülmek patojen bu bir kez mucizevi tedaviler sınırlı direnç mekanizmaları geliştirilen sonra patojen başladı. Bir süre için ilaç bulma çabaları ve patojenler arasındaki silahlanma yarışı dengeli görünüyordu. Ancak, antimicrobials suistimal son zamanlarda Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumanii, Serratia marcescensve P. aeruginosa1pan-ilaca dirençli suşların ortaya çıkması içinde sonuçlandı, 2,3,4.
P. aeruginosa ciddi yanıklar, immün veya kistik fibrozis var olan hastalar için ciddi bir tehdit olan bir fırsatçı, gram negatif, birden çok ana bilgisayar patojen var. Bu da giderek şiddetli Nozokomiyal Enfeksiyonlar, özellikle antimikrobiyal direnç www.cdc.gov/devam eden onun edinimi nedeniyle bir etken olarak tanımlanmaktadır. Bu tehdide yönelik olarak başlamak için iyi belgelenmiş C. elegans-P. aeruginosa enfeksiyon sistem5kullandık. Laboratuarımızın ana bilgisayar6öldürmek için yetenek patojenin sınırlamak roman bileşikler tanımlamak için bir sıvı tabanlı, yüksek üretilen iş, yüksek-içerik filtreleme platform geliştirmek için bu sistemi kaldıraçlı. Çoğu intriguingly konularda, bu bileşiklerin antimicrobials7 ve virülans inhibitörleri8de dahil olmak üzere en az üç genel kategoride için ait gibi görünüyor. C. elegans diğer yüksek içerikli ilaç keşif deneyleri bildirilmiştir Mycobacterium tuberculosum, Chlamydia trachomatis, Yersinia pestis, Listeria Monositogenez, FRANCISELLA tularensis, Staphylococcus aureus, Candida albicans, için ve Enterococcus faecalistir, diğerleri arasında9,10,11,12,13,14,15,16. Bu tür deneyleri hem ev sahibi ve patojen, kimyasal bir ekran ve sayısı ötesinde tanımlama yeteneği ile karşılaştırıldığında bioavailability olasılığı arttı toksik olabilir yanlış pozitif sayısı sınırlama gibi birkaç iyi tanınan avantajlara sahip Sadece sınırlayıcı mikrobiyal büyüme, anti-virulents, bağışıklık uyarıcı molekülleri veya aksi takdirde lehine eski ev sahibi-patojen etkileşimin denge tilt bileşikleri gibi. Ayrıca, bu ekranlar keşfetti bileşikler kez memeli konaklarda etkilidir.
En az iki başka deneyleri17,18 C. elegans yüksek üretilen iş ekranları sıvı içinde yürütmek kullanılabilir fazlalaştı. Ancak, bu deneyleri herbiri sıvı içinde gerçekleştirilecek yavaş-öldürme olarak, bilinen prototip kolonizasyon bağırsak tahlil sağlar bir değişiklik olduğunu üretilen işi artırmak ve bileşikleri daha kolay taranması izin. Dikkatli karakterizasyonu kesin bakteriyel virülans mekanizmalarının bu deneyleri ve bizim sıvı tabanlı ekran7arasında farklı olduğunu göstermiştir. Bu yana virülans her iki tür memeli sistemlerinde gözlenir, hangi virülans belirleyici tahlil seçim öncesinde deneyci'nın çıkarları için en uygun dikkate almak önemlidir.
Burada biz sıvı tabanlı en iyi duruma getirilmiş bir sürümünü göstermek C. elegans-P. aeruginosa tahlil. Biz de gram-pozitif bakteri patojen karşılamak için bizim sıvı tabanlı tahlil yöntemi uyarlaması rapor Enterococcus faecalistir. P. aeruginosagibi E. faecalistir giderek antimikrobiyal direnç yolları1büyüyen bir silah ile bir ciddi nozokomiyal tehdit olarak tanımlanır. E. faecalistir ile yüksek-den geçerek taranması için önceki bir yöntemi14bulunmaktadır ancak preinfection yordamı olmak zordur ve ekipman COPAS FlowSort gibi bulaşıcı olasılığını artırır patojen ile gerektirir. Bizim protokol güvenlik profili artırma yükleyemeyebileceğini gereksinimini ortadan kaldırır. Son olarak, biz hangi tarafından bu deneyleri birini RNAi, kurulması, içinde bir rol ana faktörleri için Kullanıcı aramak için izin veya direnç, enfeksiyon besleme ile kombine edilebilir bir araç raporu.

