Name: a high-throughput, high-content, liquid-based c. elegans pathosystem
Uploaded: 2018-07-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
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이 연구는 국립 연구소의 건강 K22 AI110552 NVK에 게 수 여 및 암 예방 연구 텍사스 연구소 (CPRIT) 수상 RR150044, 웰 치 재단 연구 그랜트 C-1930 년에 의해 지원 되었다. Funders 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 결정 게시 또는 원고의 준비에 전혀 역할을 했다.

주의: 피 녹 농 균 과 E. faecalis 는 Biosafety 수준 2 병원 체, 그리고 우연한 감염을 방지 하 고 표면 오염 최소화 하기 위해 적절 한 안전 조치는가지고 야 한다. 모든 미디어 자료와 병원 균에 접촉 해야 합니다 수 소독 및/또는 삭제. 추가 지침 CDC 간행물 Biosafety Microbiological 및 생물 의학 실험실 (BMBL), 5 판에서에서 사용할 수 있습니다.
1. 준비 및 피 녹 농 균 의 유지 보수
<ol><li>파운드 (Lysogeny 국물) 한 천 배지 위에 냉동된 재고에서 행진 P. 녹 농 균 37 ℃에서 16 ~ 24 h를 품 어 참고: BSL-2 생물 안전 캐비닛 무 균을 보장 하기 위해 내부 P. 농 균 실험을 수행 합니다. 병원 성 감염 또는 오염 가능성을 최소화 하기 위해 적절 한 안전 조치를 사용 합니다.</li>
	<li>4 ° c.에이 접시를 전송 이 접시 4 ° C에서 유지 고 1 주일 문화를 예방 하는 데 사용 될 수 있습니다. 1 주일 후 오염을 제거 하 고 접시를 버리고 새로운 파운드 조 흔 격판덮개를 만들. 참고: 피 녹 농 균 독성 장기간된 보관 후 감소합니다.</li>
	<li>분석 결과 접시를 설정 하기 전에 2 일 1.1에서 만든 접시에서 피 녹 농 균 에의 한 식민지와 살 균 파운드 국물의 3-5 mL 접종. 12 ~ 16 h 37 ° C에서 품 어. 참고: 16 h 이상 품 어 하지 마십시오. 풍부한 액체 문화에서 P. 농 균 PA14 lyse 하기 시작 합니다.</li>
	<li>천천히 죽 일 미디어와 함께 살 균 10 cm 접시를 준비 (3 세대 NaCl, 3.5 g 펩, 1mm CaCl2, 1 mM MgSO4, 인산 염 버퍼의 25 mL (리터 당 금액: 132 mL K2HPO4 (1 M)의 고 KH2포4 (1 M)의 868 mL)와 18 g 천/L). 참고: 미리 접시를 준비 합니다. 그들은 최대 3 주까지 4 ° c.에 밀폐 용기에 저장할 수 있습니다.</li>
	<li>각 10 cm 느린 죽 플레이트 (SK 판) P. 녹 농 균 의 신선한 하룻밤 파운드 문화에서 350 μ와 씨앗 살 균 세균 분산기를 사용 하 여 미디어의 표면에 걸쳐 균일 하 게 박테리아를 확산 하 고 BSL-2 생물 안전 캐비닛에 건조를 허용 합니다.</li>
	<li>24 h에 대 한 37 ° C에서 접시를 품 어.</li>
</ol>2입니다. RNAi 박테리아의 준비
<ol><li>밖으로 행진 또는 냉동된 재고에서 적절 한 항생제 (100 µ g/mL에서 carbenicillin) 및 Ahringer와 비 달 라이브러리 15 µ g/mL에서 항생물질을 포함 하는 파운드 한 접시에 RNAi를 포함 하는 박테리아의 핀 전송 원하는 변종. 참고: nonpathogenic 박테리아를 작업할 때 사용 하거나 BSL-2 A / B 생물 안전 캐비닛 또는 BSL-1 층 류 후드 문화의 무 균을 보장 하 고 라이브러리의 교차 오염의 가능성을 최소화 하기 위해.</li>
	<li>37 ° c.에 24 h에 대 한 번호판을 품 어</li>
	<li>2 주 동안 4 ° C에서 접시를 저장.<ol>
<li>2 주 후 번호판을 삭제 하 고 갓 만든 번호판 교체.</li>
	</ol>
</li>
	<li>24 잘 깊은 잘 격판덮개의 단일에서 파운드 carbenicillin 보충의 4 mL 또는 멸 균 시험관에 각 복제에서 단일 식민지를 개별적으로 접종 하 여 동시에 여러 RNAi 긴장을 테스트 합니다. 참고: 항생물질은 RNAi의 효율성을 감소 시키기 위하여 알려졌다. 이 미디어에 그것을 사용 하지 마십시오.</li>
	<li>24 잘 깊은 잘 격판덮개 multiwell 격판덮개를 위한 최적화 된 떨고 인큐베이터에 배치 하 고 950 rpm에서 떨고 있는 동안 16 h 37 ° C에서 품 어. 참고: 그것은 기존의 떨고 인큐베이터를 사용 하 여 multiwell 격판덮개에 균일 한 박테리아의 성장을 얻기 어렵다입니다. 떨고 인큐베이터에서 제대로 성장 하는 문화에 대 한 순서로 750 rpm의 최소 흔들 수 있이 필요가 있다. 특수 셰이 커의 부재에서 개별 튜브에서 각 문화를 성장 가능 하다. 원하는 경우 문화 그 후, 원심 분리에 대 한 24-잘 접시로 옮겨질 수 있다.</li>
	<li>2000 x g에서 5 분간 centrifuging 여 박테리아를 수집 합니다.</li>
	<li>접시를 반전 하 고 적극적으로 흔들어 하 여 상쾌한을 가만히 따르다. RNAi 박테리아의 S 기저 (5.85 g NaCl, 1 g K2HPO4, 6 g KH2포4 초순 물 1 L에 녹이 고 압력솥에 의해 소독) 100 µ L resuspend</li>
	<li>NGM multiwell 격판덮개의 우물의 적절 한 수로 resuspended 박테리아를 플라스틱 (선 충 류 성장 매체, 3 세대 NaCl, 2.5 g 펩, 1mm CaCl2, 1 mM MgSO4, 인산 염 버퍼의 25 mL (리터 당 금액: 132 mL K2HPO4 (1 M) 그리고 KH2포4 (1 M)의 868 mL), 및 물의 리터 당 18 g 천) IPTG (1mm 최종 농도)와 carbenicillin (100 μ g/mL 최종 농도) 보충.<ol>
<li>6 잘 플레이트, 24-잘 접시의 우물 당 1 mL 또는 96 잘 접시의 당 150 µ L의 당 NGM 미디어의 3.5 mL를 사용 합니다.</li>
		<li>6 잘 플레이트;에 대 한 박테리아의 100 μ/잘 사용 50 μ/잘 24-잘; 또는 96 잘 접시 20 μ/잘. 건조를 허용 합니다. 참고: 건조 신속, 균일 한 건조를 촉진 하는 살 균 흐름 후드에서 정상적으로 수행 됩니다. 균일 건조 하는 것은 매우 중요 하다입니다. 벌레의 소리를 내는 agar에 균열 촉진으로 지나치게 건조 하지 마십시오. 웜 및 액체 처리 시스템의 잠재적인 막힘을이 끈다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>준비 된 접시를 사용 하 여 즉시 또는 나중에 사용에 대 한 최대 2 주 동안 그들을 4 ° C에서 저장. 참고: 접시 밖으로 건조 하지 않도록, 그들은 수 수 파라핀 플라스틱 필름으로 밀봉 또는 젖은 종이 타월로 단단히-밀폐 된 용기에 배치.</li>
</ol>3. 유지 보수 및 C. 선 충 의 준비
참고: 실험을 시작 하기 전에 생성 벗, 성인 자웅 동체 벌레의 동기화 된 인구 다음과 같습니다.
<ol><li>세척 벗 성인 (즉, 여러 개의 배아 생식 내 표시와 함께) 4-6-10cm NGM 번호판 플레이트, 부드럽게, 소용돌이 그리고 다음 15 mL 원뿔 튜브에 붓는 S 기저의 4 mL를 추가 하 여 15 mL 원뿔 튜브로에서.</li>
	<li>30 초 동안 1000 x g에서 원심 분리를 통해 웜 작은</li>
	<li>Aspirate 상쾌한, 웜 펠 렛을 방해 하지 않도록 주의 복용</li>
	<li>웜 표 백제 솔루션의 3.5 mL을 추가 (최종 농도 0.5 M NaOH, 살 균 물에 1% 염소) 웜 펠 릿을 1 분에 대 한 반전에 의해 혼합.</li>
	<li>짧게 소용돌이 고 30 초 동안 1000 x g에서 원심 분리기.</li>
	<li>발음 또는 웜 펠 렛을 방해 하지 않도록 주의 복용 상쾌한 가만히 따르다.</li>
	<li>웜 펠 릿에 신선한 웜 표 백제 솔루션의 3.5 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>적극적으로 혼합 표 백제 솔루션에서 벌레. 주기적으로 (약 매 10 초) 육안으로 직접 검사 해 현미경 벌레. 계란을 풀어 휴식, 웜 손톱에 대 한 감시. 성인 벌레의 대부분 해산된 (~ 95%) 되어, 일단 S 기저 막을 소화와 15 mL에 표 백제를 희석. 참고: 달걀 껍질은 성인 조직 보다 표 백제에 저항 하지만 그들은 장기간된 노출 시 녹을 수 있다. 계란 해체를 방지 하려면 표 백제 솔루션 7 분 이상 벌레 계란을 노출 하지 마십시오. 달걀 껍질은 과도 하 게 손상 된 경우, 태아 죽을 것 이다.</li>
	<li>30 초 동안 1000 x g에서 배아를 작은 발음 또는 배아의 펠 릿을 제거 하지 않고는 상쾌한 가만히 따르다.</li>
	<li>나머지 표 백제 솔루션을 희석을 S 15 mL의 최종 볼륨을 기저에 벌레를 resuspend.</li>
	<li>4 연속 세척의 총에 대 한 세척 단계 (3.9-3.10) 3 번 이상 반복 합니다.</li>
	<li>4 세척 후 상쾌한 발음 하 고 15 mL 원뿔 튜브로 살 균 S 기저의 5 또는 6 mL 추가 합니다. 목표는 배아 µ L 당 50 ~ 벌레의 농도를 resuspend 것입니다. 참고: S 기저의 금액; 계란 펠 릿의 크기에 따라 달라 집니다. 큰 펠 릿 더 S 기저는 필요 합니다.</li>
