Name: a high-throughput, high-content, liquid-based c. elegans pathosystem
Uploaded: 2018-07-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem at JoVE.com

Diese Studie wurde von der Krebsprävention und Research Institute of Texas (CPRIT) Award RR150044, Welch Foundation Research Grant C-1930, und von den nationalen Instituten der Gesundheit K22 AI110552 verliehen an NVK unterstützt. Die Geldgeber hatten keine Rolle beim Studiendesign, Datenerhebung und Analyse, Entscheidung, zu veröffentlichen oder der Manuskripterstellung.

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Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte offenlegen.

Dieser Assay (oder ähnliche Tests wo andere Krankheitserreger für p. Aeruginosa oder E. Faecalisersetzt werden) eignet sich für eine Vielzahl von Zwecken, einschließlich der Arzneimittelforschung. Es ist auch nützlich für grundlegende biologische Fragestellungen, z. B. Virulenzfaktoren, die Aufklärung der Host Verteidigung Bahnen, Identifizierung und Bestimmung der regulatorischen Maschinen der Wirt-Erreger-Interaktion beteiligt.
Obwohl p. Aeruginosa flüssige Tötung-Assay robust ist, gibt es einige Punkte, wo sorgfältige Augenmerk gelegt werden sollte, um das Risiko des Scheiterns zu minimieren. Zunächst, wie bereits erwähnt, muss die bakterielle Quelle Platte für p. Aeruginosa Impfungen bleiben frisch, damit die Bakterien Virulenz, trotz über Nacht LB verlieren. Zweitens ist es Schlüssel um sicherzustellen, dass Calcium und Magnesium p. Aeruginosa töten Assays hinzugefügt werden. Ohne sie wird Virulenz erheblich gefährdet. Schließlich ist es erwähnenswert, dass Würmer aufgezogen auf HT115 (für RNAi-basierten Assays) deutlich später sterben werden als Würmer auf OP50 aufgezogen (N. Kirijenko, persönliche Kommunikation). Aus diesem Grund, wenn RNAi-basierten Studien zu wechseln ist es wichtig, empirisch zu bestimmen, den beste Zeitpunkt für den Assay.
Für das Töten von Assays mit p. Aeruginosa oder E. Faecalis, ist es wichtig, sicherzustellen, dass gibt es ausreichend Nahrung für die Entwicklung der Würmer aus der L1-Stufe, bis sie bereit sind, in der Probe verwendet werden. Hunger, auch kurzfristig, ist bekannt für eine Anzahl von Host Verteidigung Wege, wie der DAF-2/DAF-16 Insulin/IGF Signalisierung Netzwerk27aktivieren. Unsere Daten deuten darauf hin, dass DAF-16/FOXO ist bereits leicht durch flüssige20kultiviert wird aktiviert, und weitere Aktivierung stark unerwünscht, ist da DAF-16/FOXO Breitspektrum Erreger Widerstand23fördert.
Schließlich ist es entscheidend, völlig steril Würmer in jedem Test zu verwenden, die stützt sich auf Sterblichkeit als eine Anzeige. Wenn Würmer fruchtbar sind, wird in Flüssigkeit verursacht Schwierigkeiten bei der Eiablage. Infolgedessen schlüpfen einige der Embryonen innerhalb des übergeordneten Elements, was schließlich zu seinem Tod. Aus diesem Grund verwenden wir in der Regel eine genetische Läsion, wie glp-4(bn2)28, , das einen komplett durchdringungsmittel sterilen Phänotyp für diese Assays demonstriert. Die Verwendung von Chemikalien, die embryonale Entwicklung zu verhindern, aber immer noch erlauben, Eiablage, z. B. 5-Fluorodeoxyuridine (FUdR), sollte vermieden werden, da sie auch bakterielles Wachstum und Entwicklung beeinträchtigen.
Im allgemeinen fanden wir es sehr hilfreich, mehrere Zeitpunkte für die Analyse zu planen. Obwohl der Test robust ist und das Timing im Allgemeinen ist, können stochastische und unmerkliche Veränderungen den Zeitpunkt des Todes in der Probe innerhalb von 2-4 Stunden verschieben. Wenn Problembehandlung erforderlich ist, ist es oft hilfreich, zuerst die einfachsten Antworten überlegen; d. h. bereiten frische Medien, verwerfen die jüngsten Bakterienkulturen und erneut Streifen Bakterienstämme aus gefrorenen Vorräte, etc. , nur sehr selten diese Maßnahmen nicht den Assay Funktionalität wiederherzustellen.
Aufgrund der relativen Einfachheit der Methode kann eine Vielzahl von Modifikationen leicht durchgeführt werden. Ändern die Würmer aus einem einheitlichen glp-4(bn2) Hintergrund für Hochdurchsatz-RNAi-Screens, wie z. B. diejenigen beschreiben wir hier ist nützlich für die Identifizierung von Host Reaktion Wege für eine breite Palette von XENOBIOTIKA und giftige Chemikalien. Beispielsweise können durch das Hinzufügen der gleichen chemischen oder Toxin in jede Vertiefung der RNAi-Platten (z. B. Cry5B Toxin, Phenanthroline usw.), Wege, die die Sensibilität für diese Toxine zu ändern leicht identifiziert werden. Diese Arten von Bildschirmen können auch zur Verteidigung Netzwerke gegen das Spektrum der Erreger zu identifizieren, die C. Eleganszu infizieren.