<table><tbody><tr><td>COPAS FP BioSorter</td><td>Union Biometrica</td><td></td><td>Large object flow cytometer/worm sorter</td></tr><tr><td>Cytation 5</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EL406 Washer Dispenser</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multitron Pro</td><td>Infors HT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>24 Deep-Well RB Block</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>CS15124</td><td></td></tr><tr><td>384-Well plate</td><td>Greiner Bio-One</td><td>MPG-781091</td><td></td></tr><tr><td>Nematode Growth Media (NGM)</td><td></td><td></td><td>Amount per liter: 18 grams agar, 3 grams NaCl, 2.5 grams Peptone, 1 mL CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; (1 M), 1 mL MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (1 M), 25 mL Phospate buffer, and 973 mL of milli-Q water</td></tr><tr><td>Slow Killing (SK) plates</td><td></td><td></td><td>Amount per liter: 18 grams agar, 3 grams NaCl, 3.5 grams Peptone, 1 mL CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; (1 M), 1 mL MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (1 M), 25 mL Phospate buffer, and 973 mL of milli-Q water</td></tr><tr><td>Slow Killing (SK) media</td><td></td><td></td><td>Amount per liter:&amp;nbsp; 3 grams NaCl, 3.5 grams Peptone, 1 mL CaCl&lt;sub&gt;2 &lt;/sub&gt;(1 M), 1 mL MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (1 M), 25 mL Phosphate buffer, and 973 mL of milli-Q water</td></tr><tr><td>Lysogeny Broth (LB)</td><td>USBiological Life Sciences</td><td>L1520</td><td></td></tr><tr><td>Brian Heart Infusion broth (BHI)</td><td>Research Products International Corp</td><td>50-488-526</td><td></td></tr><tr><td>Worm Bleach Solution</td><td></td><td></td><td>Amount per 100 mL: 10 mL of 5 M NaOH solution, 20 mL of 5% Sodium Hypochlorite Solution, and 70 mL of sterile water</td></tr><tr><td>S Basal</td><td></td><td></td><td>Amount per liter: 5.85 grams NaCl, 6 grams KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 1 gram K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, and 1 Liter of milli-Q water</td></tr><tr><td>Agar</td><td>USBiological Life Sciences</td><td>A0930</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>USBiological Life Sciences</td><td>S5000</td><td></td></tr><tr><td>Peptone</td><td>USBiological Life Sciences</td><td>P3300</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>USBiological Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>M63-500</td><td></td></tr><tr><td>Phospate buffer</td><td></td><td></td><td>amount per liter: 132 mL of K2HPO4 (1M) and 868 mL of KH2PO4 (1M)</td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Acros Organics</td><td>7778-77-0</td><td></td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>USBiological Life Sciences</td><td>P5100</td><td></td></tr><tr><td>5% Sodium Hypochlorite Solution</td><td>BICCA</td><td>7495.5-32</td><td></td></tr><tr><td>NaOH solution</td><td>Fisher Scientific</td><td>SS255-1</td><td></td></tr><tr><td>Breathe-easy</td><td>Diversified Biotech</td><td>BEM-1</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Orange Nucleic Acid Stain</td><td>Fisher Scientific</td><td>S11368</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Bacterial Strains&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;P. aeruginosa &lt;/em&gt;(PA14)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. faecalis&lt;/em&gt;(OG1RF)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli &lt;/em&gt;superfood (OP50)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli &lt;/em&gt;RNAi expressing bacteria (HT115)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Worm Strains &lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;glp-4&lt;/em&gt;(&lt;em&gt;bn2&lt;/em&gt;) (Beanan and Strome, 1992, PMID: 1289064)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PINK-1::GFP reporter (Kang et al., 2018, PMID: 29532717)</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a high-throughput, high-content, liquid-based c. elegans pathosystem

Belirlenen yeni uyuşturucular sayısı tarafından geleneksel, vitro ekranları kaybeder, bu yaklaşım başarı çoklu ilaç direnci mücadele etmek yeni bir silah için arama azaltmak. Bu araştırmacılar sadece yeni ilaçlar bulmak gerekir mi ama aynı zamanda onları bulmak için yeni yollar geliştirmek zorundayız sonuca neden olmuştur. Arasında en umut verici aday yöntemleri bütün organizma, vivo içinde bu kullanım yüksek üretilen iş, fenotipik dökümanları deneyleri ve Caenorhabditis elegans arasında değişen Danio rerioiçin ev sahipliği yaptı. Bu ana bilgisayarlar ana bilgisayar ve/veya biounavailable toksik bileşikler genellikle ilk ekranında, pahalı takip önce yukarıya bırakılır dramatik indirimleri yanlış pozitif hits içinde dahil olmak üzere birkaç güçlü avantajlara sahip.
İşte nasıl bizim tahlil iyi belgelenmiş C. elegansana bilgisayar varyasyon sorguya çekmek için kullanılan göstermektedir —Pseudomonas aeruginosa sıvı öldürme pathosystem. Biz de dışarı iyi çalışan bu tekniğin çeşitli uzantıları göstermek. Örneğin, plaka biçimleri sorgu ana faktörler bu konak-patojen etkileşim içinde yüksek-den geçerek genetik ekranlar RNAi 24 - veya 96-da kullanarak gerçekleştirmek edebiliyoruz. Bu tahlil kullanarak, tüm genom ekranlar dramatik potansiyel ezelî belgili tanımlık lüzum için zahmetli biyokimyasal arıtma yaklaşımlar uyuşturucu hedefler belirleme görevini basitleştirebilirsiniz sadece birkaç ay içinde tamamlanabilir.
Biz de gram-pozitif bakteri Enterococcus faecalistir Ayagin Gram-negatif patojen P. aeruginosaiçin yerine koyar bizim Yöntem bir varyasyon rapor. Çok P. aeruginosaiçin olduğu gibi E. faecalistir öldürerek zamana bağımlı. Aksine önceki C. elegans—E. faecalistir deneyleri, bizim tahlil E. faecalistir preinfection gerektirmez, onun Emanet profil iyileştirilmesi ve sıvı işleme aygıtları kirletici şansını azaltır. Tahlil ~ %95 ölüm oranları 96 h sonrası enfeksiyon gösterilen son derece sağlamdır.