	<li>하룻밤 실 온에서 테이블 탑 회전 또는 15 ° c.에서 48 h에 원뿔 튜브를 품 어 애벌레는 부 화 하지만 애벌레 개발 L1 단계 (L1 diapause) 영양소 부족 때문에 체포 됩니다.</li>
	<li>그들의 대부분 부 화 하 고 개발의 L1 단계에서 체포는 확인 해 현미경 배아를 검사 합니다.</li>
	<li>웜 준비의 20 µ L S 기저의 80 µ L와 희석 함으로써 웜 수를 결정 합니다. 빈 NGM 접시에 직접 희석된 웜 솔루션의 10 µ L 플라스틱 2 번 더 반복 합니다.<ol>
<li>각 자리에 애벌레를 계산 하 고 평균 수를 결정 합니다. 이 평균 웜 준비 µ L 당 벌레의 대략적인 개수를 2로 나눕니다. 웜 preps 전파 격판덮개 또는 실험에 대 한 사용할 수 있습니다. 참고: 4-5 일 후 굶 어 애벌레 시작 됩니다 죽을; 이 시점에서 준비를 삭제 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>변형 전파, L1 웜 (5000-6000) 3-4 10-cm NGM 접시에 적절 한 수와 함께 발견 하는 피 펫 OP50 대장균- "superfood" 집중 (대장균 OP50 25 X 농도에서 발견 (즉, 1 L 1 박 OP50의 LB에서 성장 하는 문화 수익률 25 X OP50 superfood의 40 mL); 이 집중된 세균 현 탁 액 2 mL 각 10 cm NGM 접시에 발견).</li>
	<li>실험에 대 한 접시를 준비 하려면 ("기본 프로토콜" 사용 3.17.1 설치, "RNAi 스크린 설정" 사용 단계 3.17.2-적절 한 3.17.4에 대 한)에 대 한 다음 중 하나를 수행 합니다.<ol>
<li>피 펫 ~ 5000 웜/10 c m 플레이트 RNAi 또는 OP50 superfood로 시드.</li>
		<li>피 펫 ~ 500 웜/잘 6 잘 플레이트 RNAi와 시드.</li>
		<li>피 펫 ~ 300 웜/잘 24-잘 접시에에서 RNAi와 시드.</li>
		<li>피 펫 ~ 100 웜/잘 96 잘 접시에에서 RNAi와 시드. 참고: RNAi는 시드 방법에 대 한 지침을 참조 하십시오 단계 2.7-2.9 RNAi 박테리아의 준비에서.</li>
	</ol>
</li>
	<li>벌레의 비옥한 변형 사용 되 고, 품 어 벌레 ~ 44-48 h. 사용에 대 한 25 ° C에서이 벌레 가능한 한 빨리 후 인구는 적절 한 나이 도달 했습니다. 이 분석 결과 중 벌레 내에서 부 화 계란의 영향을 최소화 합니다.</li>
	<li>변형 사용 하는 경우는 살 균 온도 (예: fer-15(b26); fem-1(hc17) 또는 glp-4(bn2)), 벌레 ~ 16 h 15 ° C에서 품 어와 다음 44 h 개발을 완료 하 고 embryogenesis를 방지를 위한 25 ° C에 전송.</li>
</ol>4. 액체 분석 결과 설치 (기본 프로토콜)을 죽이
참고: 이것은 하나의 박테리아 스트레인과 벌레의 한 소스에 대 한 프로토콜입니다.
<ol><li>셀 스 크레이 퍼를 사용 하 여 SK 접시에서 피 녹 농 균 을 제거 하 고에 resuspend ~ S 기저의 5 mL. 필요한 경우 규모. (OD600) 분 광 광도 계를 사용 하 여 세균 현 탁 액의 광학 밀도 측정</li>
	<li>S 기저 OD600 ≈ 0.09에 (3 배 최종 농도)에 피 녹 농 균 의 희석된 증권의 24 mL를 준비 합니다. 잘, 당 최종 콘텐츠 4.6.2 참조 하 고 따라 세균 희석의 볼륨을 확장할.</li>
	<li>액체 느린 죽 미디어 (3 g의 NaCl, 펩/L CaCl2 와 1 m m의 최종 농도에 MgSO4 보완의 3.5 g) 21 mL를 추가 합니다. 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여, 박테리아와 미디어의 45 µ L 384-잘 접시의 각 잘 전송.</li>
	<li>50 mL 원뿔 관으로 (즉, 단계 3.17.1) 그들의 소스에서 벌레를 세척 하 고 벌레를 중력 아래 정착을 허용. 5 mL에 상쾌한 발음 Resuspend 50 mL S의 총 기초</li>
	<li>4.4 단계를 두 번 반복 합니다.</li>
	<li>웜 정렬을 사용 하 여, 약 22 웜 384-잘 접시의 각 음에 정렬 합니다. 참고: 설치 ~1.1 µ L의 액체에서 각 벌레를 삭제합니다. 22 벌레 25 µ L, 총 분석 결과 볼륨 70 µ L/잘 데리고 도달할 것 이다.<ol>
<li>각 잘의 최종 구성 구성 70 µ L. 45이이 볼륨의 µ L 세균성 매체로 추가 (24 µ L S 기초, 및 21 µ L SK에서에서 0.03 OD600 박테리아 CaCl2 와 MgSO4보충). 다른 25 µ L 22 벌레와 함께 추가 됩니다.</li>
		<li>정렬 사용 하는 경우 여기 ( 재료의 표참조)는 사용할 수 없습니다, 웜 웜 1 µ S 기저 에/L pipetted 25 µ L/잘 사용 하 여 멀티 채널 피 펫의 최종 농도에 희석 수 있습니다. 그러나, 결과 증가 다양성을 전시할 지도 모른다. 또는, 양조위와 동료19에 설명 된 대로 연동 액체 디스펜서를 사용 하 여 가능 하다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>벌레 384-잘 접시에 정렬 되었습니다, 후 가스 투과성 필름으로 접시를 봉인 하 고 24-48 h 25 ° C에서 번호판을 품 어.</li>
	<li>원하는 시간에 사용 하 여 microplate 세탁기 S 기저와 384-잘 접시 세척 5 회 총.<ol>
<li>두 번째 세척 후 발음 미디어의 대부분, 격판덮개 우물의 아래에서 어떤 파편 든 지를 풀고 30 초 이상 microplate vortexer를 사용 하 여 흔들 ~ 20 µ L. 적극적으로 떠나).</li>
	</ol>
</li>
	<li>최종 세척, 20 µ L. 추가 50 µ L 0.98 µ M 핵 산의 아래 aspirate 상쾌한 얼룩 ( 재료의 표참조) 후 / 384-잘 접시 0.7 µ M의 최종 농도 대 한의.</li>
	<li>12-16 h에 대 한 실 온에서 품 어. 이 염료는 죽은 벌레를 얼룩만 것 이다. 원하는 잠복기, 후 microplate 세탁기를 사용 하 여 어떤 과잉을 제거 하는 세척 접시 (최소 3 세척) 얼룩.</li>
	<li>데이터 수집을 위한 이미지 전송된 빛과 형광 (531 nm 여기 및 593 방출) 하는 분 광 광도 계 또는 자동화 된 현미경을 사용 합니다.<ol>
<li>낮은 배율 목표를 사용 하 여 이미지 캡처 전체 잘 수 있도록.</li>
		<li>또는, 흐름 vermimetry를 사용 합니다. 이 기술은 크기와 강하게 cytometry 비슷한 패션에 (즉, C. 선 충) 모든 생물의 형광 측정 웜 fluorimeter 대형 개체 흐름 cytometer를 사용 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>자동된 이미지 분석 소프트웨어 (예: CellProfiler, MatLab <a href="http://cellprofiler.org/">http://cellprofiler.org/</a>에 따라 무료 이미지 분석 스튜디오)을 사용 하 여 형광 및 총 웜 지역 편견된 패션에 잘 당 계산 하. 참고:이 숫자의 지 수 각 잘 분수 죽음을 나타냅니다. 하나 잘 했다면 7 스테인드 20 개 벌레 총, 0.35 또는 35%를 구성 하는 분수 죽음 다음.<ol>
<li>처음 사용 전에 수동 채 점 하 여 자동된 이미지 처리 파이프라인의 유효성을 검사 해야 합니다. 이것은 자동화 된 파이프라인에서 점수 시각 이미지를 검사 하 고 그들 각각의 죽은 벌레의 분수를 기록 하 여 얻은 결과 비교 하 여 이루어집니다. 유효성 검사 프로세스 보장 자동된 이미징 처리에 대 한 매개 변수가 정확 하 고 올바르게 데이터를 표현 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 여러 심사 C. 선 충 종자 또는 Knockdowns (RNAi 스크린 설치)에 대 한 적응
참고: 이것은 24-잘 접시 설치에 대 한 설명 하는 RNAi 스크린입니다.
<ol><li>24-잘 접시의 당 S 기저의 1 mL를 추가 (하십시오 단계 3.17.3 참조). 부드럽게 접시를 떨고 하 여 벌레를 선동 한 다음 웜 빈, 살 균 24 깊은 잘 격판덮개 전송. 웜 (~ 5 분)가 정착을 허용 합니다.</li>
	<li>약 1 mL을 떠나 상쾌한 발음 각 우물에 S 기초의 7 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>5.1-5.2 최소 2 번의 단계를 반복 합니다. 최종 세척 후 상쾌한 약 400 µ L를 떠나 발음.</li>
	<li>웜 분류 리샘플러 함수를 사용 하 여, 384-잘 접시 (384-잘 접시의 24-잘 접시 수익률 8-12 우물의 각 잘)의 각 음에 24-잘 플레이트 웜 정지에서 22 웜 정렬.<ol>
<li>정렬 전에 기아, 384-잘 접시 (OP50, 같은 음식, 전적으로 긴장 또는 병원 성 긴장)으로 피 펫 박테리아 방지를 위해. 참고: 병원 균은 2.3-2.5 또는 6.4 6.5 다음 단계 및 음식 소스 박테리아 그리고 희석 수 피 녹 농 균에 대해서 동일한 체계에 따라 추가 추가할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>후 웜 384-잘 접시에 정렬 되었습니다, 작은 분자 또는 다른 실험 관련 자료를 추가 합니다.</li>
</ol>6입니다. E. faecalis 에 대 한 적응
참고: 피 녹 농 균 분석 결과에서 차이만 설명 합니다.