Die Identifikation und Entwicklung von wirksamen, Breitspektrum-Antibiotika, nun vor fast einem Jahrhundert führte zu einem Wendepunkt im Gesundheitswesen gab es eine weit verbreitete Überzeugung, dass infektiöse Krankheit wäre eine Geißel der Vergangenheit. Innerhalb von wenigen Jahrzehnten begann dieser Optimismus zu schwinden als Erreger nach Erreger Resistenzmechanismen entwickelt, die diese einmal wunderbaren Behandlungen begrenzt. Eine Zeitlang schien das Wettrüsten zwischen Drug Discovery Bemühungen und die Erreger ausgeglichen. Der Missbrauch von Antibiotika hat jedoch vor kurzem bei der Entstehung von Pan-resistente Stämme von Klebsiella Pneumoniae, Acinetobacter Baumanii, Serratia Marcescensund p. Aeruginosa1gipfelte, 2,3,4.
P. Aeruginosa ist ein opportunistisch, Gram negative, Multi-Host Erreger, eine schwere Bedrohung für Patienten mit schweren Verbrennungen, diejenigen, die sind immungeschwächte oder Mukoviszidose. Es wird auch zunehmend als ein Erreger in schweren Nosokomialinfektionen, vor allem durch die laufende Übernahme von Antibiotikaresistenzen identifiziert. Um zu beginnen, um dieser Bedrohung zu begegnen, haben wir den gut dokumentierten C. Elegans-p. Aeruginosa Infektion System5verwendet. Unser Labor hat genutzt, dieses System zu entwickeln eine Liquid-basierter, Hochdurchsatz-, High-Content Screening-Plattform um neue Verbindungen zu identifizieren, die die Fähigkeit des Erregers, die Host-6töten zu begrenzen. Faszinierend, scheinen diese Verbindungen mindestens drei allgemeine Kategorien, einschließlich Antibiotika7 und Virulenz Inhibitoren8anzugehören. Andere High-Content-Droge-Entdeckung-Assays in C. Elegans für Mycobacterium Tuberculosum, Chlamydia Trachomatis, Yersinia Pestis, Listeria Monocytogenes, Francisella Tularensis, Staphylococcus Aureus, Candida Albicans, gemeldet wurden und Enterococcus Faecalis, unter anderem9,10,11,12,13,14,15,16. Diese Arten von Tests haben mehrere allgemein anerkannten Vorteile, wie die Begrenzung falsche positive Treffer, die möglicherweise giftig für beide der Host und der Erreger, erhöhte Wahrscheinlichkeit der Bioverfügbarkeit im Vergleich zu einem chemischen Bildschirm und Hits jenseits zu identifizieren einfach die Begrenzung mikrobiellen Wachstums, wie Anti-Virulents, immun stimulierende Moleküle oder Verbindungen, die sonst das Gleichgewicht der Wirt-Pathogen Interaktionen zu Gunsten der ehemaligen kippen. Darüber hinaus sind die Verbindungen entdeckt in diesen Bildschirmen oft wirksam bei Säugetieren Gastgeber.
Es ist erwähnenswert, dass mindestens zwei anderen Assays17,18 sind zur Durchführung von Hochdurchsatz-Bildschirme in C. Elegans in Flüssigkeit. Jeder dieser Tests ist jedoch eine Änderung, die die prototypische intestinale Kolonisation Assay, bekannt als langsam-Tötung, in Flüssigkeit, durchgeführt werden kann Erhöhung des Durchsatzes und ermöglicht Verbindungen leichter untersucht werden. Achten Sie darauf, dass Charakterisierung schlüssig nachgewiesen, dass die Mechanismen der bakteriellen Virulenz dieser Assays und unsere Liquid-basierter Bildschirm7unterschiedlich sind. Da beide Arten von Virulenz bei Säugetieren Systemen beobachtet werden, ist es wichtig zu überlegen, welche Virulenz Determinante für den Experimentator Interessen vor Assay Auswahl am relevantesten ist.
Hier zeigen wir eine optimierte Version der Liquid-basierter C. Elegans-P. Aeruginosa Assay. Wir berichten auch die Anpassung der unsere Liquid-basierter Assay-Methode, um den grampositiven bakteriellen Erreger beherbergen Enterococcus Faecalis. Wie p. Aeruginosaist E. Faecalis zunehmend als schwere nosokomiale Bedrohung mit einer wachsenden Bewaffnung der Antibiotikaresistenz Wege1erkannt. Obwohl eine frühere Methode für Hochdurchsatz-Screening von E. Faecalis 14vorhanden ist, erfordert es Preinfection mit dem Erreger, die das Verfahren kompliziert und erhöht die Wahrscheinlichkeit einer Kontaminierung Ausrüstung wie die COPAS-FlowSort. Unser Protokoll überflüssig vor Infektion, das Sicherheitsprofil zu verbessern. Zu guter Letzt berichten wir über ein Mittel, mit denen entweder diese Assays kombiniert werden können, mit der Fütterung RNAi, so dass der Benutzer suchen für Host-Faktoren, die eine bei der Schaffung Rolle oder Widerstandskraft gegen Infektionen.

<table><tbody><tr><td>COPAS FP BioSorter</td><td>Union Biometrica</td><td></td><td>Large object flow cytometer/worm sorter</td></tr><tr><td>Cytation 5</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EL406 Washer Dispenser</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multitron Pro</td><td>Infors HT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>24 Deep-Well RB Block</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>CS15124</td><td></td></tr><tr><td>384-Well plate</td><td>Greiner Bio-One</td><td>MPG-781091</td><td></td></tr><tr><td>Nematode Growth Media (NGM)</td><td></td><td></td><td>Amount per liter: 18 grams agar, 3 grams NaCl, 2.5 grams Peptone, 1 mL CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; (1 M), 1 mL MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (1 M), 25 mL Phospate buffer, and 973 mL of milli-Q water</td></tr><tr><td>Slow Killing (SK) plates</td><td></td><td></td><td>Amount per liter: 18 grams agar, 3 grams NaCl, 3.5 grams Peptone, 1 mL CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; (1 M), 1 mL MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (1 M), 25 mL Phospate buffer, and 973 mL of milli-Q water</td></tr><tr><td>Slow Killing (SK) media</td><td></td><td></td><td>Amount per liter:&amp;nbsp; 3 grams NaCl, 3.5 grams Peptone, 1 mL CaCl&lt;sub&gt;2 &lt;/sub&gt;(1 M), 1 mL MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (1 M), 25 mL Phosphate buffer, and 973 mL of milli-Q water</td></tr><tr><td>Lysogeny Broth (LB)</td><td>USBiological Life Sciences</td><td>L1520</td><td></td></tr><tr><td>Brian Heart Infusion broth (BHI)</td><td>Research Products International Corp</td><td>50-488-526</td><td></td></tr><tr><td>Worm Bleach Solution</td><td></td><td></td><td>Amount per 100 mL: 10 mL of 5 M NaOH solution, 20 mL of 5% Sodium Hypochlorite Solution, and 70 mL of sterile water</td></tr><tr><td>S Basal</td><td></td><td></td><td>Amount per liter: 5.85 grams NaCl, 6 grams KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 1 gram K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, and 1 Liter of milli-Q water</td></tr><tr><td>Agar</td><td>USBiological Life Sciences</td><td>A0930</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>USBiological Life Sciences</td><td>S5000</td><td></td></tr><tr><td>Peptone</td><td>USBiological Life Sciences</td><td>P3300</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>USBiological Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>M63-500</td><td></td></tr><tr><td>Phospate buffer</td><td></td><td></td><td>amount per liter: 132 mL of K2HPO4 (1M) and 868 mL of KH2PO4 (1M)</td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Acros Organics</td><td>7778-77-0</td><td></td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>USBiological Life Sciences</td><td>P5100</td><td></td></tr><tr><td>5% Sodium Hypochlorite Solution</td><td>BICCA</td><td>7495.5-32</td><td></td></tr><tr><td>NaOH solution</td><td>Fisher Scientific</td><td>SS255-1</td><td></td></tr><tr><td>Breathe-easy</td><td>Diversified Biotech</td><td>BEM-1</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Orange Nucleic Acid Stain</td><td>Fisher Scientific</td><td>S11368</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Bacterial Strains&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;P. aeruginosa &lt;/em&gt;(PA14)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. faecalis&lt;/em&gt;(OG1RF)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli &lt;/em&gt;superfood (OP50)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli &lt;/em&gt;RNAi expressing bacteria (HT115)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Worm Strains &lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;glp-4&lt;/em&gt;(&lt;em&gt;bn2&lt;/em&gt;) (Beanan and Strome, 1992, PMID: 1289064)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PINK-1::GFP reporter (Kang et al., 2018, PMID: 29532717)</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a high-throughput, high-content, liquid-based c. elegans pathosystem