Tahlil performansı için önemli parametreler
Bu tahlil temel biyoloji uygun bir anlayış tahlil en iyi duruma getirme ve sorun giderme için gereklidir. Bu amaçla, ilk birkaç anahtar gazetelere P. aeruginosapatogenezinde mekanizmaları elucidating havale-sıvı7,20dakika sonra öldürme aracılı. Yukarıda özetlenen adımları (bkz. Şekil 1 tahlil protokolü bir şematik için) takip edilmektedir koşuluyla C. elegans zamana bağımlı öldürülmesi sadece patojen (Şekil 2A) varlığında gözlenir. Buna ek olarak, anahtar beslenme takviyeleri (pepton medyadan bırakılır ve yalnızca S bazal eklenirmesela ) yokluğunda, öldürmek yok çok az (2B rakam) gözlenir. İlginçtir, geleneksel yavaş-öldürme deneyleri için önemlidir, ve aslında P. aeruginosa (37 ° c, 25 ° c sonra 24 h 24 h için) iki adım kuluçka sıvı öldürme21', uygulanan bu tahlil ( gereksiz Şekil 2C). Eklemek mümkün iken önemli ölçüde böylece P. aeruginosa düz gecede LB kültüründen ölümcül kinetik değiştirir ve tavsiye edilmez.
Ayrıca tahlil biyoloji anlama tahlil basitleştirilmesi Eğer uygun ve istenilen izin verir. Örneğin, ana bilgisayarın bu tahlil öldürmek en önemli sürücü siderophore pyoverdine ve pyoverdine tarafından neden olduğu ana bilgisayar toksisite demir7bağlamak için onun yetenek şartlı olduğunu. Bu nedenle, tahlil pyoverdine zengin filtrate, saf pyoverdine veya hatta bazı sentetik Demir şelat kimyasallar (Örneğin, 1,10-pH) canlı bakteri için C. elegans transkripsiyon yanıt yerine basitleştirilmiş olabilir bu tedavilere çok benzer (Şekil 3)22yaşında.
Kanıt birkaç farklı çizgiler deneysel Kur sağlamlık için konuş. İlk olarak, kurulum ilk bakteriyel konsantrasyonları geniş bir kaldırabilir. Konsantrasyonları OD600 düşük olsa da zamanlama (Şekil 4A) vardiya 0.0025 (önerilen daha yaklaşık 10 kat daha düşük) hala sergi zaman ve konsantrasyon bağımlı öldürme, =. İkinci olarak, testin tekrarlanabilirlik böyle az olduğu 4 kuyu istatistiksel olarak anlamlı verileri (Şekil 4B) elde etmek sık sık yeterli oluyor.
Biz tavsiye etmiyorum birkaç değişiklik vardır. Örneğin, ilk bakteri inocula iletişim kuralında listelenenden daha yüksek konsantrasyonları ile kullanarak; İşin çok hangi Puanlama ölümcül olmak zordur zor ya da imkansız etkili silsin için kalın, biyofilm gibi malzeme içinde sonuçlanır. Ayrıca, yüksek konsantrasyon bakteriyel inocula Ayrıca oksijen için rekabet ve non-spesifik ana öldürme7tetikler.
Başka bir önemli not tahlil durdurma ve ölü solucanlar Imaging arasındaki süreyi sınırlamak için farklıdır. Verimli olması için önemlidir bu yüzden bu zaman çerçevesi boyama, içermesi gerektiğini unutmayın. Ölümünden sonra solucanlar içinde biyolojik malzeme bükün ve/veya bakteriler tarafından tüketilen başlar. 24-32 h birkaç içinde sadece manikür kalır. Manikür çok kötü lekeleri ve çok hafif, kolay yıkama sırasında kaybetmek için yapım. Suşları veya çok farklı kinetik ile zorlanma/RNAi şartları öldürme bu fenomen tarafından (diğerleri zaten içeriklerini kaybetmiş ve görüntü mümkün iken bazı solucanlar hala hayatta olabilirYani, ) karmaşık unutmamak gerekir. Solucanlar plaka, sol tarafındaki olarak bu fenomen, Şekil 4A gösterir çok düşük ilk bakteriyel konsantrasyonları ile aşılanmış, hala büyük ölçüde çok daha yüksek konsantrasyonları sinin solucanlar plaka, sağ tarafında ise hayattasın bakteri, ama zaten takdis oldum uzakta.
Tahlil başarı çok önemli bir belirleyici toplayıp verileri çözümlemek için kullanılan yöntem budur. Bizim laboratuarımızda, biz bu deneyleri veri toplamak için en az üç yöntem kullandık: spectrophotometry, otomatik mikroskobu ve akış vermimetry (Yani, akış sitometresi teknikleri için C. elegansuyarlaması; kelimenin tam anlamıyla, ölçüm kurtlardan akan bir çözümde). Bu yöntemlerden ilki bir spectophotometer boya veya muhabir söz konusu solucanların floresans okumak için kullanır. Bu yöntem oldukça her yerde bir ekipman (Mikroplaka Okuyucu ile bir standart spektrofotometre) parçası kullanmanın avantajı vardır ve veri elde etmek için en hızlı yöntemdir. Ancak, bu bilgi içerik otomatik mikroskobu mevcuttur ve akış vermimetry istatistiksel gücünü yoksun.