<ol><li>BHI (두뇌 심 혼 주입) 한 천 배지 위에 냉동된 재고에서 박테리아를 질주 하 고 37 ° c.에 16 ~ 24 시간 배양 하 여 E. faecalis 의 신선한 소스 준비 참고: BSL-2 생물 안전 캐비닛 무 균을 보장 하기 위해 내부 E. faecalis 실험을 수행 합니다. 병원 성 감염 또는 오염 가능성을 최소화 하기 위해 적절 한 안전 조치를 사용 합니다.</li>
	<li>플레이트 4 ° C에서 최대 1 주일까지 저장할 수 있습니다. 이 기간 후 신선한 접시를 바꿉니다.</li>
	<li>웜, 정렬 하기 전에 밤 접종 3-5 mL의 단일 식민지와 살 균 BHI E. faecalis. 동요와 함께 37 ° C에서 12-16 h를 품 어.</li>
	<li>P. 녹 농 균 (3 x 박테리아에 S 기초, OD600≈0.09)에 관해서는 우물에 박테리아를 추가 합니다. 참고: E. faecalis, 최종 잘 구성입니다: E. faecalis (OD600≈0.03), BHI = 10 %v / v, 나머지 볼륨 S 기저의 구성. 기억 25 µ L S 기저의 벌레와 함께 전달 될 것 이다. 참고: E. faecalis 흐린된 이미지를 일으키는 형광 얼룩을 흡수 하는 두꺼운 biofilms를 생성 합니다. 광범위 한 세척이이 biofilm를 제거 하는 데 충분 하지 수 있습니다. 이 경우 웜 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 빈 접시를 전송할 수 있습니다. 촉진 하기 위해 전송, 트윈 20 0.1% (v/v) 트윈 20 S 기저에 최종 농도에 S 기저에 추가할 수 있습니다. 이 biofilm에서 벌레를 제거에 원조.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Falagas, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pandrug-resistant+Klebsiella+pneumoniae,+Pseudomonas+aeruginosa+and+Acinetobacter+baumannii+infections:+Characteristics+and+outcome+in+a+series+of+28+patients.">Pandrug-resistant Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii infections: Characteristics and outcome in a series of 28 patients.</a> International Journal of Antimicrobial Agents. 32 (5), 450-454 (2008).</li><li>Hsueh, P. 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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+high-content+imaging+and+chemical+genetics+to+probe+host+cellular+pathways+critical+for+Yersinia+pestis+infection.">Integrating high-content imaging and chemical genetics to probe host cellular pathways critical for Yersinia pestis infection.</a> PLoS One. 8 (1), e55167 (2013).</li><li>Arif, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+cell+infection+caused+by+Listeria+monocytogenes+invasion.">Quantification of cell infection caused by Listeria monocytogenes invasion.</a> Journal of Biotechnology. 154 (1), 76-83 (2011).</li><li>Jayamani, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+Francisella+tularensis-Caenorhabditis+elegans+pathosystem+for+the+evaluation+of+therapeutic+compounds.">Characterization of a Francisella tularensis-Caenorhabditis elegans pathosystem for the evaluation of therapeutic compounds.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 61 (9), (2017).</li><li>Moy, T. 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M., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitophagy+confers+resistance+to+siderophore-mediated+killing+by+Pseudomonas+aeruginosa.">Mitophagy confers resistance to siderophore-mediated killing by Pseudomonas aeruginosa.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (6), 1821-1826 (2015).</li><li>Kirienko, N. V., Cezairliyan, B. O., Ausubel, F. M., Powell, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+PA14+pathogenesis+in+Caenorhabditis+elegans.">Pseudomonas aeruginosa PA14 pathogenesis in Caenorhabditis elegans.</a> Methods in Molecular Biology. 1149, 653-669 (2014).</li><li>Kang, D., Kirienko, D. R., Webster, P., Fisher, A. L., Kirienko, N. 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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=bZIP+transcription+factor+zip-2+mediates+an+early+response+to+Pseudomonas+aeruginosa+infection+in+Caenorhabditis+elegans.">bZIP transcription factor zip-2 mediates an early response to Pseudomonas aeruginosa infection in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (5), 2153-2158 (2010).</li><li>Tjahjono, E., Kirienko, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+mitochondrial+surveillance+pathway+is+required+for+defense+against+Pseudomonas+aeruginosa.">A conserved mitochondrial surveillance pathway is required for defense against Pseudomonas aeruginosa.</a> PLoS Genetics. 13 (6), e1006876 (2017).</li><li>Moy, T. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+antimicrobials+using+a+live-animal+infection+model.">Identification of novel antimicrobials using a live-animal infection model.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (27), 10414-10419 (2006).</li><li>Henderson, S. T., Bonafe, M., Johnson, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=daf-16+protects+the+nematode+Caenorhabditis+elegans+during+food+deprivation.">daf-16 protects the nematode Caenorhabditis elegans during food deprivation.</a> The Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences and Medical Sciences. 61 (5), 444-460 (2006).</li><li>Beanan, M. J., Strome, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+germ-line+proliferation+mutation+in+C.+elegans.">Characterization of a germ-line proliferation mutation in C. elegans.</a> Development. 116 (3), 755-766 (1992).</li></ol>