Die Zahl der neuen Medikamente identifiziert durch traditionelle, in-vitro- Bildschirme hat nachgelassen, den Erfolg dieses Ansatzes bei der Suche nach neuen Waffen gegen mehrere Resistenzen reduzieren. Dies führte zu dem Schluss, dass Forscher nicht nur Notwendigkeit, neue Medikamente zu finden, sondern auch neue Wege zu finden, sie zu entwickeln müssen. Methoden gehören des vielversprechendsten Kandidat ganzen Organismus, in Vivo Tests dieser Verwendung Hochdurchsatz-, phänotypische auslesen und beherbergt, die von Caenorhabditis Elegans , Danio Rerioreichen. Diese Hosts haben mehrere leistungsstarke Vorteile, einschließlich dramatische Kürzungen in falsche positive Treffer, wie Verbindungen, die giftig für die Host- und/oder Biounavailable sind in der Regel bis in das Einstiegsbild vor kostspieligen folgen gelöscht werden.
Hier zeigen wir, wie unser Test verwendet wurde, um Host-Variation in den gut dokumentierten C. Eleganszu verhören –Pseudomonas Aeruginosa flüssige Tötung Pathosystem. Wir zeigen auch mehrere Erweiterungen dieser gut ausgearbeitete Technik. Wir sind beispielsweise Hochdurchsatz-genetische Bildschirme mit RNAi in 24 oder 96-Well Plattenformate Abfrage Host Faktoren in diesem Wirt-Pathogen Interaktionen durchführen zu können. Mit Hilfe dieser Assay, können gesamte Genom-Bildschirme in nur wenigen Monaten abgeschlossen werden die drastisch vereinfachen kann die Aufgabe Drogeziele potentiell ohne mühsame biochemische Reinigung Ansätze zu ermitteln.
Außerdem berichten wir hier eine Variation unserer Methode, die der gram-positiven Bakterium Enterococcus Faecalis für gramnegative Erreger p. Aeruginosaersetzt. Ähnlich wie bei p. Aeruginosader Fall ist, ist die Tötung von E. Faecalis zeitabhängig. Im Gegensatz zu früheren C. Elegans—E. Faecalis -Assays, unsere Assay für E. Faecalis ohne Preinfection auskommt, Verbesserung seiner Sicherheitsprofil und reduzieren die Wahrscheinlichkeit von kontaminierenden Flüssigkeiten Handhabungsgeräte. Der Test ist sehr robust, ~ 95 % Sterbeziffern 96 h Post Infektion zeigen.