Otomatik mikroskobu uygun bir seçenektir. Mikroplaka görüntüleme sistemleri bir dizi şu anda piyasa, büyük, tek bir araştırmacı (Örneğin, bir biyo-Tek Cytation5) için uygun olan fiyatları arasında değişen daha pahalı ve daha sık çekirdeğinde bulunan daha yüksek kaliteli makineler vardır. Özellikleri (Örneğin, moleküler aygıt ImageXpress mikroskop). Uygulamada, bu çözümlerin çoğu çoğu ekranlar ve deneyleri Puanlama için mükellef bulunmaktadır. En otomatik görüntüleme platformları da (Örneğin, değişebilen, ImageJ, Gene5 veya hücre Profiler) verim bilgi daha fazla için işleme görüntü için aşağı akım yazılım birleştiğinde olabilir. Yardımcı programı işleme örnekleri Şekil 5 ve Şekil 6' da gösterilmiştir. Sinyal-gürültü oranı ( Şekil 5olduğu gibi) yüksek olduğunda, analiz basit ve olumlu ve olumsuz koşullar arasında ayrımcılık saçmadır. Bu gibi durumlarda, hatta zayıf sayısı kolayca tespit edilebilir. Birçok deneyleri, ancak, daha zayıf bir sinyal-gürültü oranı var. Örneğin, pembe-1::GFP22 Worms (ile onların pharynges kurucu mCherry ifade) 1,10-phenathroline ile tedavi pembe-1::GFP düzeyini artırır. Veri analizi için indüklenebilir GFP muhabir bünye mCherry sinyal (Şekil 6) normalleştirilmiş. Bu durumda, muhabir zayıf ifadesi olan ve/veya solucanlar çoğunda etkin değil. Bu nedenle, arka plan azaltmak ve sinyal yükseltmek ek görüntü işleme araçları, hücre Profiler gibi uygulama avantajlı olabilir.
COPAS FlowPilot varsa, son olarak, bu veri akışı vermimetry yoluyla elde etmek için kullanılabilir. Çok akış sitometresi daha tanıdık kavramı gibi bu enstrüman floresans C. elegans en az iki ya da üç kanalları teker ölçmek için kullanılabilir. Bu yöntem çok yüksek istatistiksel anlamlılık ile veri edinimi için mükellef olur, ama daha fazla işlem hacmi çok otomatik mikroskobu ile karşılaştırıldığında azaldı. Akış vermimetry en önemli yetenek bir REPLICATE yerine onları birden çok kuyu bölme ve kuyuları ortalamasını analiz için tek bir grup olarak tüm solucan nüfus çözümlemek için avantajdır. Büyük gruplar halinde bu moda önemli ölçüde analiz istatistiksel gücü artırır ve hatta küçük etkileri algılanmasını sağlar.
Sıvı öldürme tahlil değişiklikler
Testin son gelişmeler floresan gazetecilere (Şekil 6), orta-yüksek verimi RNAi teknikleri (Şekil 3) ve hatta orijinal ikame kullanarak aktivasyonu raporlaması dahil ederek onun usefulness genişletmiştir patojen.
Kurmak RNAi kullanmanın en belirgin nedeni ana savunma yolları P. aeruginosa (veya diğer patojenleri) karşı için test etmektir. RNAi nakavt tahlil içinde hayatta kalmak için ilgili genlerin örnekleri Şekil 3' te gösterilmektedir. Önceki gözlemler20,23,24,25ile tutarlı, daf-2(RNAi) C. elegans hayatta kalma P. aeruginosa, maruz daf-16 (süre sırasında gelişmiş RNAi), zip-2(RNAi) ve cebp-1(RNAi) kısaltılmış. Belirtildiği gibi RNAi en sadece solucanlar multiwell plakaları nerede her biri de farklı RNAi klon içerir büyüyen tahlil dahil edilmiştir. Agar ve küçük birimler dahil yüksek viskozite nedeniyle, Üniforma, kabarcık-free dolum özel ekipman olmadan 96-şey plakaların elde etmek zordur. İç wells, agar kırmak için sigara homojenlik ve önemli potansiyel lider daha hızlı dış Kuyu kuru olarak Ayrıca, RNAi taşıyan bakteri suşları kurutma da bir sorun olabilir. Yukarıda da belirtildiği gibi bu yuva için solucanlar hayvanlar tarama ve sıvı işleme makine tıkanma riskleri için mevcut sayısını azaltarak teşvik eder. İçin her ikisi de bu nedenlerle 24-şey plakaları 96-şey tabak çalışmak daha kolay. Her ne kadar bu tahlil çıkışını azaltır, geliştirmek güvenilirlik ve özellikle başlangıç ekran için önerilmektedir.
Son olarak, tahlil P. aeruginosa E. faecalistirile değiştirmek için tahlil değiştirildi. (Uygun kültür ve maruz kalma koşulları tanımlanır koşuluyla prensip olarak, diğer bakteriyel türler ile ikame aşırı zorluklar, sağlamamalıdır.) En önemli faktör dikkate patojen, büyüme ve gelişme için ve virülans indüksiyon için medya gereksinimleri olduğunu. Örneğin, Gram pozitif, fırsatçı patojen E. faecalistir besin açısından zengin kitle iletişim araçları (beğenmek BHI) ve kuluçka P. aeruginosa14,-26kıyasla daha yüksek sıcaklıklarda gerektirir. Bu faktörler dikkate, adaptasyon alarak tarafından E. faecalistir kullanmak için tahlil açıktı. P. aeruginosaiçin belirtildiği gibi zamana bağımlı öldürme (Şekil 7) gördük. İlginçtir, ölüm zamanlaması ağar kaplamalar26, mekanizmaları patogenezinde dahil değişir önerebilir miyim bu adımı yokluğu rağmen yükleyemeyebileceğini kullanılan önceden yayınlanmış deneyleri benzer.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58068/58068fig1.jpg"> Şekil 1: sıvı tabanlı C. elegans - P. aeruginosa enfeksiyon tahlil düzeni. Nematot yayma ve hazırlık adımları sol tarafında, bakteriyel hazırlık sağda. Her ikisi de içeren adımları ortalanır. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/58068/58068fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58068/58068fig2.jpg"> Resim 2: C. elegans P. aeruginosa tarafından öldürülmesi özeldir ve doğru bakteriyel beslenme gerektirir. (A) C. elegans ölüm E. coli ve P. aeruginosa. (B) P. aeruginosa huzurunda C. elegans ölümüyle (sağ) ve ezelî karıştırmak için eklendi (sol) yavaş öldürmek kitle iletişim araçları (Yani, S sadece bazal). S bazal en az bir medya ve bakteriyel büyüme için gerekli besinleri içermiyor ve pyoverdine üretimini önler. (C) C. elegans ölüm farklı hazırlanan P. aeruginosahuzurunda. p < 0,01, öğrencinin tdayalı-test. Hata çubukları S.E.M. kuyu başına biyolojik REPLICATE koşul başına kullanılan 10 temsil eder. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/58068/58068fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58068/58068fig3.jpg"> Şekil 3: P. aeruginosa C. elegans direnç bağışıklık ana bilgisayar yolları üzerinde bağlıdır. Seçili RNAi nakavtlar bir panel P. aeruginosa (a)ya da 1,10-pH ( P. aeruginosa maruz sıvı içinde taklit eden kimyasal bir şelatör) ile tedavi edildi (B). p < 0,01, #p < 0,05, öğrencinin tdayalı-test. Hata çubukları S.E.M. kuyu başına biyolojik REPLICATE koşul başına kullanılan 10 temsil eder. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/58068/58068fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58068/58068fig4.jpg"> Şekil 4: P. aeruginosa öldürerek C. elegans sağlamdır ve bakteri konsantrasyonu bağlıdır. (A-B) temsilcisi görüntüler(a)ve miktar (B) için 72 h. p P. aeruginosa değişen konsantrasyonları maruz kaldıktan sonra C. elegans ölüm-değerleri hesaplanan alan öğrencinin üzerinde t -test. Ölçek çubuğu(a)1 mm. 16 kuyu başına biyolojik REPLICATE koşul başına kullanılan var. BF: Parlak alan, FL: floresan. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/58068/58068fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58068/58068fig5.jpg"> Şekil 5: veri toplama ve görüntü işleme bir testin güçlü bir sinyal ile. (A)temsilcisi görüntüleri canlı (negatif kontrol) ve ölü (pozitif kontrol) C. elegans. (B) istatistiksel analize dayalı veri toplama yöntemi, işlem modu ve analiz kuyu sayısı negatif ve pozitif kontrol eder. (C) Floresan bir 96-şey plaka (iki pozitif ve iki negatif kontrol kuyusu) dört bireysel kuyulardan solucanlar için analiz edildi. Her şey ~ 100 solucanlar içeriyordu. Grafikteki her nokta zaman--(hangi ile ilişkili olan ama yaşam kurtlardan hasas nedeniyle Imperfectly boyutunu gösterir) Uçuş ve Sytox portakal ile lekeli solucan floresans ölçülen gösteren tek bir solucan temsil eder. Pozitif kontrol solucanlar önceden ısı poz tarafından öldürüldü. Gerginlik ve ölü solucanlar şeklinde değişiklikler nedeniyle ((A) görüldüğü gibi ölü solucanlar daha çubuk gibi görünür ve birkaç vücut kıvrımları) yaşayan meslektaşlarına göre ölü solucanlar var uzun bir TOF. p-değerleri hesaplanan dayalı bir öğrenci t-test. Ölçek çubuğu(a)olduğunu 1 mm. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/58068/58068fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58068/58068fig6.jpg"> Şekil 6: veri toplama ve görüntü işleme bir testin ılımlı bir sinyal ile. (A)bir indüklenebilir pembe-1::GFP muhabir ve bir mCherry bünye işaretçisi (extrachromosomal diziden genlerin ifade normalize etmek) taşıyan C. elegans temsilcisi görüntülerini. C. elegans DMSO (negatif kontrol) veya 1,10-pH (pozitif kontrol) maruz. (B) istatistiksel analize dayalı veri toplama yöntemi, işlem modu ve analiz kuyu sayısı negatif ve pozitif kontrol eder. (C) dört bireysel wells bir 96-şey plaka (iki pozitif ve iki negatif kontrol kuyusu) akış vermimetry kullanarak analiz edildi. p-değerleri hesaplanan dayalı bir öğrenci t-test. Ölçek çubuğu(a)olduğunu 1 mm. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/58068/58068fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58068/58068fig7.jpg"> Şekil 7: E. faecalistir öldürerek C. elegans sağlam ve zaman bağımlıdır. (A-B) temsilcisi görüntüler(a)ve miktar (B) C. elegans ölüm uzun süre maruz E. faecalistir. p < 0,01, öğrencinin tdayalı-test. 10 kuyu başına koşul başına biyolojik REPLICATE kullanılmıştır. Hata çubukları temsil S.E.M. ölçek çubuğu (A) 1 mm. olan <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/58068/58068fig7large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem at JoVE.com