저자 들은 공개 관심 없음 충돌 선언 합니다.

이 분석 결과 (또는 다른 병원 체 피 농 균 또는 E. faecalis대체 됩니다 유사한 분석 실험)는 다양 한 약물 발견을 포함 하 여 목적에 대 한 유용 합니다. 그것은 또한 독성 요인, 호스트 방어 통로의 설명을 식별 하 고 호스트 병원 체 상호 작용에 관련 된 규제 기계를 확인 하 여 근본적인 생물학 질문을 해결 하는 데 유용.
P. 농 균 액체 죽이 분석 결과 강력한, 실패의 기회를 최소화 하기 위해 주의 지불 한다 어디 몇 가지 포인트가 있다. 첫째, 앞에서 언급 했 듯이, 피 녹 농 균 예방 접종에 대 한 세균 소스 접시 박테리아 독성, 파운드에서 하룻밤 성장에도 불구 하 고 분실 하지 않도록 신선한, 유지 되어야 합니다. 둘째, 칼슘 및 마그네슘 P. 농 균 죽이 분석에 추가 다는 것을 확인 하는 키입니다. 그것 없이, 독성은 크게 손상 될 것입니다. 마지막으로, 그것은 (RNAi 기반 분석 실험)에 대 한 HT115에 reared 웜 웜 OP50에 reared 보다 크게 나중 죽을 것 이다 지적 가치 (N. Kirienko, 개인 커뮤니케이션). 이런 이유로, RNAi 기반 연구로 전환 하는 경우, 그것은 경험적으로 분석 결과 대 한 최고의 시간 포인트를 결정 하는 것이 중요.
P. 농 균 또는 E. faecalis분석 실험, 살해에 대 한 분석 결과에서 사용 될 준비가 될 때까지 L1 무대에서 벌레의 개발에 대 한 적절 한 식품을 결정적 이다. 기아 에서도 단기, DAF-2/DAF-16 인슐린/IGF 신호 네트워크27같은 호스트 방어 통로의 수 활성화로 알려져 있다. 우리의 데이터 DAF-16/FOXO는 이미 약간 액체20에서 경작 되 고 활성화 됩니다 더 활성화 강하게 바람직하지 않다, 때문에 DAF-16/FOXO 넓 병원 체 저항23을 촉진 것이 좋습니다.
마지막으로, 완전히 메 마른 벌레를 사용 하 여 한 판독으로 사망률에 의존 하는 분석 결과에 결정적 이다. 벌레 인 비옥한 달걀 누워에 어려움 하면 액체에 되 고. 그 결과, 배아의 일부는 결국 그것의 죽음을 일으키는 원인이 되는 부모 해치. 이러한 이유로, 우리는 일반적으로 유전 병 변, glp-4(bn2)28, 는 이러한 분석에 대 한 완전히 침투 균 형 등를 사용 합니다. 또한 방해할 수 세균성 성장 및 개발으로 배아 발달을 방지 하지만 여전히 달걀 누워, 5-fluorodeoxyuridine (FUdR) 등을 허용 하는 화학 물질의 사용을 피해 야 한다.
일반적으로, 우리는 발견 그것은 매우 도움이 계획 분석에 대 한 몇 가지 시간 포인트. 분석 결과 강력 하 고 타이밍은 일반적으로 일관 된, 확률론, 눈에 보이지 않는 변화 2-4 시간 이내 분석 결과에서 죽음의 타이밍을 이동할 수 있다. 그것은 종종 간단한 대답; 먼저 고려해 도움이 문제 해결 하는 것이 필요한 경우 즉, 신선한 미디어를 준비 하 고 가장 최근의 세균성 문화를 무시 하 고, 매우 드물게이 측정을 복원 하지 시험 기능에만 다시 냉동된 주식, 등 에서 세균성 긴장 행진.
방법의 상대적 단순, 다양 한 수정 쉽게 수행할 수 있습니다. 높은 처리량 RNAi 스크린에 대 한 균일 한 glp-4(bn2) 배경에서 벌레를 변경, 같은 그 우리는 여기에, 설명 유용 다양 한 xenobiotics 및 독성 화학 물질에 대 한 호스트 응답 통로의 식별 합니다. 예를 들어 RNAi 접시 (독 소예를 들어, Cry5B, phenanthroline, 등)의 각 음에 동일한 화학 제품 또는 독 소를 추가 하 여 경로 변경 하는 이러한 독 소에 감도 확인할 수 있습니다 쉽게. 이러한 유형의 화면 C. 선 충감염 병원 체의 갑옷에 대 한 방어 네트워크를 식별 하기 위해 사용할 수 있습니다.

식별 및 효과적인, 넓 스펙트럼 항생제의 개발 지금 거의 한 세기 전, 공중 보건에 분수령에 지도 되었다 대폭적인 신념 그 전염 성 질병 과거의 채찍 질 될 것 이라고. 짧은 몇 십년 내이 낙관론 병원 체 병원 체 개발이 한번 기적 치료 제한 저항 메커니즘 후로 지 러 지기 시작 했다. 몇 시간 동안, 약 발견 노력와 병원 체 사이 군비 경쟁 균형 잡힌 듯. 그러나, 항균의 오용은 최근 불러 팬-약물 내성 변종의 Klebsiella 균, Acinetobacter baumanii, Serratia marcescens및 피 농 균1의 출현 2,,34.
P. 녹 농 균 은 편의적, 그램 네거티브, 멀티 호스트 병원 체 사람 immunocompromised, 또는 낭 성 섬유 증가지고 심한 화상 환자에 게 심각한 위협입니다. 그것은 또한 점점 더 심한 병원내 감염, 특히 항균 성 저항의 지속적인 인수 때문에 원인이 되는 대리인으로 식별 됩니다. 이 위협을 해결 하기 위해 시작, 우리는 문서화 C. 선 충-P. 녹 농 균 감염 시스템5를 사용 했습니다. 연구소는 호스트6죽 일 하는 병원 체의 기능을 제한 하는 새로운 화합물을 식별 하는 액체-기반, 높은 처리량, 높은 콘텐츠 심사 플랫폼을 개발 하는 것이 시스템을 활용 했다. 글에,이 화합물 제7 과 독성 억제제8을 포함 하 여 적어도 3 개의 일반적인 범주에 속하는 것 같다. C. 선 충 에서 다른 높은 콘텐츠 약물 발견 분석 진 균 tuberculosum, 클 라 미디 아 속 trachomatis, Yersinia pestis, Listeria monocytogenes, Francisella tularensis, 황색 포도상구균, 칸디 다 albicans, 보고 되었습니다 및 Enterococcus faecalis, 다른 사람의 사이에서9,10,11,12,13,14,,1516. 분석 실험의이 유형은 몇 가지 잘 인식된 장점이, 호스트와 병원 체, 화학 스크린과 넘어 안타를 식별 하는 기능에 비해 생체 이용률의 증가 가능성에 독성이 있을 수 있습니다 거짓 긍정적인 조회 수 제한 등 단순히 안티-virulents, 면역 물질로 분자, 또는 그렇지 않으면 전 찬성 호스트 병원 체 상호 작용의 균형을 기울일 화합물 등 미생물 성장을 제한. 또한,이 화면에서 발견 된 화합물은 종종 포유류 호스트에 효과적입니다.
그것은 적어도 두 개의 다른 분석 실험17,18 액체에서 C. 선 충 에서 높은 처리량 화면 수행 수 있습니다 지적 가치가 있다. 그러나,이 분석 실험은 원형 장 식민지 분석 결과, 액체에서 느린-살인로 알려진 있도록 수정 처리량을 증가 하 고 더 쉽게 상영 하는 화합물을 수 있도록. 주의 특성화는 결정적으로 세균 독성의 기계 장치는 이러한 분석 및 우리의 액체 기반의 화면7사이 설명 했다. 이후 두 가지 유형의 독성 포유류 시스템에서 관찰 된다, 그것은 어떤 독성 결정은 분석 결과 선택 이전 실험의 관심사에 대 한 가장 관련성이 높은 고려 하는 것이 중요.
여기 우리가 액체 기반으로 최적화 된 버전을 보여 농 균 선 충-P. C. 분석 결과. 우리는 또한 그람 양성 세균성 병원 체에 맞게 우리의 액체 기반의 분석 방법의 적응을 보고 Enterococcus faecalis. P. 녹 농 균, 같은 E. faecalis 점점 항균 성 저항 경로1의 성장 군비와 심각한 병원내 위협으로 식별 됩니다. E. faecalis 의 높은 처리량 검열에 대 한 이전 방법14존재, preinfection는 절차 복잡 하 고 COPAS FlowSort 같은 장비를 오염 하는 가능성을 증가 병원 체와 함께 필요 합니다. 우리의 프로토콜 안전 프로필 개선 사전 감염에 대 한 필요가 없다. 마지막으로, 우리는 이러한 분석 중 결합 될 수 있다 먹이의 설립에 있는 역할을 할 호스트 요소에 대 한 검색 사용자 수 있도록 RNAi 또는 감염에 저항 하는 수단을 보고 합니다.

<table><tbody><tr><td>COPAS FP BioSorter</td><td>Union Biometrica</td><td></td><td>Large object flow cytometer/worm sorter</td></tr><tr><td>Cytation 5</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EL406 Washer Dispenser</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multitron Pro</td><td>Infors HT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>24 Deep-Well RB Block</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>CS15124</td><td></td></tr><tr><td>384-Well plate</td><td>Greiner Bio-One</td><td>MPG-781091</td><td></td></tr><tr><td>Nematode Growth Media (NGM)</td><td></td><td></td><td>Amount per liter: 18 grams agar, 3 grams NaCl, 2.5 grams Peptone, 1 mL CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; (1 M), 1 mL MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (1 M), 25 mL Phospate buffer, and 973 mL of milli-Q water</td></tr><tr><td>Slow Killing (SK) plates</td><td></td><td></td><td>Amount per liter: 18 grams agar, 3 grams NaCl, 3.5 grams Peptone, 1 mL CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; (1 M), 1 mL MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (1 M), 25 mL Phospate buffer, and 973 mL of milli-Q water</td></tr><tr><td>Slow Killing (SK) media</td><td></td><td></td><td>Amount per liter:&amp;nbsp; 3 grams NaCl, 3.5 grams Peptone, 1 mL CaCl&lt;sub&gt;2 &lt;/sub&gt;(1 M), 1 mL MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (1 M), 25 mL Phosphate buffer, and 973 mL of milli-Q water</td></tr><tr><td>Lysogeny Broth (LB)</td><td>USBiological Life Sciences</td><td>L1520</td><td></td></tr><tr><td>Brian Heart Infusion broth (BHI)</td><td>Research Products International Corp</td><td>50-488-526</td><td></td></tr><tr><td>Worm Bleach Solution</td><td></td><td></td><td>Amount per 100 mL: 10 mL of 5 M NaOH solution, 20 mL of 5% Sodium Hypochlorite Solution, and 70 mL of sterile water</td></tr><tr><td>S Basal</td><td></td><td></td><td>Amount per liter: 5.85 grams NaCl, 6 grams KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 1 gram K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, and 1 Liter of milli-Q water</td></tr><tr><td>Agar</td><td>USBiological Life Sciences</td><td>A0930</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>USBiological Life Sciences</td><td>S5000</td><td></td></tr><tr><td>Peptone</td><td>USBiological Life Sciences</td><td>P3300</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>USBiological Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>M63-500</td><td></td></tr><tr><td>Phospate buffer</td><td></td><td></td><td>amount per liter: 132 mL of K2HPO4 (1M) and 868 mL of KH2PO4 (1M)</td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Acros Organics</td><td>7778-77-0</td><td></td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>USBiological Life Sciences</td><td>P5100</td><td></td></tr><tr><td>5% Sodium Hypochlorite Solution</td><td>BICCA</td><td>7495.5-32</td><td></td></tr><tr><td>NaOH solution</td><td>Fisher Scientific</td><td>SS255-1</td><td></td></tr><tr><td>Breathe-easy</td><td>Diversified Biotech</td><td>BEM-1</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Orange Nucleic Acid Stain</td><td>Fisher Scientific</td><td>S11368</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Bacterial Strains&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;P. aeruginosa &lt;/em&gt;(PA14)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. faecalis&lt;/em&gt;(OG1RF)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli &lt;/em&gt;superfood (OP50)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli &lt;/em&gt;RNAi expressing bacteria (HT115)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Worm Strains &lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;glp-4&lt;/em&gt;(&lt;em&gt;bn2&lt;/em&gt;) (Beanan and Strome, 1992, PMID: 1289064)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PINK-1::GFP reporter (Kang et al., 2018, PMID: 29532717)</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a high-throughput, high-content, liquid-based c. elegans pathosystem