Wichtige Parameter für die Testleistung
Ein richtiges Verständnis der zugrunde liegenden dieser Assay Biologie ist notwendig für die Problembehandlung und Optimierung der Assay. Zu diesem Zweck verweisen wir zunächst auf einige wichtige Papiere, die Aufklärung der Mechanismen der Pathogenese von p. Aeruginosa-vermittelte Tötung in liquid7,20. Unter der Voraussetzung, dass die oben genannten Schritte befolgt werden (siehe Abbildung 1 für eine schematische Darstellung der Assay-Protokoll) wird eine zeitabhängige Tötung von C. Elegans nur in Anwesenheit der Erreger (Abbildung 2A) eingehalten werden. Im Gegensatz dazu wird in das Fehlen von wichtigen Nahrungsergänzungen (z. B. wenn die Pepton aus den Medien bleibt, und nur der basalen S hinzugefügt wird), wenig bis keine Tötung (Abbildung 2 b) beobachtet werden. Interessant ist, dass die zweistufigen Inkubation von p. Aeruginosa (für 24 h bei 37 ° C, dann 24 h bei 25 ° C), ist von entscheidender Bedeutung für konventionelle langsam-Tötung-Assays und war ursprünglich, in flüssigen töten21, umgesetzt in diesem Assay ( entbehrlich Abbildung 2). Es ist zwar möglich, fügen Sie p. Aeruginosa direkt aus über Nacht LB Kultur damit deutlich ändert Letalität Kinetik und wird nicht empfohlen.
Assay-Biologie zu verstehen ermöglicht auch Vereinfachung des Assays, wenn angemessen und wünschenswert. Zum Beispiel der wichtigste Treiber der Host in diesem Assay zu töten ist Siderophore Pyoverdine, und Host Toxizität verursacht durch Pyoverdine ist abhängig von seiner Fähigkeit, Eisen7zu binden. Als solche kann der Test vereinfacht werden, mit der Substitution von Pyoverdine-reiche Filtrat, gereinigten Pyoverdine oder sogar einige synthetische Eisen chelatisierenden Chemikalien (z. B. 1,10-Phenanthroline) für lebende Bakterien als transcriptional Antwort der C. elegans für diese Behandlungen ist sehr ähnlich (Abbildung 3)22.
Verschiedene Linien des Beweises zu sprechen, die Robustheit des experimentellen Aufbaus. Erstens verträgt das Setup eine Vielzahl von anfänglichen Bakterienkonzentration. Konzentrationen von OD600 = 0.0025 (ca. 10-divisibel niedriger als empfohlen) noch Ausstellung zeitabhängig und Konzentration Tötung, obwohl das Timing (Abb. 4A) verlagern. Zweitens ist die Reproduzierbarkeit des Tests so, dass möglichst wenige als 4 Brunnen ist häufig ausreichend, um statistisch signifikante Daten (Abbildung 4 b) zu erhalten.
Es gibt einige Änderungen, die wir nicht empfehlen. Verwenden beispielsweise erste Bakterien Impfkulturen mit Konzentrationen viel höher als die im Protokoll aufgeführt; Dies führt in dicken, Biofilm Material, das schwierig oder unmöglich effektiv abzuwaschen ist die scoring Letalität erschwert. Darüber hinaus können hoher Konzentration bakterielle Impfkulturen auch konkurrieren für Sauerstoff und unspezifische Host töten7auslösen.
Ein weiterer wichtiger Hinweis ist den Zeitraum zwischen Stopp der Assay und imaging die toten Würmer zu begrenzen. Beachten Sie, dass dieser Zeitrahmen enthalten muss, Färbung, so ist es wichtig, effizient zu sein. Nach dem Tod beginnt das biologische Material in Worms zu Extrudieren und/oder von Bakterien konsumiert werden. Innerhalb von 24-32 h bleibt nur die Nagelhaut. Die Kutikula Flecken sehr schlecht und ist sehr leicht, macht es einfach, während Wäschen verlieren. Es ist wichtig zu beachten, dass Dehnungen oder Belastung/RNAi-Bedingungen mit sehr unterschiedlichen Kinetik des Tötens können durch dieses Phänomen (d. h. , die einige Würmer noch am Leben sein können, während andere bereits, deren Inhalt verloren haben und sind unmöglich zu Bild) erschwert werden. Abbildung 4A zeigt dieses Phänomen als Würmer auf der linken Seite der Platte, lebst mit sehr geringen anfänglichen Bakterienkonzentration geimpft, noch weitgehend während der Würmer auf der rechten Seite der Platte, die viel höheren Konzentrationen von ausgesetzt wurden Bakterien, wurden weg gewaschen.
Eine sehr wichtige Determinante der Assay-Erfolg ist die Methode, die Daten sammeln und analysieren. In unserem Labor haben wir mindestens drei Methoden zum Sammeln von Daten von dieser Assays verwendet: Spektrophotometrie, automatisierte Mikroskopie und Fluss Vermimetry (d. h. die Anpassung des Flow Cytometry Techniken zu C. Elegans; wörtlich: die Messung Würmer in einer flüssigen Lösung). Die erste dieser Methoden verwendet eine Spectophotometer um die Fluoreszenz der Farbstoff oder Reporter der Würmer in Frage zu lesen. Diese Methode hat den Vorteil, mit einem ziemlich allgegenwärtig Stück Ausrüstung (ein standard Spektralfotometer mit einer Mikrotestplatte Leser) und ist die schnellste Methode, um Daten zu erwerben. Allerdings mangelt es den Informationsgehalt von automatisierten Mikroskopie und die statistische Aussagekraft der Fluss Vermimetry.
Automatisierte Mikroskopie ist eine weitere nützliche Option. Eine Reihe von Mikrotestplatte bildgebende Systeme sind derzeit auf dem Markt, bis hin zu Preisen, die erschwinglich sind für einen einzelnen Forscher (z. B. ein Bio-Tek Cytation5) zu größeren, teureren und hochwertigere Maschinen, die häufiger im Kern gefunden werden Einrichtungen (z. B. eine molekulare Geräte ImageXpress Mikroskop). In der Praxis sind die meisten dieser Lösungen für erzielte die meisten Bildschirme und Assays. Automatisierte Bildverarbeitung-Plattformen können auch nachgeschaltete Software zur Bildbearbeitung (z. B. MetaMorph, ImageJ, Gene5 oder Zelle Profiler) um die Ausbeute an Informationen weiter gekoppelt werden. Beispiele für den Nutzen der Verarbeitung sind in Abbildung 5 und Abbildung 6. Wenn das Signal-Rausch-Verhältnis (wie in Abbildung 5) hoch ist, Analyse ist einfach und Unterscheidung zwischen positiven und negativen Bedingungen ist trivial. In diesen Fällen können auch schwache Treffer leicht identifiziert werden. Viele Tests haben jedoch eine schwächere Signal-Rausch-Verhältnis. Behandlung von PINK-1::GFP22 Würmer (mit konstitutiven mCherry Ausdruck in ihren Pharynges) mit 1,10-Phenathroline erhöht beispielsweise die PINK-1::GFP. Für die Datenanalyse ist die induzierbare GFP-Reporter auf der konstitutiven mCherry Signal (Abbildung 6) normalisiert. In diesem Fall die Reporter hat schwächere Ausdruck und/oder in der Mehrheit der Würmer nicht aktiviert ist. Daher kann es vorteilhaft sein, Umsetzung zusätzliche Bildbearbeitungs-Tools, wie Zelle Profiler, die Hintergrund reduzieren und Signal verstärken.
Schließlich, wenn ein COPAS FlowPilot verfügbar ist, kann es zur Gewinnung von Daten über Fluss Vermimetry verwendet werden. Viel kann wie die bekannteren Konzept der Durchflusszytometrie, dieses Instrument zur Messung der Fluoreszenz von C. Elegans in mindestens zwei oder drei Kanäle gleichzeitig verwendet werden. Diese Methode ist sehr zugänglich für den Erwerb von Daten mit hoher statistischer Signifikanz, aber der Durchsatz ist sehr viel im Vergleich zu automatisierten Mikroskopie vermindert. Der wichtigste Vorteil der Fluss Vermimetry liegt in der Fähigkeit, ganze Wurm Populationen als eine einzelne Gruppe replizieren, anstatt sie in mehrere Vertiefungen aufteilen und Analyse des Durchschnitts der Brunnen zu analysieren. Große Gruppen auf diese Weise dramatisch analysieren die statistische Aussagekraft verbessert und ermöglicht die Erkennung von auch kleine Effekte.
Änderungen des flüssigen Tötung Assays
Aktuelle Entwicklungen des Assays haben seine Nützlichkeit erweitert durch Aktivierung der fluoreszierenden Reporter (Abbildung 6), Medium-High Throughput RNAi Techniken (Abbildung 3), und auch die Ersetzung der ursprünglichen Untersuchung einschließlich Erreger.