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

Burada bir uyarlanabilir, tüm ana bilgisayar, ana bilgisayar-patojen etkileşimleri çalışma ve ilaç keşfi için kullanılması için kullanılması gereken yüksek içerik tarama aracı bir protokol açıklayın.

Yüksek işlem hacmi, yüksek-içerik, sıvı tabanlı C. elegans Pathosystem

The number of new drugs identified by traditional, in vitro screens has waned, reducing the success of this approach in the search for new weapons to ...

a-high-throughput-high-content-liquid-based-c-elegans-pathosystem

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

14.4K Görüntüleme.  Rice University. Burada bir uyarlanabilir, tüm ana bilgisayar, ana bilgisayar-patojen etkileşimleri çalışma ve ilaç keşfi için kullanılması için kullanılması gereken yüksek içerik tarama aracı bir protokol açıklayın.

Video: A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages for identifying biologically active chemical structures that can modify complex phenotypes such as lifespan. Described here is a simple protocol for producing hundreds of 96-well culture plates with fairly consistent numbers of C. elegans in each well. Next, we specified how to use these cultures to screen thousands of chemicals for effects on the lifespan of the nematode C. elegans. This protocol makes use of temperature sensitive sterile strains, agar plate conditions, and simple animal handling to facilitate the rapid and high throughput production of synchronized animal cultures for screening.

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Here we describe a simple protocol for rapidly producing hundreds of nematode growth media agar, 96-well culture plates with consistent numbers of Caenorhhabditis elegans per well. These cultures are useful for the phenotypic screening of whole organisms. We focus here on using these cultures to screen chemicals for pro-longevity effects.

Yüksek işlem hacmi Caenorhabditis Elegans kimyasal tarama için basit bir yöntem

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Biyokimya

Automated Analysis of a Nematode Population-based Chemosensory Preference Assay

The nematode, Caenorhabditis elegans' compact nervous system of only 302 neurons underlies a diverse repertoire of behaviors. To facilitate the dissection of the neural circuits underlying these behaviors, the development of robust and reproducible behavioral assays is necessary. Previous C. elegans behavioral studies have used variations of a "drop test", a "chemotaxis assay", and a "retention assay" to investigate the response of C. elegans to soluble compounds. The method described in this article seeks to combine the complementary strengths of the three aforementioned assays. Briefly, a small circle in the middle of each assay plate is divided into four quadrants with the control and experimental solutions alternately placed. After the addition of the worms, the assay plates are loaded into a behavior chamber where microscope cameras record the worms' encounters with the treated regions. Automated video analysis is then performed and a preference index (PI) value for each video is generated. The video acquisition and automated analysis features of this method minimizes the experimenter's involvement and any associated errors. Furthermore, minute amounts of the experimental compound are used per assay and the behavior chamber's multi-camera setup increases experimental throughput. This method is particularly useful for conducting behavioral screens of genetic mutants and novel chemical compounds. However, this method is not appropriate for studying stimulus gradient navigation due to the close proximity of the control and experimental solution regions. It should also not be used when only a small population of worms is available. While suitable for assaying responses only to soluble compounds in its current form, this method can be easily modified to accommodate multimodal sensory interaction and optogenetic studies. This method can also be adapted to assay the chemosensory responses of other nematode species.

We present a behavior recording setup and protocol that enables automated analysis of the nematode, Caenorhabditis elegans' preference for soluble compounds in a population-based assay. This article describes the construction of a behavior chamber, the behavioral assay protocol, and video analysis software usage.

Nematod Popülasyona Dayalı Kemoterapi Tercihi Testinin Otomatik Analizi

The nematode, Caenorhabditis elegans' compact nervous system of only 302 neurons underlies a diverse repertoire of behaviors. To facilitate the dissection ...

Davranış

A High-throughput Assay for the Prediction of Chemical Toxicity by Automated Phenotypic Profiling of Caenorhabditis elegans

Applying toxicity testing of chemicals in higher order organisms, such as mice or rats, is time-consuming and expensive, due to their long lifespan and maintenance issues. On the contrary, the nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) has advantages to make it an ideal choice for toxicity testing: a short lifespan, easy cultivation, and efficient reproduction. Here, we describe a protocol for the automatic phenotypic profiling of C. elegans in a 384-well plate. The nematode worms are cultured in a 384-well plate with liquid medium and chemical treatment, and videos are taken of each well to quantify the chemical influence on 33 worm features. Experimental results demonstrate that the quantified phenotype features can classify and predict the acute toxicity for different chemical compounds and establish a priority list for further traditional chemical toxicity assessment tests in a rodent model.

A High-throughput Assay for the Prediction of Chemical Toxicity by Automated Phenotypic Profiling of Caenorhabditis elegans

A quantitative method has been developed to identify and predict the acute toxicity of chemicals by automatically analyzing the phenotypic profiling of Caenorhabditis elegans. This protocol describes how to treat worms with chemicals in a 384-well plate, capture videos, and quantify toxicological related phenotypes.

Bir yüksek-den geçerek tahlil tarafından otomatik fenotipik profil oluşturma Caenorhabditis elegans ve kimyasal toksisitesi tahmin için

Applying toxicity testing of chemicals in higher order organisms, such as mice or rats, is time-consuming and expensive, due to their long lifespan and ...

Çevre

Culture and Assay of Large-Scale Mixed-Stage Caenorhabditis elegans Populations

Caenorhabditis elegans (C. elegans) has been and remains a valuable model organism to study developmental biology, aging, neurobiology, and genetics. The large body of work on C. elegans makes it an ideal candidate to integrate into large-population, whole-animal studies to dissect the complex biological components and their relationships with another organism. In order to use C. elegans in collaborative -omics research, a method is needed to generate large populations of animals where a single sample can be split and assayed across diverse platforms for comparative analyses.
Here, a method to culture and collect an abundant mixed-stage C. elegans population on a large-scale culture plate (LSCP) and subsequent phenotypic data is presented. This pipeline yields sufficient numbers of animals to collect phenotypic and population data, along with any data needed for -omics experiments (i.e., genomics, transcriptomics, proteomics, and metabolomics). In addition, the LSCP method requires minimal manipulation to the animals themselves, less user preparation time, provides tight environmental control, and ensures that handling of each sample is consistent throughout the study for overall reproducibility. Lastly, methods to document population size and population distribution of C. elegans life stages in a given LSCP are presented.

Culture and Assay of Large-Scale Mixed-Stage Caenorhabditis elegans Populations

To use Caenorhabditis elegans (C. elegans) in omics research, a method is needed to generate large populations of worms where a single sample can be measured across platforms for comparative analyses. Here, a method to culture C. elegans populations on large-scale culture plates (LSCPs) and to document population growth is presented.