식별 하는 새로운 약물의 수에 의해 전통, 생체 외에서 스크린 쇠퇴 하고있다, 여러 약물 저항에 대처 하기 위해 새로운 무기에 대 한 검색에이 접근의 성공을 감소. 이 연구원은 새로운 약물을 찾는 데만 필요 하지 않습니다 하지만 또한 그들을 찾는 새로운 방법을 개발 해야 결론을 주도하 고 있다. 가장 유망한 후보자 사이 메서드는 전체 유기 체, vivo에서 분석 실험을 사용 하 여 높은 처리량, phenotypic 판독 Danio rerio 꼬마 선 충 에서 그 범위를 호스팅합니다. 이러한 호스트는 호스트 또는 biounavailable 독성 화합물을 일반적으로 비용이 많이 드는 따라 하기 전에 초기 화면에서 삭제 됩니다 거짓 긍정적인 안타에서 극적인 절감 등 여러 가지 강력한 이점이 있다.
여기에 우리가 어떻게 우리의 분석 결과 문서화 C. 선 충에서 호스트 변화를 심문 하는 데 사용 되었습니다 표시-녹 농 균 죽이 액체 pathosystem. 우리는 또한 잘 밖으로 일이 기술의 몇 가지 확장을 보여 줍니다. 예, 우리이 호스트 병원 체 상호 작용에서 쿼리 호스트 요인 플레이트 형식 높은 처리량 유전 스크린 24 또는 96 잘 RNAi를 사용 하 여 수행할 수 있습니다. 이 분석 결과 사용 하 여, 불과 몇 개월만에, 극적으로 힘 드는 생물 정화 방법에 대 한 필요 없이 잠재적으로 약물 표적을 식별 하는 작업을 단순화 수 있는 전체 게놈 스크린을 완료할 수 있습니다.
우리 또한 그람 양성 박테리아 Enterococcus faecalis 그람 음성 병원 체 피 녹 농 균에 대 한 대체 하는 우리의 방법의 변형 여기 보고 합니다. 많은 경우 처럼 피 녹 농 균에 대 한, E. faecalis 에 의해 죽이 시간 종속적입니다. 이전 선 충 C.달리-E. faecalis 분석 실험, 우리의 분석 결과 E. faecalis 팬 들은 preinfection의 정보 필요로 하지 않습니다, 그것의 안전 단면도 개선 및 액체 처리 장비를 오염 하는의 가능성을 감소. 분석 결과 매우 강력 하 고, ~ 95% 사망률 96 h 포스트 감염을 보여주는.

분석 결과 성능에 대 한 중요 한 매개 변수
이 분석 결과 기본 생물학에 대 한 적절 한 이해는 문제 해결 및 분석 결과 최적화 필요 합니다. 이 위해, 우리 몇 가지 주요 논문 elucidating P. 녹 농 균의 pathogenesis의 메커니즘에 먼저 참조-죽이 액체7,20중재. 위에서 설명 하는 단계 (분석 결과 프로토콜의 회로도 그림 1 참조) 뒤에 C. 선 충 의 시간에 따라 살해 병원 체 (그림 2A)의 존재만 관찰 됩니다. 반면, 주요 영양 보조 제 (예를 들어, 는 펩은 미디어, 탈락 하 고만 S 기저는 추가)의 부재, 아니 살인을 조금 관찰 됩니다 (그림 2B). 흥미롭게도, P. 녹 농 균 (37 ° C, 25 ° C에서 다음 24 시간에서 24 시간)에 대 한 기존의 느린 살인 분석 실험에 대 한 중요 한 이며 원래의 2 단계 배양이 분석이 결과 ( 에에서 불가결 이다 액체 죽이고21, 구현 그림 2C). 추가할 수는 있지만 크게 이렇게 하룻밤 파운드 문화에서 바로 피 녹 농 균 치 활동을 변경 하 고 권장 하지 않습니다.
또한 분석 결과 생물학을 이해 적절 하 고 바람직한 경우는 분석 결과의 단순화를 허용 합니다. 예를 들어 호스트 죽이이 분석 결과의 가장 중요 한 드라이버는 siderophore pyoverdine 그리고 pyoverdine에 의해 발생 하는 호스트 독성은 철7바인딩할 능력 조건. 따라서, 분석 결과 C. 선 충의 transcriptional 응답으로 라이브 박테리아, pyoverdine 풍부한 여과 액, 정제 pyoverdine, 또는 심지어 일부 합성 철 킬레이트 화 화학 물질 (예, 1,10-phenanthroline)를 대체 하 여 단순화 수 있습니다. 는 이러한 치료에 매우 비슷한 (그림 3)22.
여러 다른 줄 증거의 실험적인 체제의 견고성을 말한다. 첫째, 설치 초기 세균 농도의 광범위를 허용. OD600 낮은 농도 타이밍 (그림 4A) 이동은 비록 0.0025 (권장 보다 약 10 낮은) 아직도 전시 시간 및 농도 따른 살인, =. 둘째, 분석 결과의 재현성 등은 그 몇 가지 4 우물으로 통계적으로 중요 한 데이터 (그림 4B)를 얻기 위해 자주 충분 하다.
권장 하지 않습니다 몇 가지 변경 있습니다. 예를 들어 초기 박테리아 inocula를 사용 하 여 프로토콜;에 나열 된 것 보다 훨씬 더 높은 농도로 하 고 너무 두꺼운, biofilm 같은 재료를 효과적으로 씻어 어렵거나 득점 치 사 율을 복잡 하 게는 발생 합니다. 또한, 고 농도 세균 inocula는 또한 산소에 대 한 경쟁 수 있으며 일반적인 호스트 살인7트리거.
또 다른 중요 사항 분석 결과 중지 하 고 죽은 벌레를 이미징 사이의 시간의 기간을 제한 하는 것입니다. Note이 기간, 얼룩을 포함 해야 합니다 그래서 그것이 효율적으로 중요 한. 죽음 후에, 웜 내 생물 소재 돌출 또는 박테리아에 의해 소모 하기 시작 합니다. 24-32 h의 문제, 내 표 피만 남아 있다. 표 피는 매우 저조한 얼룩 이며 매우 빛, 쉽게 세척 하는 동안 손실. 그것은 긴장 또는 살인의 매우 다른 활동으로 스트레인/RNAi 조건 (즉, 일부 웜 여전히 있을 수 있습니다 살아있는 동안 다른 이미 자신의 콘텐츠 잃은 이미지 불가능)이이 현상으로 복잡 될 수 있습니다 참고 해야 합니다. 그림 4A 접시의 왼쪽에 벌레로이 현상을 보여준다 매우 낮은 초기 세균 농도와 주사, 지금도 크게 벌레는 접시의 오른쪽에는 훨씬 더 높은 농도에 노출 됐다 동안 살아 박테리아, 멀리 세척 되어 있다.
분석 결과 성공의 결정 하는 매우 중요 한 수집 하 고 데이터를 분석 하는 데 사용 하는 방법입니다. 우리 실험실에서 우리가 사용한 적어도 세 가지 방법 이러한 분석에서 데이터를 수집: 분 광 광도 법, 자동화 된 현미경 검사 법, 그리고 흐름 vermimetry (즉, 흐름 cytometry 기술 C. 선 충에 적응, 말 그대로, 측정 흐르는 솔루션 웜). 이러한 방법의 첫 번째 질문에 벌레의 기자 또는 염료의 형광을 읽을 수는 spectophotometer을 사용 합니다. 이 메서드와 장점이 상당히 유비 쿼터 스 부분의 장비 (는 표준 분 광 광도 계 microplate 리더)를 사용 하 여 데이터를 얻기 위해 가장 빠른 방법입니다. 그러나, 그것은 자동화 된 현미경 검사 법에서 정보 콘텐츠 및 흐름 vermimetry의 통계적 인 힘을 결여 된다.
자동화 된 현미경 검사 법에는 또 다른 옵션입니다. 미 판 이미징 시스템의 수는 현재 시장, 더 비싼 대형, (예를 들어, 바이오-테크 Cytation5) 단일 탐정에 게 저렴 한 가격에 이르기까지 고 코어에서 더 일반적으로 발견 되는 높은-품질 기계 시설 (예를 들어, 분자 장치 ImageXpress 현미경). 실제로, 이러한 솔루션 대부분의 점수 대부분 화면 및 분석에 대 한 의무가 있습니다. 가장 자동화 된 이미징 플랫폼 또한 다운스트림 소프트웨어 이미지 처리 (예를 들어, MetaMorph, ImageJ, Gene5, 또는 셀 프로파일러) 수익률 정보 더를 위해 결합 될 수 있습니다. 처리의 유틸리티의 예는 그림 5 와 그림 6에 표시 됩니다. 신호 대 잡음 비율 ( 그림 5) 높은 때, 분석은 간단 하 고 사소한는 긍정적이 고 부정적인 조건 사이 차별. 이러한 경우에도 약한 안타는 쉽게 식별할 수 있습니다. 그러나 많은 분석 실험,, 약한 신호 대 잡음 비율을 있다. 예를 들어 1,10 phenathroline와 (와 그들의 pharynges에 제정 mCherry 식) 핑크 1::GFP22 웜 치료 핑크 1::GFP의 수준을 증가 한다. 데이터 분석을 위해 제정 mCherry 신호 (그림 6)을 유도할 수 있는 GFP 기자 정규화 됩니다. 이 경우 기자는 약한 식 또는 벌레의 대부분에서 활성화 되지 않습니다. 따라서, 구현 하는 추가 이미지 처리 도구, 셀 프로파일러 같은 백그라운드를 줄일 수 있는 신호를 증폭은 유리한 수 있습니다.
마지막으로, COPAS FlowPilot 사용할 수 있는 경우에, 그것은 흐름 vermimetry 통해 데이터를 얻기 위해 사용할 수 있습니다. 훨씬 cytometry의 더 친숙 한 개념 처럼 한 번에 적어도 2 개 또는 3 개의 채널에 C. 선 충 의 형광을 측정 하기 위해이 악기를 사용할 수 있습니다. 이 방법은 매우 높은 통계적 의미와 데이터 수집 의무가 다만 처리량은 아주 많이 자동화 된 현미경 검사 법에 비해. 흐름 vermimetry의 가장 중요 한 이점은 복제 보다는 여러 우물에 그들을 분할 하 고 우물의 평균 분석에 대 한 단일 그룹으로 전체 벌레 인구를 분석 하는 능력에서 이다. 극적으로이 패션에 큰 그룹을 분석 통계 능력 향상과 작은 효과의 탐지를 허용 한다.
액체 죽이 분석 결과의 수정
분석 결과의 최근 개발 시 금 기자의 형광 (그림 6), 중간-높은 처리량 RNAi 기법 (그림 3), 및 원래도 대체를 사용 하 여 정품 인증을 포함 하 여 그것의 유용성을 확장 병원 체입니다.
P. 녹 농 균 (또는 다른 병원 체)에 대 한 호스트 방어 통로 대 한 테스트 설정 RNAi를 사용 하는 가장 확실 한 이유가입니다. RNAi 최저 생존 분석 결과에 대 한 관련 유전자의의 예는 그림 3에 나와 있습니다. 이전 관측20,23,,2425와 일치, daf-2(RNAi) 향상 된 daf-16 (동안에 피 녹 농 균, 노출 동안 C. 선 충 생존 RNAi), zip-2(RNAi) 및 cebp-1(RNAi) 는 그것을 단축. 앞에서 언급 했 듯이, RNAi는 가장 간단 하 게 각 잘 포함 되어 있는 다른 RNAi 클론 multiwell 격판덮개에 벌레를 성장 하는 분석 결과에 포함 됩니다. 한 천 및 작은 볼륨 관련된의 높은 점도 인해 전문된 장비 없이 96 잘 접시의 유니폼, 거품 무료 충전을 달성 하기 어렵습니다. 또한, 세균성 긴장은 RNAi를 들고 건조도 수 문제, 외부 우물 agar 크래킹에 대 한 비 균일성 및 중요 한 잠재력을 이끌어 내 면 웰 스 보다 더 빨리 건조. 위에서 설명 했 듯이,이 권장 벌레를 뚫으, 심사 및 위험 액체 처리 기계 막힘에 사용할 수 있는 동물의 수를 감소 합니다. 이러한 이유 중 두, 24-잘 접시는 96 잘 접시 보다 사용 하기 쉽습니다. 이 분석 결과 처리량 줄여, 그것은 신뢰성을 향상 하 고, 특히 초기 화면에 대 한 제안.
마지막으로, 분석 결과 분석 결과 E. faecalis P. 농 균 바꿉니다 수정 되었습니다. (원칙적으로, 다른 세균 종으로 대체 한다 제공 하지 과도 한 어려움, 적절 한 경작 및 노출 조건을 식별 되는.) 고려해 야 할 가장 중요 한 요소가 이다 병원 체, 성장 및 개발 및 독성의 유도 미디어 요구 사항. 예를 들어 그램 긍정적인, 기회 주의 병원 체 E. faecalis (BHI) 같은 영양분이 풍부한 미디어 및 P. 농 균14,26에 비해 더 높은 온도에서 부 화 필요 합니다. 계정의 적응에 이러한 요소를 복용 하 여는 E. faecalis 를 사용 하 여 분석 결과 간단 했다. P. 녹 농 균에 대 한 설명 했 듯이, 우리는 시간에 따라 살인 (그림 7) 보았다. 흥미롭게도, 죽음의 타이밍 한 천 격판덮개26, 병 인에 관여 하는 메커니즘 다릅니다 하는 것을 제안할 수 있습니다이 단계의 부재에도 불구 하 고 감염 이전의 사용 이전에 게시 분석 비슷 했다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58068/58068fig1.jpg"> 그림 1: 액체 기반의 C. 선 충 - P. 녹 농 균 감염 분석 결과 대 한 계획. 선 충의 전파 및 준비 단계 왼쪽에, 오른쪽에는 세균성 준비. 둘 다를 포함 하는 단계는 중심에 둔다. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/58068/58068fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58068/58068fig2.jpg"> 그림 2: 살인 피 녹 농 균 에 의해 C. 선 충 의 특정 하 고 적절 한 세균성 영양 필요 합니다. (A) 선 충 C. 죽음 대장균 과 피 녹 농 균의 존재. (B) (오른쪽)와 선 충 C. 죽음 P. 녹 농 균 의 존재와 (왼쪽된) 느린 죽 미디어 믹스에 추가 하지 않고 (즉, S만 기초). S 기저 최소한의 미디어 및 세균성 성장에 필요한 양분을 포함 하지 않습니다 이며 pyoverdine의 생산을 방해. (C) 선 충 C. 죽음 다르게 준비 P. 녹 농 균의 존재. p < 학생의 t에 따라 0.01-테스트. 오차 막대 S.E.M. 10 웰 스 생물 복제 조건 당 당 사용 된 나타냅니다. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/58068/58068fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58068/58068fig3.jpg"> 그림 3: 피 녹 농 균 에 대 한 선 충 C. 저항 호스트 면역 경로에 따라 달라 집니다. 패널 선택한 RNAi knockdowns P. 녹 농 균 (A) 또는 1,10-phenanthroline (액체에 피 녹 농 균 에 노출 모방 화학 chelator) 대우 되었다 (B). p < 0.01, #p < 학생의 t에 따라 0.05-테스트. 오차 막대 S.E.M. 10 웰 스 생물 복제 조건 당 당 사용 된 나타냅니다. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/58068/58068fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58068/58068fig4.jpg"> 그림 4: 피 녹 농 균 에 의해 선 충 C. 살인 강력 하 고 세균성 농도에 따라 달라 집니다. (A-B) 대표 이미지 (A)와 72 h. p에 대 한 피 녹 농 균 의 다양 한 농도에 노출 된 후 선 충 C. 죽음의 정량화 (B)-값 계산 학생의 에 따라 t -테스트. (A)에서 눈금 막대는 1. 16 우물 생물 복제 조건 당 당 사용 되었다. BF: 밝은 분야, 플로리다: 형광. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/58068/58068fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58068/58068fig5.jpg"> 그림 5: 강한 신호 분석 결과의 데이터 수집 및 이미지 처리. 라이브 (부정적인 제어) 및 죽은 (긍정적인 제어)의 (A) 대표 이미지 C. 선 충. (B) 데이터 수집 방법, 처리 모드, 그리고 분석 하는 우물의 수에 따라 부정적이 고 긍정적인 컨트롤의 통계 분석. (C) 형광 96 잘 접시 (2 양수와 두 부정적인 제어 웰 스)의 4 개의 개별 우물에서 벌레에 대 한 분석 했다. 각 잘 ~ 100 웜 포함. 그래프에 각 도트는 시간-의-비행기 (와 상관 관계가 있지만, 살아있는 벌레의 감기 때문에 크기를 나타내는 불완전) 및 Sytox 오렌지와 스테인드는 벌레에 대 한 측정된 형광 단일 벌레를 나타냅니다. 긍정적인 통제 웜 미리 열 노출에 의해 사망 했다. 긴장과 죽은 벌레의 모양에 변화 ((A)에서 볼 수 있듯이 죽은 벌레 더 로드 같은 표시 그리고 몇 신체 굴절) 그들의 생활에 비해, 죽은 벌레는 더 이상 TOF. p-값은 학생의 t에 따라 계산 했다-테스트. (A)에서 눈금 막대는 1 m m. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/58068/58068fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58068/58068fig6.jpg"> 그림 6: 적당 한 신호 분석 결과의 데이터 수집 및 이미지 처리. (A)는 유도할 수 있는 핑크 1::GFP 기자 mCherry 제정 마커 (extrachromosomal 배열에서 유전자의 표현을 표준화)을 들고 C. 선 충 의 대표 이미지. C. 선 충 DMSO (부정적인 컨트롤) 또는 1,10-phenanthroline (긍정적인 통제)에 노출. (B) 데이터 수집 방법, 처리 모드, 그리고 분석 하는 우물의 수에 따라 부정적이 고 긍정적인 컨트롤의 통계 분석. (C) 4 개별 웰 스는 96 잘 접시 (2 개의 긍정적인 두 개의 부정적인 제어 우물)의 흐름 vermimetry를 사용 하 여 분석 되었다. p-값은 학생의 t에 따라 계산 했다-테스트. (A)에서 눈금 막대는 1 m m. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/58068/58068fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58068/58068fig7.jpg"> 그림 7: 선 충 C. E. faecalis 여 죽이 강력 하 고 시간 따라 다릅니다. (A-B) 대표 이미지 (A)와 선 충 C. E. faecalis에 노출 된 후 죽음의 정량화 (B). p < 학생의 t에 따라 0.01-테스트. 10 웰 스 생물 복제 조건 당 당 사용 되었다. 오차 막대 표시에 S.E.M. 눈금 막대 (A) 는 1 m m. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/58068/58068fig7large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