Der offensichtlichste Grund RNAi einrichten verwenden soll für Host Verteidigung Bahnen gegen p. Aeruginosa (oder andere Krankheitserreger) zu testen. Beispiele für RNAi Knockdown von Genen, die relevant für das Überleben in der Probe sind in Abbildung 3dargestellt. In Übereinstimmung mit früheren Beobachtungen20,23,24,25, verbesserte daf-2(RNAi) C. Elegans überleben während der Exposition gegenüber p. Aeruginosa, während Daf-16) RNAi), zip-2(RNAi) und cebp-1(RNAi) gekürzt. Wie bereits erwähnt, gehört RNAi am einfachsten in der Probe, die wachsende Worms am multiwell-Platten wo jeder auch einen unterschiedlichen RNAi-Klon enthält. Aufgrund der hohen Viskosität der Agar und Kleinmengen beteiligt ist es schwierig, einheitliche, blasenfreie Füllung der 96-Well-Platten ohne spezielle Ausrüstung zu erreichen. Trocknen die Bakterienstämme, die Durchführung der RNAi kann darüber hinaus auch ein Problem sein, da die äußeren Brunnen Trocknen schneller als inneren Brunnen führt zu Uneinheitlichkeit und bedeutende Potenzial auf Agar Risse. Wie bereits erwähnt, fördert diese Würmer zu buddeln, Verringerung der Zahl der Tiere für Screening und Risiken Verstopfung Liquid-Handling-Maschinen zur Verfügung. Für beide der folgenden Gründe sind 24-Well Platten einfacher zu handhaben als 96-Well-Platten. Obwohl das Assay Durchsatz reduziert, es verbessert die Zuverlässigkeit und empfiehlt sich besonders für Einstiegsbilder.
Schließlich wurde der Test Assay p. Aeruginosa mit E. Faecalisersetzen geändert. (Im Prinzip Substitution mit anderen Bakterienarten nicht unnötige Schwierigkeiten, soll unter der Voraussetzung, dass geeignete Kultivierung und Expositionsbedingungen identifiziert werden.) Der wichtigste Faktor zu berücksichtigen ist die Medienanforderungen des Erregers, für Wachstum und Entwicklung und für die Induktion der Virulenz. Beispielsweise erfordert der Gram positive, opportunistische Erreger E. Faecalis nährstoffreiche Medien (wie BHI) und Inkubation bei höheren Temperaturen im Vergleich zu p. Aeruginosa14,26. Unter Berücksichtigung dieser Faktoren, Anpassung der Assay, E. Faecalis zu verwenden war einfach. Wie bereits erwähnt für p. Aeruginosa, sahen wir zeitabhängige Tötung (Abbildung 7). Interessanterweise war der Zeitpunkt des Todes ähnlich wie zuvor veröffentlichten Assays, die Pre-Infektion auf Agar-Platten26, trotz des Fehlens von diesem Schritt, was darauf hindeuten könnte verwendet, dass die Mechanismen in der Pathogenese variieren.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58068/58068fig1.jpg"> Abbildung 1: Schema für Liquid-basierter C. Elegans – p. Aeruginosa Infektion Assay. Schritten, Nematoden Ausbreitung und Vorbereitung sind Links, bakterielle Vorbereitung sind auf der rechten Seite. Schritten, beide sind zentriert. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/58068/58068fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58068/58068fig2.jpg"> Abbildung 2: Tötung von C. Elegans durch p. Aeruginosa ist spezifisch und erfordert die richtige bakterielle Ernährung. (A) C. Elegans Tod im Beisein von E. Coli und p. Aeruginosa. (B) C. Elegans Tod im Beisein von p. Aeruginosa mit (rechts) und ohne (links) langsam töten Medien Mischen hinzugefügt (d. h. S nur basal). Basalen S ist eine minimale Medien und enthält keine für das bakterielle Wachstum benötigten Nährstoffe und verhindert die Produktion von Pyoverdine. (C) C. Elegans Tod im Beisein von anders vorbereitet p. Aeruginosa. p < 0,01, basierend auf der Student t-test. Fehlerbalken darzustellen S.E.M 10 Brunnen pro biologische replizieren pro Zustand verwendet wurden. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/58068/58068fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58068/58068fig3.jpg"> Abbildung 3: C. Elegans Widerstand gegen p. Aeruginosa hängt Host immun Wege. Eine Gruppe von ausgewählten RNAi Niederschlägen wurde mit p. Aeruginosa (A) oder 1,10-Phenanthroline (eine chemische Chelator, die Exposition gegenüber p. Aeruginosa in Flüssigkeit imitiert) behandelt (B). p < 0,01, #p < 0,05, basierend auf der Student t-test. Fehlerbalken darzustellen S.E.M 10 Brunnen pro biologische replizieren pro Zustand verwendet wurden. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/58068/58068fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58068/58068fig4.jpg"> Abbildung 4: C. Elegans Tötung durch p. Aeruginosa ist robust und bakterielle Konzentration abhängig. (A-B) repräsentative Bilder (A) und (B) Quantifizierung von C. Elegans Tod nach Exposition mit unterschiedlichen Konzentrationen von p. Aeruginosa für 72 h p-Werte wurden berechnet anhand des Schülers t -test. Maßstabsleiste in (A) ist 1 mm. 16 Brunnen pro biologische replizieren pro Zustand verwendet wurden. BF: Helles Feld, FL: Fluoreszenz. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/58068/58068fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58068/58068fig5.jpg"> Abbildung 5: Erwerb und Bild Datenverarbeitung ein Test mit einem starken Signal. (A) repräsentative Bilder live (Negativkontrolle) und Toten (Positivkontrolle) C. Elegans. (B) statistische Analyse der negativen und positiven Steuerelemente basierend auf Daten Erwerbsmethode Verarbeitungsmodus und Anzahl der Bohrungen analysiert. (C) Fluoreszenz wurde für Würmer aus vier einzelnen Vertiefungen einer 96-Well-Platte (zwei Positive und 2 negative Kontrolle Brunnen) analysiert. Jeder enthielt auch ~ 100 Würmer. Jeder Punkt im Diagramm stellt einen einzigen Wurm, Time-of-Flight (die korreliert mit, sondern durch das Aufwickeln der lebende Würmer unvollkommen entspricht Größe) und die gemessene Fluoreszenz für Würmer, die gefärbt sind mit Sytox Orange zeigen. Positivkontrolle Würmer wurden vorab durch Hitzeeinwirkung getötet. Aufgrund von Änderungen in Form von toten Würmer und Spannung (wie in (A) gesehen werden kann, erscheinen mehr stabförmige toten Würmer und haben einige Körper Kurven) im Vergleich zu lebenden, toten Würmer haben eine längere TOF. p-Werte wurden anhand der Student t-test. Maßstabsleiste in (A) beträgt 1 mm. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/58068/58068fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58068/58068fig6.jpg"> Abbildung 6: Erwerb und Bild Datenverarbeitung ein Test mit einem moderaten Signal. (A) repräsentative Bilder von C. Elegans tragen ein induzierbares PINK-1::GFP-Reporter und ein mCherry konstitutiv Marker (um die Expression von Genen aus dem Extrachromosomale Array zu normalisieren). C. Elegans DMSO (Negativkontrolle) oder 1,10-Phenanthroline (Positivkontrolle) ausgesetzt. (B) statistische Analyse der negativen und positiven Steuerelemente basierend auf Daten Erwerbsmethode Verarbeitungsmodus und Anzahl der Bohrungen analysiert. (C) vier individuelle Vertiefungen einer 96-Well-Platte (zwei Positive und 2 negative Kontrolle Brunnen) wurden mit Flow Vermimetry analysiert. p-Werte wurden anhand der Student t-test. Maßstabsleiste in (A) beträgt 1 mm. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/58068/58068fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58068/58068fig7.jpg"> Abbildung 7: C. Elegans Tötung durch E. Faecalis ist robust und Zeit abhängig. (A-B) repräsentative Bilder (A) und (B) Quantifizierung von C. Elegans Tod nach Exposition gegenüber E. Faecalis. p < 0,01, basierend auf der Student t-test. 10 Bohrungen wurden pro biologische replizieren pro Zustand verwendet. Fehlerbalken darzustellen S.E.M Maßstabsbalken in (A) ist 1 mm. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/58068/58068fig7large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