Büyük Ölçekli Karma Aşama Caenorhabditis Elegans Popülasyonlarının Kültürü ve Tahlilleri

Caenorhabditis elegans (C. elegans) has been and remains a valuable model organism to study developmental biology, aging, neurobiology, and genetics. The ...

Genetik

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of Alzheimer's disease (AD) and is found in Lewy body dementia, inclusion body myositis and cerebral amyloid angiopathy 1-4. Amylopathies progressively develop with time. For this reason simple organisms with short lifespans may help to elucidate molecular aspects of these conditions. Here, we describe experimental protocols to study A&beta;-mediated neurodegeneration using the worm Caenorhabditis elegans. Thus, we construct transgenic worms by injecting DNA encoding human A&beta;42 into the syncytial gonads of adult hermaphrodites. Transformant lines are stabilized by a mutagenesis-induced integration. Nematodes are age synchronized by collecting and seeding their eggs. The function of neurons expressing A&beta;42 is tested in opportune behavioral assays (chemotaxis assays). Primary neuronal cultures obtained from embryos are used to complement behavioral data and to test the neuroprotective effects of anti-apoptotic compounds.

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

We describe methods to study aspects of amylopathies in the worm C. elegans. We show how to construct worms expressing human A&beta;42 in neurons and how to test their function in behavioral assays. We further show how to obtain primary neuronal cultures that can be used for pharmacological testing.

Bir<em&gt; Caenorhabditis elegans</emAmylopathy Çalışmaları&gt; Model Sistemi

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of ...

Nörobilim

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes. However, many compounds identified in screens using cell culture models are often found to be toxic or pharmacologically inactive in vivo1-2. Screening in whole animal models can help avoid these pitfalls and streamline the path to drug development.
C. elegans is a multicellular model organism well suited for HTS. It is small (&lt;1 mm) and can be economically cultured and dispensed in liquids. C. elegans is also one of the most experimentally tractable animal models permitting rapid and detailed identification of drug mode-of-action3.
We describe a protocol for culturing and dispensing fluorescent strains of C. elegans for high-throughput screening of chemical libraries or detection of environmental contaminants that alter the expression of a specific gene. Large numbers of developmentally synchronized worms are grown in liquid culture, harvested, washed, and suspended at a defined density. Worms are then added to black, flat-bottomed 384-well plates using a peristaltic liquid dispenser. Small molecules from a chemical library or test samples (e.g., water, food, or soil) can be added to wells with worms. In vivo, real-time fluorescence intensity is measured with a fluorescence microplate reader. This method can be adapted to any inducible gene in C. elegans for which a suitable reporter is available. Many inducible stress and developmental transcriptional pathways are well defined in C. elegans and GFP transgenic reporter strains already exist for many of them4. When combined with the appropriate transgenic reporters, our method can be used to screen for pathway modulators or to develop robust biosensor assays for environmental contaminants. 
We demonstrate our C. elegans culture and dispensing protocol with an HTS assay we developed to monitor the C. elegans cap &#x2018;n&#x2019; collar transcription factor SKN-1. SKN-1 and its mammalian homologue Nrf2 activate cytoprotective genes during oxidative and xenobiotic stress5-10. Nrf2 protects mammals from numerous age-related disorders such as cancer, neurodegeneration, and chronic inflammation and has become a major chemotherapeutic target11-13.Our assay is based on a GFP transgenic reporter for the SKN-1 target gene gst-414, which encodes a glutathione-s transferase6. The gst-4 reporter is also a biosensor for xenobiotic and oxidative chemicals that activate SKN-1 and can be used to detect low levels of contaminants such as acrylamide and methyl-mercury15-16.

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

A procedure for liquid-based culturing and dispensing of C. elegans strains expressing fluorescent reporter proteins is described that does not require expensive sorting equipment. This approach can be applied to numerous inducible C. elegans genes for drug discovery or biosensing of contaminants.

Floresan ile yüksek verim Tarama ve Biyoalgılayıcı C. elegans Suşlarının

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes.  However, many compounds identified in ...

Biyoloji

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

RNA interference is a powerful method to understand gene function, especially when conducted at a whole-genome scale and in a quantitative context. In C. elegans, gene function can be knocked down simply and efficiently by feeding worms with bacteria expressing a dsRNA corresponding to a specific gene 1. While the creation of libraries of RNAi clones covering most of the C. elegans genome 2,3 opened the way for true functional genomic studies (see for example 4-7), most established methods are laborious. Moy and colleagues have developed semi-automated protocols that facilitate genome-wide screens 8. The approach relies on microscopic imaging and image analysis. 
	Here we describe an alternative protocol for a high-throughput genome-wide screen, based on robotic handling of bacterial RNAi clones, quantitative analysis using the COPAS Biosort (Union Biometrica (UBI)), and an integrated software: the MBioLIMS (Laboratory Information Management System from Modul-Bio) a technology that provides increased throughput for data management and sample tracking. The method allows screens to be conducted on solid medium plates. This is particularly important for some studies, such as those addressing host-pathogen interactions in C. elegans, since certain microbes do not efficiently infect worms in liquid culture.
	We show how the method can be used to quantify the importance of genes in anti-fungal innate immunity in C. elegans. In this case, the approach relies on the use of a transgenic strain carrying an epidermal infection-inducible fluorescent reporter gene, with GFP under the control of the promoter of the antimicrobial peptide gene nlp 29 and a red fluorescent reporter that is expressed constitutively in the epidermis. The latter provides an internal control for the functional integrity of the epidermis and nonspecific transgene silencing9. When control worms are infected by the fungus they fluoresce green. Knocking down by RNAi a gene required for nlp 29 expression results in diminished fluorescence after infection. Currently, this protocol allows more than 3,000 RNAi clones to be tested and analyzed per week, opening the possibility of screening the entire genome in less than 2 months.