여기 우리는 적응, 전체 호스트, 호스트 병원 체 상호 작용을 공부 하 고 신약 사용을 활용할 수 있는 도구를 높은 콘텐츠 심사 하는 프로토콜을 설명 합니다.

높은 처리량, 높은 콘텐츠, 액체 기반의 C. 선 충 Pathosystem

The number of new drugs identified by traditional, in vitro screens has waned, reducing the success of this approach in the search for new weapons to ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

14.4K 조회수.  Rice University. 여기 우리는 적응, 전체 호스트, 호스트 병원 체 상호 작용을 공부 하 고 신약 사용을 활용할 수 있는 도구를 높은 콘텐츠 심사 하는 프로토콜을 설명 합니다.

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A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages for identifying biologically active chemical structures that can modify complex phenotypes such as lifespan. Described here is a simple protocol for producing hundreds of 96-well culture plates with fairly consistent numbers of C. elegans in each well. Next, we specified how to use these cultures to screen thousands of chemicals for effects on the lifespan of the nematode C. elegans. This protocol makes use of temperature sensitive sterile strains, agar plate conditions, and simple animal handling to facilitate the rapid and high throughput production of synchronized animal cultures for screening.

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Here we describe a simple protocol for rapidly producing hundreds of nematode growth media agar, 96-well culture plates with consistent numbers of Caenorhhabditis elegans per well. These cultures are useful for the phenotypic screening of whole organisms. We focus here on using these cultures to screen chemicals for pro-longevity effects.

꼬마 선 충 에서 높은 처리량 화학 심사 하는 간단한 방법

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

연구

생화학

Automated Analysis of a Nematode Population-based Chemosensory Preference Assay

The nematode, Caenorhabditis elegans' compact nervous system of only 302 neurons underlies a diverse repertoire of behaviors. To facilitate the dissection of the neural circuits underlying these behaviors, the development of robust and reproducible behavioral assays is necessary. Previous C. elegans behavioral studies have used variations of a "drop test", a "chemotaxis assay", and a "retention assay" to investigate the response of C. elegans to soluble compounds. The method described in this article seeks to combine the complementary strengths of the three aforementioned assays. Briefly, a small circle in the middle of each assay plate is divided into four quadrants with the control and experimental solutions alternately placed. After the addition of the worms, the assay plates are loaded into a behavior chamber where microscope cameras record the worms' encounters with the treated regions. Automated video analysis is then performed and a preference index (PI) value for each video is generated. The video acquisition and automated analysis features of this method minimizes the experimenter's involvement and any associated errors. Furthermore, minute amounts of the experimental compound are used per assay and the behavior chamber's multi-camera setup increases experimental throughput. This method is particularly useful for conducting behavioral screens of genetic mutants and novel chemical compounds. However, this method is not appropriate for studying stimulus gradient navigation due to the close proximity of the control and experimental solution regions. It should also not be used when only a small population of worms is available. While suitable for assaying responses only to soluble compounds in its current form, this method can be easily modified to accommodate multimodal sensory interaction and optogenetic studies. This method can also be adapted to assay the chemosensory responses of other nematode species.

We present a behavior recording setup and protocol that enables automated analysis of the nematode, Caenorhabditis elegans' preference for soluble compounds in a population-based assay. This article describes the construction of a behavior chamber, the behavioral assay protocol, and video analysis software usage.

선충 집단에 기반한 화학 감응도 선호 분석의 자동화 된 분석

The nematode, Caenorhabditis elegans' compact nervous system of only 302 neurons underlies a diverse repertoire of behaviors. To facilitate the dissection ...

행동분석학

A High-throughput Assay for the Prediction of Chemical Toxicity by Automated Phenotypic Profiling of Caenorhabditis elegans

Applying toxicity testing of chemicals in higher order organisms, such as mice or rats, is time-consuming and expensive, due to their long lifespan and maintenance issues. On the contrary, the nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) has advantages to make it an ideal choice for toxicity testing: a short lifespan, easy cultivation, and efficient reproduction. Here, we describe a protocol for the automatic phenotypic profiling of C. elegans in a 384-well plate. The nematode worms are cultured in a 384-well plate with liquid medium and chemical treatment, and videos are taken of each well to quantify the chemical influence on 33 worm features. Experimental results demonstrate that the quantified phenotype features can classify and predict the acute toxicity for different chemical compounds and establish a priority list for further traditional chemical toxicity assessment tests in a rodent model.

A High-throughput Assay for the Prediction of Chemical Toxicity by Automated Phenotypic Profiling of Caenorhabditis elegans

A quantitative method has been developed to identify and predict the acute toxicity of chemicals by automatically analyzing the phenotypic profiling of Caenorhabditis elegans. This protocol describes how to treat worms with chemicals in a 384-well plate, capture videos, and quantify toxicological related phenotypes.

꼬마 선 충 의 프로 파일링 Phenotypic 자동화 하 여 화학 독성의 예측에 대 한 높은 처리량 분석 결과

Applying toxicity testing of chemicals in higher order organisms, such as mice or rats, is time-consuming and expensive, due to their long lifespan and ...

환경과학

Culture and Assay of Large-Scale Mixed-Stage Caenorhabditis elegans Populations

Caenorhabditis elegans (C. elegans) has been and remains a valuable model organism to study developmental biology, aging, neurobiology, and genetics. The large body of work on C. elegans makes it an ideal candidate to integrate into large-population, whole-animal studies to dissect the complex biological components and their relationships with another organism. In order to use C. elegans in collaborative -omics research, a method is needed to generate large populations of animals where a single sample can be split and assayed across diverse platforms for comparative analyses.
Here, a method to culture and collect an abundant mixed-stage C. elegans population on a large-scale culture plate (LSCP) and subsequent phenotypic data is presented. This pipeline yields sufficient numbers of animals to collect phenotypic and population data, along with any data needed for -omics experiments (i.e., genomics, transcriptomics, proteomics, and metabolomics). In addition, the LSCP method requires minimal manipulation to the animals themselves, less user preparation time, provides tight environmental control, and ensures that handling of each sample is consistent throughout the study for overall reproducibility. Lastly, methods to document population size and population distribution of C. elegans life stages in a given LSCP are presented.

Culture and Assay of Large-Scale Mixed-Stage Caenorhabditis elegans Populations

To use Caenorhabditis elegans (C. elegans) in omics research, a method is needed to generate large populations of worms where a single sample can be measured across platforms for comparative analyses. Here, a method to culture C. elegans populations on large-scale culture plates (LSCPs) and to document population growth is presented.

대규모 혼합 단계 Caenorhabditis 예인단 인구의 문화와 분석

Caenorhabditis elegans (C. elegans) has been and remains a valuable model organism to study developmental biology, aging, neurobiology, and genetics. The ...

유전학

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of Alzheimer's disease (AD) and is found in Lewy body dementia, inclusion body myositis and cerebral amyloid angiopathy 1-4. Amylopathies progressively develop with time. For this reason simple organisms with short lifespans may help to elucidate molecular aspects of these conditions. Here, we describe experimental protocols to study A&beta;-mediated neurodegeneration using the worm Caenorhabditis elegans. Thus, we construct transgenic worms by injecting DNA encoding human A&beta;42 into the syncytial gonads of adult hermaphrodites. Transformant lines are stabilized by a mutagenesis-induced integration. Nematodes are age synchronized by collecting and seeding their eggs. The function of neurons expressing A&beta;42 is tested in opportune behavioral assays (chemotaxis assays). Primary neuronal cultures obtained from embryos are used to complement behavioral data and to test the neuroprotective effects of anti-apoptotic compounds.

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

We describe methods to study aspects of amylopathies in the worm C. elegans. We show how to construct worms expressing human A&beta;42 in neurons and how to test their function in behavioral assays. We further show how to obtain primary neuronal cultures that can be used for pharmacological testing.

<em&gt; Caenorhabditis의 엘레</emAmylopathy 연구에 대한&gt; 모델 시스템

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of ...

신경과학

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes. However, many compounds identified in screens using cell culture models are often found to be toxic or pharmacologically inactive in vivo1-2. Screening in whole animal models can help avoid these pitfalls and streamline the path to drug development.
C. elegans is a multicellular model organism well suited for HTS. It is small (&lt;1 mm) and can be economically cultured and dispensed in liquids. C. elegans is also one of the most experimentally tractable animal models permitting rapid and detailed identification of drug mode-of-action3.
We describe a protocol for culturing and dispensing fluorescent strains of C. elegans for high-throughput screening of chemical libraries or detection of environmental contaminants that alter the expression of a specific gene. Large numbers of developmentally synchronized worms are grown in liquid culture, harvested, washed, and suspended at a defined density. Worms are then added to black, flat-bottomed 384-well plates using a peristaltic liquid dispenser. Small molecules from a chemical library or test samples (e.g., water, food, or soil) can be added to wells with worms. In vivo, real-time fluorescence intensity is measured with a fluorescence microplate reader. This method can be adapted to any inducible gene in C. elegans for which a suitable reporter is available. Many inducible stress and developmental transcriptional pathways are well defined in C. elegans and GFP transgenic reporter strains already exist for many of them4. When combined with the appropriate transgenic reporters, our method can be used to screen for pathway modulators or to develop robust biosensor assays for environmental contaminants. 
We demonstrate our C. elegans culture and dispensing protocol with an HTS assay we developed to monitor the C. elegans cap &#x2018;n&#x2019; collar transcription factor SKN-1. SKN-1 and its mammalian homologue Nrf2 activate cytoprotective genes during oxidative and xenobiotic stress5-10. Nrf2 protects mammals from numerous age-related disorders such as cancer, neurodegeneration, and chronic inflammation and has become a major chemotherapeutic target11-13.Our assay is based on a GFP transgenic reporter for the SKN-1 target gene gst-414, which encodes a glutathione-s transferase6. The gst-4 reporter is also a biosensor for xenobiotic and oxidative chemicals that activate SKN-1 and can be used to detect low levels of contaminants such as acrylamide and methyl-mercury15-16.

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

A procedure for liquid-based culturing and dispensing of C. elegans strains expressing fluorescent reporter proteins is described that does not require expensive sorting equipment. This approach can be applied to numerous inducible C. elegans genes for drug discovery or biosensing of contaminants.

형광등과 높은 처리량 검사 및 Biosensing C. 엘레간스 레인스

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes.  However, many compounds identified in ...

생물학

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

RNA interference is a powerful method to understand gene function, especially when conducted at a whole-genome scale and in a quantitative context. In C. elegans, gene function can be knocked down simply and efficiently by feeding worms with bacteria expressing a dsRNA corresponding to a specific gene 1. While the creation of libraries of RNAi clones covering most of the C. elegans genome 2,3 opened the way for true functional genomic studies (see for example 4-7), most established methods are laborious. Moy and colleagues have developed semi-automated protocols that facilitate genome-wide screens 8. The approach relies on microscopic imaging and image analysis. 
	Here we describe an alternative protocol for a high-throughput genome-wide screen, based on robotic handling of bacterial RNAi clones, quantitative analysis using the COPAS Biosort (Union Biometrica (UBI)), and an integrated software: the MBioLIMS (Laboratory Information Management System from Modul-Bio) a technology that provides increased throughput for data management and sample tracking. The method allows screens to be conducted on solid medium plates. This is particularly important for some studies, such as those addressing host-pathogen interactions in C. elegans, since certain microbes do not efficiently infect worms in liquid culture.
	We show how the method can be used to quantify the importance of genes in anti-fungal innate immunity in C. elegans. In this case, the approach relies on the use of a transgenic strain carrying an epidermal infection-inducible fluorescent reporter gene, with GFP under the control of the promoter of the antimicrobial peptide gene nlp 29 and a red fluorescent reporter that is expressed constitutively in the epidermis. The latter provides an internal control for the functional integrity of the epidermis and nonspecific transgene silencing9. When control worms are infected by the fungus they fluoresce green. Knocking down by RNAi a gene required for nlp 29 expression results in diminished fluorescence after infection. Currently, this protocol allows more than 3,000 RNAi clones to be tested and analyzed per week, opening the possibility of screening the entire genome in less than 2 months.

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

We describe a protocol using C. elegans and RNAi feeding libraries that allows automated measurement of multiple parameters such as fluorescence, size and opacity of individual worms in a population. We give one example of a screen to identify genes involved in anti-fungal innate immunity in C. elegans.

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RNA interference is a powerful method to understand gene function, especially when conducted at a whole-genome scale and in a quantitative context. In C. ...

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

Caenorhabditis elegans is a well-established animal model in biomedical research, widely employed in functional genomics and ageing studies. To assess the health and fitness of the animals under study, one typically relies on motility readouts, such as the measurement of the number of body bends or the speed of movement. These measurements usually involve manual counting, making it challenging to obtain good statistical significance, as time and labor constraints often limit the number of animals in each experiment to 25 or less. Since high statistical power is necessary to obtain reproducible results and limit false positive and negative results when weak phenotypic effects are investigated, efforts have recently been made to develop automated protocols focused on increasing the sensitivity of motility detection and multi-parametric behavioral profiling. In order to extend the limit of detection to the level needed to capture the small phenotypic changes that are often crucial in genetic studies and drug discovery, we describe here a technological development that enables the study of up to 5,000 individual animals simultaneously, increasing the statistical power of the measurements by about 1,000-fold compared to manual assays and about 100-fold compared to other available automated methods.

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

We describe protocols for using the wide field-of-view nematode tracking platform (WF-NTP), which enables high-throughput phenotypic characterization of large populations of Caenorhabditis elegans. These protocols can be used to characterize subtle behavioral changes in mutant strains or in response to pharmacological treatment in a highly scalable fashion.

자동화 된 행동 분석의 큰 C. 선 충 인구 넓은 시야의 사용 하 여 추적 플랫폼

Caenorhabditis elegans is a well-established animal model in biomedical research, widely employed in functional genomics and ageing studies. To assess the ...

면역학 및 감염병학

C. elegans Chemotaxis Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates. Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis behavior.
 The premise behind testing the response of the worms to an odorant is to place them in an area and observe the movement evoked in response to an odorant. Even with the many available assays, optimizing worm starting location relative to both the control and test areas, while minimizing the interaction of worms with each other, while maintaining a significant sample size remains a work in progress 1-10. The method described here aims to address these issues by modifying the assay developed by Bargmann et al.1. A Petri dish is divided into four quadrants, two opposite quadrants marked "Test" and two are designated "Control". Anesthetic is placed in all test and control sites. The worms are placed in the center of the plate with a circle marked around the origin to ensure that non-motile worms will be ignored. Utilizing a four-quadrant system rather than one 2 or two 1 eliminates bias in the movement of the worms, as they are equidistant from test and control samples, regardless of which side of the origin they began. This circumvents the problem of worms being forced to travel through a cluster of other worms to respond to an odorant, which can delay worms or force them to take a more circuitous route, yielding an incorrect interpretation of their intended path. This method also shows practical advantages by having a larger sample size and allowing the researcher to run the assay unattended and score the worms once the allotted time has expired.

C. elegans Chemotaxis Assay

A method of quantitatively evaluating the chemotactic response of Caenorhabditis elegans is described. A chemotactic index (CI) was employed as a way to precisely evaluate the response of worms to certain targets, and serve as a platform of comparison between strains and compounds of interest.

C. elegans의 주 화성 분석

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

High-Throughput Screening of Microbial Isolates with Impact on Caenorhabditis elegans Health

With its small size, short lifespan, and easy genetics, Caenorhabditis elegans offers a convenient platform to study the impact of microbial isolates on host physiology. It also fluoresces in blue when dying, providing a convenient means of pinpointing death. This property has been exploited to develop high-throughput label-free C. elegans survival assays (LFASS). These involve time-lapse fluorescence recording of worm populations set in multiwell plates, from which population median time of death can be derived. The present study adopts the LFASS approach to screen multiple microbial isolates at once for the effects on C. elegans susceptibility to severe heat and oxidative stresses. Such microbial screening pipeline, which can notably be used to prescreen probiotics, using severe stress resistance as a proxy for host health is reported here. The protocol describes how to grow both C. elegans gut microbiota isolate collections and synchronous worm populations in multiwell arrays before combining them for the assays. The example provided covers the testing of 47 bacterial isolates and one control strain on two worm strains, in two stress assays in parallel. However, the approach pipeline is readily scalable and applicable to the screening of many other modalities. Thus, it provides a versatile setup to rapidly survey a multiparametric landscape of biological and biochemical conditions that impact C. elegans health.

High-Throughput Screening of Microbial Isolates with Impact on Caenorhabditis elegans Health

Gut microbes may positively or negatively impact the health of their host via specific or conserved mechanisms. Caenorhabditis elegans is a convenient platform to screen for such microbes. The present protocol describes high-throughput screening of 48 bacterial isolates for impact on nematode stress resistance, used as a proxy for worm health.

Caenorhabditis elegans 건강에 영향을 미치는 미생물 분리물의 고처리량 스크리닝

With its small size, short lifespan, and easy genetics, Caenorhabditis elegans offers a convenient platform to study the impact of microbial isolates on ...