Hier beschreiben wir eine Protokoll, die ist ein anpassungsfähiges, ganze Host, High-Content-Screening-Tool, das genutzt werden kann, um Wirt-Pathogen Interaktionen zu untersuchen und für die Wirkstoffforschung verwendet werden.

Ein High-Throughput, High-Content, Liquid-basierter C. Elegans Pathosystem

The number of new drugs identified by traditional, in vitro screens has waned, reducing the success of this approach in the search for new weapons to ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

14.4K Aufrufe.  Rice University. Hier beschreiben wir eine Protokoll, die ist ein anpassungsfähiges, ganze Host, High-Content-Screening-Tool, das genutzt werden kann, um Wirt-Pathogen Interaktionen zu untersuchen und für die Wirkstoffforschung verwendet werden.

Serie: A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages for identifying biologically active chemical structures that can modify complex phenotypes such as lifespan. Described here is a simple protocol for producing hundreds of 96-well culture plates with fairly consistent numbers of C. elegans in each well. Next, we specified how to use these cultures to screen thousands of chemicals for effects on the lifespan of the nematode C. elegans. This protocol makes use of temperature sensitive sterile strains, agar plate conditions, and simple animal handling to facilitate the rapid and high throughput production of synchronized animal cultures for screening.

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Here we describe a simple protocol for rapidly producing hundreds of nematode growth media agar, 96-well culture plates with consistent numbers of Caenorhhabditis elegans per well. These cultures are useful for the phenotypic screening of whole organisms. We focus here on using these cultures to screen chemicals for pro-longevity effects.

Eine einfache Methode zur chemischen Hochdurchsatz-Screening in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Forschung

Biochemie

Automated Analysis of a Nematode Population-based Chemosensory Preference Assay

The nematode, Caenorhabditis elegans' compact nervous system of only 302 neurons underlies a diverse repertoire of behaviors. To facilitate the dissection of the neural circuits underlying these behaviors, the development of robust and reproducible behavioral assays is necessary. Previous C. elegans behavioral studies have used variations of a "drop test", a "chemotaxis assay", and a "retention assay" to investigate the response of C. elegans to soluble compounds. The method described in this article seeks to combine the complementary strengths of the three aforementioned assays. Briefly, a small circle in the middle of each assay plate is divided into four quadrants with the control and experimental solutions alternately placed. After the addition of the worms, the assay plates are loaded into a behavior chamber where microscope cameras record the worms' encounters with the treated regions. Automated video analysis is then performed and a preference index (PI) value for each video is generated. The video acquisition and automated analysis features of this method minimizes the experimenter's involvement and any associated errors. Furthermore, minute amounts of the experimental compound are used per assay and the behavior chamber's multi-camera setup increases experimental throughput. This method is particularly useful for conducting behavioral screens of genetic mutants and novel chemical compounds. However, this method is not appropriate for studying stimulus gradient navigation due to the close proximity of the control and experimental solution regions. It should also not be used when only a small population of worms is available. While suitable for assaying responses only to soluble compounds in its current form, this method can be easily modified to accommodate multimodal sensory interaction and optogenetic studies. This method can also be adapted to assay the chemosensory responses of other nematode species.

We present a behavior recording setup and protocol that enables automated analysis of the nematode, Caenorhabditis elegans' preference for soluble compounds in a population-based assay. This article describes the construction of a behavior chamber, the behavioral assay protocol, and video analysis software usage.

Automatisierte Analyse eines Nematoden-Populations-basierten Chemosensorischen Präferenzassays

The nematode, Caenorhabditis elegans' compact nervous system of only 302 neurons underlies a diverse repertoire of behaviors. To facilitate the dissection ...

Verhalten

A High-throughput Assay for the Prediction of Chemical Toxicity by Automated Phenotypic Profiling of Caenorhabditis elegans

Applying toxicity testing of chemicals in higher order organisms, such as mice or rats, is time-consuming and expensive, due to their long lifespan and maintenance issues. On the contrary, the nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) has advantages to make it an ideal choice for toxicity testing: a short lifespan, easy cultivation, and efficient reproduction. Here, we describe a protocol for the automatic phenotypic profiling of C. elegans in a 384-well plate. The nematode worms are cultured in a 384-well plate with liquid medium and chemical treatment, and videos are taken of each well to quantify the chemical influence on 33 worm features. Experimental results demonstrate that the quantified phenotype features can classify and predict the acute toxicity for different chemical compounds and establish a priority list for further traditional chemical toxicity assessment tests in a rodent model.

A High-throughput Assay for the Prediction of Chemical Toxicity by Automated Phenotypic Profiling of Caenorhabditis elegans

A quantitative method has been developed to identify and predict the acute toxicity of chemicals by automatically analyzing the phenotypic profiling of Caenorhabditis elegans. This protocol describes how to treat worms with chemicals in a 384-well plate, capture videos, and quantify toxicological related phenotypes.

Ein High-Throughput-Assay für die Vorhersage der chemischen Toxizität durch automatisierte phänotypischen Profilierung von Caenorhabditis elegans

Applying toxicity testing of chemicals in higher order organisms, such as mice or rats, is time-consuming and expensive, due to their long lifespan and ...

Umwelt

Culture and Assay of Large-Scale Mixed-Stage Caenorhabditis elegans Populations

Caenorhabditis elegans (C. elegans) has been and remains a valuable model organism to study developmental biology, aging, neurobiology, and genetics. The large body of work on C. elegans makes it an ideal candidate to integrate into large-population, whole-animal studies to dissect the complex biological components and their relationships with another organism. In order to use C. elegans in collaborative -omics research, a method is needed to generate large populations of animals where a single sample can be split and assayed across diverse platforms for comparative analyses.
Here, a method to culture and collect an abundant mixed-stage C. elegans population on a large-scale culture plate (LSCP) and subsequent phenotypic data is presented. This pipeline yields sufficient numbers of animals to collect phenotypic and population data, along with any data needed for -omics experiments (i.e., genomics, transcriptomics, proteomics, and metabolomics). In addition, the LSCP method requires minimal manipulation to the animals themselves, less user preparation time, provides tight environmental control, and ensures that handling of each sample is consistent throughout the study for overall reproducibility. Lastly, methods to document population size and population distribution of C. elegans life stages in a given LSCP are presented.

Culture and Assay of Large-Scale Mixed-Stage Caenorhabditis elegans Populations

To use Caenorhabditis elegans (C. elegans) in omics research, a method is needed to generate large populations of worms where a single sample can be measured across platforms for comparative analyses. Here, a method to culture C. elegans populations on large-scale culture plates (LSCPs) and to document population growth is presented.

Kultur und Assay von großflächigen Caenorhabditis elegans-Populationen im gemischten Stadium

Caenorhabditis elegans (C. elegans) has been and remains a valuable model organism to study developmental biology, aging, neurobiology, and genetics. The ...

Genetik

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of Alzheimer's disease (AD) and is found in Lewy body dementia, inclusion body myositis and cerebral amyloid angiopathy 1-4. Amylopathies progressively develop with time. For this reason simple organisms with short lifespans may help to elucidate molecular aspects of these conditions. Here, we describe experimental protocols to study A&beta;-mediated neurodegeneration using the worm Caenorhabditis elegans. Thus, we construct transgenic worms by injecting DNA encoding human A&beta;42 into the syncytial gonads of adult hermaphrodites. Transformant lines are stabilized by a mutagenesis-induced integration. Nematodes are age synchronized by collecting and seeding their eggs. The function of neurons expressing A&beta;42 is tested in opportune behavioral assays (chemotaxis assays). Primary neuronal cultures obtained from embryos are used to complement behavioral data and to test the neuroprotective effects of anti-apoptotic compounds.

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

We describe methods to study aspects of amylopathies in the worm C. elegans. We show how to construct worms expressing human A&beta;42 in neurons and how to test their function in behavioral assays. We further show how to obtain primary neuronal cultures that can be used for pharmacological testing.

A<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Modell-System für Amylopathy Study

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of ...

Neurowissenschaften

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes. However, many compounds identified in screens using cell culture models are often found to be toxic or pharmacologically inactive in vivo1-2. Screening in whole animal models can help avoid these pitfalls and streamline the path to drug development.
C. elegans is a multicellular model organism well suited for HTS. It is small (&lt;1 mm) and can be economically cultured and dispensed in liquids. C. elegans is also one of the most experimentally tractable animal models permitting rapid and detailed identification of drug mode-of-action3.
We describe a protocol for culturing and dispensing fluorescent strains of C. elegans for high-throughput screening of chemical libraries or detection of environmental contaminants that alter the expression of a specific gene. Large numbers of developmentally synchronized worms are grown in liquid culture, harvested, washed, and suspended at a defined density. Worms are then added to black, flat-bottomed 384-well plates using a peristaltic liquid dispenser. Small molecules from a chemical library or test samples (e.g., water, food, or soil) can be added to wells with worms. In vivo, real-time fluorescence intensity is measured with a fluorescence microplate reader. This method can be adapted to any inducible gene in C. elegans for which a suitable reporter is available. Many inducible stress and developmental transcriptional pathways are well defined in C. elegans and GFP transgenic reporter strains already exist for many of them4. When combined with the appropriate transgenic reporters, our method can be used to screen for pathway modulators or to develop robust biosensor assays for environmental contaminants. 
We demonstrate our C. elegans culture and dispensing protocol with an HTS assay we developed to monitor the C. elegans cap &#x2018;n&#x2019; collar transcription factor SKN-1. SKN-1 and its mammalian homologue Nrf2 activate cytoprotective genes during oxidative and xenobiotic stress5-10. Nrf2 protects mammals from numerous age-related disorders such as cancer, neurodegeneration, and chronic inflammation and has become a major chemotherapeutic target11-13.Our assay is based on a GFP transgenic reporter for the SKN-1 target gene gst-414, which encodes a glutathione-s transferase6. The gst-4 reporter is also a biosensor for xenobiotic and oxidative chemicals that activate SKN-1 and can be used to detect low levels of contaminants such as acrylamide and methyl-mercury15-16.

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

A procedure for liquid-based culturing and dispensing of C. elegans strains expressing fluorescent reporter proteins is described that does not require expensive sorting equipment. This approach can be applied to numerous inducible C. elegans genes for drug discovery or biosensing of contaminants.

High-Throughput-Screening und Biosensorik mit Fluorescent C. elegans Die Stämme

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes.  However, many compounds identified in ...

Biologie

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

RNA interference is a powerful method to understand gene function, especially when conducted at a whole-genome scale and in a quantitative context. In C. elegans, gene function can be knocked down simply and efficiently by feeding worms with bacteria expressing a dsRNA corresponding to a specific gene 1. While the creation of libraries of RNAi clones covering most of the C. elegans genome 2,3 opened the way for true functional genomic studies (see for example 4-7), most established methods are laborious. Moy and colleagues have developed semi-automated protocols that facilitate genome-wide screens 8. The approach relies on microscopic imaging and image analysis. 
	Here we describe an alternative protocol for a high-throughput genome-wide screen, based on robotic handling of bacterial RNAi clones, quantitative analysis using the COPAS Biosort (Union Biometrica (UBI)), and an integrated software: the MBioLIMS (Laboratory Information Management System from Modul-Bio) a technology that provides increased throughput for data management and sample tracking. The method allows screens to be conducted on solid medium plates. This is particularly important for some studies, such as those addressing host-pathogen interactions in C. elegans, since certain microbes do not efficiently infect worms in liquid culture.
	We show how the method can be used to quantify the importance of genes in anti-fungal innate immunity in C. elegans. In this case, the approach relies on the use of a transgenic strain carrying an epidermal infection-inducible fluorescent reporter gene, with GFP under the control of the promoter of the antimicrobial peptide gene nlp 29 and a red fluorescent reporter that is expressed constitutively in the epidermis. The latter provides an internal control for the functional integrity of the epidermis and nonspecific transgene silencing9. When control worms are infected by the fungus they fluoresce green. Knocking down by RNAi a gene required for nlp 29 expression results in diminished fluorescence after infection. Currently, this protocol allows more than 3,000 RNAi clones to be tested and analyzed per week, opening the possibility of screening the entire genome in less than 2 months.

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

We describe a protocol using C. elegans and RNAi feeding libraries that allows automated measurement of multiple parameters such as fluorescence, size and opacity of individual worms in a population. We give one example of a screen to identify genes involved in anti-fungal innate immunity in C. elegans.

Quantitative und automatisierte Hochdurchsatz-genomweiten RNAi-Screens in C elegans</em

RNA interference is a powerful method to understand gene function, especially when conducted at a whole-genome scale and in a quantitative context. In C. ...

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

Caenorhabditis elegans is a well-established animal model in biomedical research, widely employed in functional genomics and ageing studies. To assess the health and fitness of the animals under study, one typically relies on motility readouts, such as the measurement of the number of body bends or the speed of movement. These measurements usually involve manual counting, making it challenging to obtain good statistical significance, as time and labor constraints often limit the number of animals in each experiment to 25 or less. Since high statistical power is necessary to obtain reproducible results and limit false positive and negative results when weak phenotypic effects are investigated, efforts have recently been made to develop automated protocols focused on increasing the sensitivity of motility detection and multi-parametric behavioral profiling. In order to extend the limit of detection to the level needed to capture the small phenotypic changes that are often crucial in genetic studies and drug discovery, we describe here a technological development that enables the study of up to 5,000 individual animals simultaneously, increasing the statistical power of the measurements by about 1,000-fold compared to manual assays and about 100-fold compared to other available automated methods.

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

We describe protocols for using the wide field-of-view nematode tracking platform (WF-NTP), which enables high-throughput phenotypic characterization of large populations of Caenorhabditis elegans. These protocols can be used to characterize subtle behavioral changes in mutant strains or in response to pharmacological treatment in a highly scalable fashion.

Automatisierte verhaltensbasierte Analyse der großen C. Elegans Populationen verwenden ein breites Sichtfeld Tracking-Plattform

Caenorhabditis elegans is a well-established animal model in biomedical research, widely employed in functional genomics and ageing studies. To assess the ...

Immunologie und Infektion

C. elegans Chemotaxis Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates. Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis behavior.
 The premise behind testing the response of the worms to an odorant is to place them in an area and observe the movement evoked in response to an odorant. Even with the many available assays, optimizing worm starting location relative to both the control and test areas, while minimizing the interaction of worms with each other, while maintaining a significant sample size remains a work in progress 1-10. The method described here aims to address these issues by modifying the assay developed by Bargmann et al.1. A Petri dish is divided into four quadrants, two opposite quadrants marked "Test" and two are designated "Control". Anesthetic is placed in all test and control sites. The worms are placed in the center of the plate with a circle marked around the origin to ensure that non-motile worms will be ignored. Utilizing a four-quadrant system rather than one 2 or two 1 eliminates bias in the movement of the worms, as they are equidistant from test and control samples, regardless of which side of the origin they began. This circumvents the problem of worms being forced to travel through a cluster of other worms to respond to an odorant, which can delay worms or force them to take a more circuitous route, yielding an incorrect interpretation of their intended path. This method also shows practical advantages by having a larger sample size and allowing the researcher to run the assay unattended and score the worms once the allotted time has expired.

C. elegans Chemotaxis Assay

A method of quantitatively evaluating the chemotactic response of Caenorhabditis elegans is described. A chemotactic index (CI) was employed as a way to precisely evaluate the response of worms to certain targets, and serve as a platform of comparison between strains and compounds of interest.

C. elegans Chemotaxis-Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

High-Throughput Screening of Microbial Isolates with Impact on Caenorhabditis elegans Health

With its small size, short lifespan, and easy genetics, Caenorhabditis elegans offers a convenient platform to study the impact of microbial isolates on host physiology. It also fluoresces in blue when dying, providing a convenient means of pinpointing death. This property has been exploited to develop high-throughput label-free C. elegans survival assays (LFASS). These involve time-lapse fluorescence recording of worm populations set in multiwell plates, from which population median time of death can be derived. The present study adopts the LFASS approach to screen multiple microbial isolates at once for the effects on C. elegans susceptibility to severe heat and oxidative stresses. Such microbial screening pipeline, which can notably be used to prescreen probiotics, using severe stress resistance as a proxy for host health is reported here. The protocol describes how to grow both C. elegans gut microbiota isolate collections and synchronous worm populations in multiwell arrays before combining them for the assays. The example provided covers the testing of 47 bacterial isolates and one control strain on two worm strains, in two stress assays in parallel. However, the approach pipeline is readily scalable and applicable to the screening of many other modalities. Thus, it provides a versatile setup to rapidly survey a multiparametric landscape of biological and biochemical conditions that impact C. elegans health.

High-Throughput Screening of Microbial Isolates with Impact on Caenorhabditis elegans Health

Gut microbes may positively or negatively impact the health of their host via specific or conserved mechanisms. Caenorhabditis elegans is a convenient platform to screen for such microbes. The present protocol describes high-throughput screening of 48 bacterial isolates for impact on nematode stress resistance, used as a proxy for worm health.

Hochdurchsatz-Screening mikrobieller Isolate mit Auswirkungen auf die Gesundheit von Caenorhabditis elegans

With its small size, short lifespan, and easy genetics, Caenorhabditis elegans offers a convenient platform to study the impact of microbial isolates on ...

Ein High-Throughput, High-Content, Liquid-basierter C. Elegans Pathosystem

Zusammenfassung

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