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

We describe a protocol using C. elegans and RNAi feeding libraries that allows automated measurement of multiple parameters such as fluorescence, size and opacity of individual worms in a population. We give one example of a screen to identify genes involved in anti-fungal innate immunity in C. elegans.

Nicel ve Otomatik Yüksek throughput Genom çapında RNAi Ekranlar C. elegans</em

RNA interference is a powerful method to understand gene function, especially when conducted at a whole-genome scale and in a quantitative context. In C. ...

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

Caenorhabditis elegans is a well-established animal model in biomedical research, widely employed in functional genomics and ageing studies. To assess the health and fitness of the animals under study, one typically relies on motility readouts, such as the measurement of the number of body bends or the speed of movement. These measurements usually involve manual counting, making it challenging to obtain good statistical significance, as time and labor constraints often limit the number of animals in each experiment to 25 or less. Since high statistical power is necessary to obtain reproducible results and limit false positive and negative results when weak phenotypic effects are investigated, efforts have recently been made to develop automated protocols focused on increasing the sensitivity of motility detection and multi-parametric behavioral profiling. In order to extend the limit of detection to the level needed to capture the small phenotypic changes that are often crucial in genetic studies and drug discovery, we describe here a technological development that enables the study of up to 5,000 individual animals simultaneously, increasing the statistical power of the measurements by about 1,000-fold compared to manual assays and about 100-fold compared to other available automated methods.

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

We describe protocols for using the wide field-of-view nematode tracking platform (WF-NTP), which enables high-throughput phenotypic characterization of large populations of Caenorhabditis elegans. These protocols can be used to characterize subtle behavioral changes in mutant strains or in response to pharmacological treatment in a highly scalable fashion.

Otomatik davranış analizi büyük C. elegans nüfus kullanarak bir geniş alan bakış açısı izleme platformu

Caenorhabditis elegans is a well-established animal model in biomedical research, widely employed in functional genomics and ageing studies. To assess the ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

C. elegans Chemotaxis Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates. Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis behavior.
 The premise behind testing the response of the worms to an odorant is to place them in an area and observe the movement evoked in response to an odorant. Even with the many available assays, optimizing worm starting location relative to both the control and test areas, while minimizing the interaction of worms with each other, while maintaining a significant sample size remains a work in progress 1-10. The method described here aims to address these issues by modifying the assay developed by Bargmann et al.1. A Petri dish is divided into four quadrants, two opposite quadrants marked "Test" and two are designated "Control". Anesthetic is placed in all test and control sites. The worms are placed in the center of the plate with a circle marked around the origin to ensure that non-motile worms will be ignored. Utilizing a four-quadrant system rather than one 2 or two 1 eliminates bias in the movement of the worms, as they are equidistant from test and control samples, regardless of which side of the origin they began. This circumvents the problem of worms being forced to travel through a cluster of other worms to respond to an odorant, which can delay worms or force them to take a more circuitous route, yielding an incorrect interpretation of their intended path. This method also shows practical advantages by having a larger sample size and allowing the researcher to run the assay unattended and score the worms once the allotted time has expired.

C. elegans Chemotaxis Assay

A method of quantitatively evaluating the chemotactic response of Caenorhabditis elegans is described. A chemotactic index (CI) was employed as a way to precisely evaluate the response of worms to certain targets, and serve as a platform of comparison between strains and compounds of interest.

C. elegans Kemotaksis Deneyi

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

High-Throughput Screening of Microbial Isolates with Impact on Caenorhabditis elegans Health

With its small size, short lifespan, and easy genetics, Caenorhabditis elegans offers a convenient platform to study the impact of microbial isolates on host physiology. It also fluoresces in blue when dying, providing a convenient means of pinpointing death. This property has been exploited to develop high-throughput label-free C. elegans survival assays (LFASS). These involve time-lapse fluorescence recording of worm populations set in multiwell plates, from which population median time of death can be derived. The present study adopts the LFASS approach to screen multiple microbial isolates at once for the effects on C. elegans susceptibility to severe heat and oxidative stresses. Such microbial screening pipeline, which can notably be used to prescreen probiotics, using severe stress resistance as a proxy for host health is reported here. The protocol describes how to grow both C. elegans gut microbiota isolate collections and synchronous worm populations in multiwell arrays before combining them for the assays. The example provided covers the testing of 47 bacterial isolates and one control strain on two worm strains, in two stress assays in parallel. However, the approach pipeline is readily scalable and applicable to the screening of many other modalities. Thus, it provides a versatile setup to rapidly survey a multiparametric landscape of biological and biochemical conditions that impact C. elegans health.

High-Throughput Screening of Microbial Isolates with Impact on Caenorhabditis elegans Health

Gut microbes may positively or negatively impact the health of their host via specific or conserved mechanisms. Caenorhabditis elegans is a convenient platform to screen for such microbes. The present protocol describes high-throughput screening of 48 bacterial isolates for impact on nematode stress resistance, used as a proxy for worm health.

Caenorhabditis elegans Health Üzerinde Etkisi Olan Mikrobiyal İzolatların Yüksek Verimli Taraması

With its small size, short lifespan, and easy genetics, Caenorhabditis elegans offers a convenient platform to study the impact of microbial isolates on ...

Yüksek işlem hacmi, yüksek-içerik, sıvı tabanlı C. elegans Pathosystem

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler