この研究は、がんの予防およびテキサスの研究所 (CPRIT) 賞 RR150044、ウェルチ財団研究助成金 C-1930 年、国立機関の健康 K22 AI110552 NVK に授与、支えられました。資金提供者には、研究デザイン、データ収集と分析、意思決定を発行し、または原稿の準備の役割はなかった。

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著者は、明らかに利益相反があるないことを宣言します。

この試金 (または他の病原体が膿や腸球菌の代わりに使用と同様の試金)、様々 な創の目的に役立ちます。また、特定病原因子、ホストの防衛の経路の解明と宿主-病原体相互作用に関わる規制機械を決定するなどの基本的な生物学的問題に対処するため便利です。
膿液殺害アッセイは、堅牢な失敗の可能性を最小限に抑えるための細心の注意の支払われる、いくつかのポイントがあります。まず、前述のように、細菌は LB で一晩成長にもかかわらず、病原性を失うしないように膿予防接種のため細菌ソース プレートは、新鮮ななりません。第二に、カルシウムとマグネシウムが膿の試金を殺すに追加されていることを確認するキーであります。それがなければ、病原性が著しく低下します。最後に、それは HT115 (RNAi に基づく試金) の飼育ワームはワーム飼育 OP50 以降大幅死んでしまうことは注目に値する (N. キリエンコ、パーソナル通信)。このため、RNAi ベースの研究に切り替える場合は、経験的に試金のための最高の時間ポイントを判断することが重要です。
膿または腸球菌でアッセイを殺害、アッセイに使用する準備ができるまで、L1 ステージからワームの開発に十分な食糧があることを確認することが重要です。でも短期的には、飢餓は、シグナリング ネットワーク27DAF 2/DAF 16 インスリン/IGF などのホスト防御経路の数をアクティブにする知られています。我々 のデータでは、DAF-16/FOXO を液体20、培養されてアクティブに既に若干、DAF-16/FOXO 広域病原体抵抗23を促進するため、更なる活性化が強く望まを示唆しています。
最後に、それは読み出しとして死亡率に依存する任意のアッセイで完全に滅菌ワームを使用する重要です。ワームは、肥沃な場合は、産卵の難しさを引き起こす液体中します。その結果、胚の一部は最終的に、死の原因、親の中で孵化します。このため、我々 は一般的にglp-4(bn2)28,これらの試金のための完全に浸透無菌の表現型を示すなどの遺伝的病変を使用します。彼らはまた細菌の成長と開発を妨げる可能性がある、萌芽期の開発を防ぐため、なおかつ産卵、5 フルオロデオキシウリジン (FUdR) など化学物質の使用を避けてください。
一般的に、我々 はそれを分析のためのいくつかの時間ポイントを計画に非常に有用発見しました。堅牢なアッセイを一般に一貫したタイミングが確率とごくわずかな変化は、2 4 時間以内アッセイの死のタイミングをシフトします。まず、最も単純な答えに便利ですのトラブルシューティングが必要な場合すなわち、新鮮なメディアの準備、最新の細菌文化を破棄し、非常にまれこれらの措置に復元しない分析機能だけ再凍結する在庫等から菌株を連勝します。
メソッドの相対的なシンプルさのためさまざまな変更を簡単に実行できます。ハイスループット RNAi の画面一様glp-4(bn2)背景からワームを変更するなど本明細書で述べるもの化学物質と有毒な化学薬品の広い範囲のホスト応答経路を識別するために役立ちます。たとえば、追加する同じ化学物質や毒素と(例えばCry5B の毒素、フェナントロリン等)RNAi プレートの各ウェルに、これらの毒素に感度を変更する経路は容易に識別できます。画面のこれらのタイプは、線虫に感染する病原体の盛装のいずれかに対して防衛ネットワークを識別するためにも使用できます。

身分証明書と有効な広域スペクトル抗生物質の開発今ほぼ世紀前に、公衆衛生における重要な分岐点につながった病気は過去の惨劇になる感染が広まった信念があった。いくつかの短い十年以内この楽天主義は病原体病原体がこれらの一度奇跡的な治療法が限られて抵抗機構を開発した後として、衰え始めた。いくつかの時間のため、薬剤の発見の努力と病原体の間の軍拡はバランスの取れたように見えた。しかし、抗菌薬の誤用は最近肺炎桿菌、アシネトバクター属 baumanii、セラチア、および膿1、パン薬剤耐性菌の出現に結実して 2,3,4。
膿は、人免疫不全状態、または嚢胞性線維症のある重症の熱傷患者へ深刻な脅威である日和見のグラム陰性、マルチホスト菌です。それはまたますます特に抗菌薬耐性の継続的な買収のための深刻な院内感染の原因となるエージェントとして識別されます。この脅威に対処するには、我々 は、定評のc. の elegans-膿感染システム5を使用しています。私たちの研究室6ホストを殺すために病原体の能力を制限する新規化合物を識別するために液体ベース、高スループット、高コンテンツ スクリーニング プラットフォームを開発するこのシステムが活用されています。興味深いことに, これらの化合物は抗菌剤7および病原性阻害剤8を含む少なくとも 3 つの一般的なカテゴリに属しているようです。線虫c.エレガンス他高コンテンツ薬物検出アッセイ結核菌 tuberculosum、クラミジア ・ トラコマチス、仮性結核菌、リステリア菌、野兎病菌、黄色ブドウ球菌、カンジダ ・ アルビカンス、報告されていると腸球菌、他の中で9,10、11,12,13,14,,1516。これらの種類のアッセイのホストと病原体、化学画面とを超えてヒットを識別する能力に比べてバイオアベイラビリティの可能性の増大に有毒かもしれない誤検出の制限など、いくつかのよく知られている利点があります。単に反 virulents、免疫促進分子、またはそれ以外の場合前者を支持して宿主-病原体相互作用のバランスを傾ける化合物など、微生物の増殖を制限すること。さらに、これらの画面で発見された化合物は、哺乳類のホストで効果的。
それは、少なくとも 2 つ他の試金17,18が液体にc. の elegansの高スループット画面を実行する使用できることは注目に値するです。しかし、これらのアッセイのそれぞれは液体で実行する遅い殺害として知られている、典型的な腸の植民地化アッセイができる変更のスループットが向上しより容易に選別する化合物。慎重に評価は決定的な細菌の病原性のメカニズムがこれらの試金および液体ベースのスクリーン7間で異なっていることを示しています。病原性の両方のタイプは、哺乳類システムで観察される、ので、アッセイの選択前に実験者の利益に最も関連するどの病原性を規定を検討することが重要です。
液体ベースの最適化されたバージョンを示すC. elegans P. 緑膿菌の試金。グラム陽性の細菌の病原体に対応する液体を用いた測定手法の適応を述べる腸球菌。膿のようなe. フェカリスますます深刻な院内の脅威として抗菌薬耐性経路1の成長している兵器で識別されます。腸球菌の高速スクリーニング法の前に14が存在する病原体は、手順が複雑になりますし、COPAS FlowSort のような機器に汚染の可能性が高くなると preinfection が必要です。提案プロトコルの安全性プロファイルを改善、感染前の必要があります。最後に、これらのアッセイのいずれかは、確立の役割を果たすホストの要因を検索するユーザーを許可する RNAi や感染に対する抵抗性を餌と併用できる手段を報告します。

<table><tbody><tr><td>COPAS FP BioSorter</td><td>Union Biometrica</td><td></td><td>Large object flow cytometer/worm sorter</td></tr><tr><td>Cytation 5</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EL406 Washer Dispenser</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multitron Pro</td><td>Infors HT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>24 Deep-Well RB Block</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>CS15124</td><td></td></tr><tr><td>384-Well plate</td><td>Greiner Bio-One</td><td>MPG-781091</td><td></td></tr><tr><td>Nematode Growth Media (NGM)</td><td></td><td></td><td>Amount per liter: 18 grams agar, 3 grams NaCl, 2.5 grams Peptone, 1 mL CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; (1 M), 1 mL MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (1 M), 25 mL Phospate buffer, and 973 mL of milli-Q water</td></tr><tr><td>Slow Killing (SK) plates</td><td></td><td></td><td>Amount per liter: 18 grams agar, 3 grams NaCl, 3.5 grams Peptone, 1 mL CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; (1 M), 1 mL MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (1 M), 25 mL Phospate buffer, and 973 mL of milli-Q water</td></tr><tr><td>Slow Killing (SK) media</td><td></td><td></td><td>Amount per liter:&amp;nbsp; 3 grams NaCl, 3.5 grams Peptone, 1 mL CaCl&lt;sub&gt;2 &lt;/sub&gt;(1 M), 1 mL MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (1 M), 25 mL Phosphate buffer, and 973 mL of milli-Q water</td></tr><tr><td>Lysogeny Broth (LB)</td><td>USBiological Life Sciences</td><td>L1520</td><td></td></tr><tr><td>Brian Heart Infusion broth (BHI)</td><td>Research Products International Corp</td><td>50-488-526</td><td></td></tr><tr><td>Worm Bleach Solution</td><td></td><td></td><td>Amount per 100 mL: 10 mL of 5 M NaOH solution, 20 mL of 5% Sodium Hypochlorite Solution, and 70 mL of sterile water</td></tr><tr><td>S Basal</td><td></td><td></td><td>Amount per liter: 5.85 grams NaCl, 6 grams KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 1 gram K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, and 1 Liter of milli-Q water</td></tr><tr><td>Agar</td><td>USBiological Life Sciences</td><td>A0930</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>USBiological Life Sciences</td><td>S5000</td><td></td></tr><tr><td>Peptone</td><td>USBiological Life Sciences</td><td>P3300</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>USBiological Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>M63-500</td><td></td></tr><tr><td>Phospate buffer</td><td></td><td></td><td>amount per liter: 132 mL of K2HPO4 (1M) and 868 mL of KH2PO4 (1M)</td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Acros Organics</td><td>7778-77-0</td><td></td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>USBiological Life Sciences</td><td>P5100</td><td></td></tr><tr><td>5% Sodium Hypochlorite Solution</td><td>BICCA</td><td>7495.5-32</td><td></td></tr><tr><td>NaOH solution</td><td>Fisher Scientific</td><td>SS255-1</td><td></td></tr><tr><td>Breathe-easy</td><td>Diversified Biotech</td><td>BEM-1</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Orange Nucleic Acid Stain</td><td>Fisher Scientific</td><td>S11368</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Bacterial Strains&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;P. aeruginosa &lt;/em&gt;(PA14)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. faecalis&lt;/em&gt;(OG1RF)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli &lt;/em&gt;superfood (OP50)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli &lt;/em&gt;RNAi expressing bacteria (HT115)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Worm Strains &lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;glp-4&lt;/em&gt;(&lt;em&gt;bn2&lt;/em&gt;) (Beanan and Strome, 1992, PMID: 1289064)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PINK-1::GFP reporter (Kang et al., 2018, PMID: 29532717)</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a high-throughput, high-content, liquid-based c. elegans pathosystem

識別される新薬の数によって、伝統的な体外画面は暮れゆき、多剤耐性を戦闘に新たな武器を求めてこのアプローチの成功を減らすこと。これは、研究者はのみ新しい薬を見つける必要はありませんが、またそれらを見つける新しい方法を開発する必要があります結論につながっています。最も有望な候補の中でメソッドは、全体の生物、生体内でその使用の高スループット、表現型のリードアウトを試金して動脈分布を線虫からその範囲をホストします。これらのホストには、ホストまたは biounavailable に有毒な化合物は、通常を高価なフォローする前に、最初の画面にドロップした時に誤検出での劇的な削減を含むいくつかの強力な利点があります。
ここで我々 の分析が定評のc. の elegansのホスト変化を調査する使用されている方法を紹介-緑膿菌液殺害病態システム。よく働いたこの技術のいくつかの拡張機能を紹介します。たとえば、我々 は 24 または 96 ウェルで RNAi を用いた高スループット遺伝スクリーンをこのホスト病原体の相互作用でクエリ ホスト要因にプレート フォーマットを運ぶことができます。この試金を使用して、可能性のある骨の折れるの生化学的な浄化方法を必要とせず、創薬のターゲットを識別するタスクを大幅に効率化できる、少数の月だけで全ゲノム スクリーンを完了できます。
我々 もここでグラム陰性病原菌膿のグラム陽性菌腸球菌を代替となる手法の変化を報告します。ずっと膿の場合に、腸球菌による殺害は時間依存です。以前c. の elegansのとは異なり、腸球菌の試金、我々 の分析腸球菌は、preinfection を必要としない、その安全性の向上、液体処理機器の汚染の可能性を減らすこと。試金は非常に堅牢な 〜 95% 死亡率 96 h ポスト感染を示します。

分析パフォーマンスのための重要なパラメーター
トラブルシューティングと分析を最適化するために必要なこの試金の基礎となる生物学の正しい理解が。そのために、私たちを参照してください最初いくつか主要なペーパー,緑膿菌の発症のメカニズムを解明-リキッド7,20で殺害を介する。上記で説明した手順に従っている (試金のプロトコルの概略は図 1を参照)、線虫の時間依存の殺害は (図 2 a) 病原体の存在下でのみ観察します。対照的に、キーの栄養補助食品 (例えばペプトン、メディアから外されますのみ S 基底が追加された場合) がない場合は、ほとんどない殺害が観察される (図 2 b)。興味深いことに、(37 ° c、25 ° c 24 時間 24 h) の従来の遅い殺害アッセイのために重大でありもともと膿の 2 段階培養実装する液体を殺す21、この試金 (に不可欠であるは図 2)。追加することはできますが大幅そう一晩 LB 文化から直接膿は致死速度を変更しはお勧めしません。
適切かつ望ましい場合は、アッセイの簡素化を試金の生物学を理解することも可能です。たとえば、ホストこのアッセイで殺害の最も重要なドライバーは担鉄細胞 pyoverdine と pyoverdine によるホスト毒性鉄7をバインドする能力に依存しています。試金がc. の elegans の転写応答として生きたバクテリアの pyoverdine 豊富な濾液、精製された pyoverdine、またはさらにいくつかの合成鉄キレート物質 (例えば、 1, 10-フェナントロリン) に置き換えることで簡略化できますよう、これらの治療法は非常に似ている (図 3)22。
いくつかの異なるラインの証拠は実験装置のロバスト性に話しかけます。最初に、セットアップは、初期の細菌濃度の広い範囲を許容します。OD600 として低濃度 = 0.0025 (約 10 倍低い推奨値より) まだ展示時間と濃度依存の殺害、タイミングは (図 4 a) をシフトします。第二に、アッセイの再現性はそのような少数としてその 4 井戸としては頻繁に統計的に有意なデータ (図 4 b) を得るのに十分な。
推奨されませんいくつかの変更があります。プロトコルに記載されているよりもはるかに高い濃度の初期菌接種の使用などその場合得点致死を複雑に困難または不可能効果的に洗い流すには、厚さ、バイオ フィルムのようなの素材。さらに、高濃度により接種も酸素を競うでき非固有のホスト殺害7をトリガーできます。
もう一つ重要な注意点はアッセイを停止し、死んでワームを画像間の時間の期間を制限します。効率的であることが重要ですのでこの時間枠が染色を含める必要があることに注意してください。死の後、ワーム内生物材料は押し出しや細菌によって消費されるを開始します。24-32 h 以内、キューティクルだけが残っています。キューティクルは非常に悪い汚れや、洗浄中に失うしやすく、非常に軽いです。この現象を (すなわち、まだ、いくつかのワームが生きていること、他の人は自分のコンテンツを既に失っているし、イメージすることは不可能) で、系統または殺害の非常に異なる反応速度でひずみ/RNAi 条件などが複雑になることに注意してくださいすることが重要です。図 4 aプレートの左側にワームとしてこの現象を示しています非常に低濃度の細菌を接種した、まだ主として生きているプレートの右側にあるワームの多くは高濃度にさらされました。細菌が流されました。
アッセイの成功の非常に重要な決定要因は、収集し、データを分析するために使用方法です。私たちの研究室でこれらの試金からデータを収集するために少なくとも 3 つの方法を使いました: 流 vermimetry (すなわち、 c. の elegansを流れ cytometry 技術の適応; 文字通り、測定、自動化された顕微鏡は、吸光光度法液流動のワーム)。これらのメソッドの最初は、spectophotometer を使用して染料または問題のワームの記者の蛍光を読み取ります。このメソッドは、かなりユビキタス機器 (マイクロ プレート リーダー、分光光度計標準) を使用しての利点を持って、データを取得する最速の方法です。しかし、それは自動顕微鏡から利用可能な情報コンテンツと流 vermimetry の統計的検出力を欠いています。
自動顕微鏡は別の実行可能なオプションです。マイクロ プレートのイメージング システムの数は現在市場より高価な価格が大きいほど、(例えばバイオ-tek 社 Cytation5) に単一の調査官に手頃な価格に至るまで、コアでより一般的に見られる高品質マシン施設 (例えば、分子デバイス ImageXpress 顕微鏡)。実際には、これらのソリューションのほとんど、ほとんどの画面とアッセイをスコアリングのため。最も自動化された画像処理プラットフォームは、画像情報の収量を促進する (例えば久万、ImageJ、Gene5、またはセル プロファイラー) 処理のため下流のソフトウェアにも結合できます。処理のユーティリティの例を図 5と図 6に示します。信号対雑音比が高い (図 5) のように、分析は簡単、正と負の条件を区別はたやすい。これらのケースでは、弱いかもヒットを容易に識別できます。多くの試金、しかし、弱い信号対雑音比があります。たとえばの 1, 10 フェナントレン啉と (とその pharynges の構成 mCherry 式) ピンク 1::GFP22寄生虫の治療はピンク 1::GFP のレベルを増加します。データ分析用誘導型 GFP レポーターは構成の mCherry 信号 (図 6) に正規化されます。この場合、記者は弱い表現を持っているおよび/またはワームの大半ではアクティブ化されません。したがって、バック グラウンドを低減でき、信号を増幅する携帯プロファイラーのような追加ツール画像処理を実装する有利かもしれません。
最後に、COPAS FlowPilot が利用可能な場合、フロー vermimetry 経由でデータを取得する使用できます。はるかフローサイトメトリーのもっと身近な概念のような少なくとも 2 つまたは 3 つのチャンネルで同時にc. の elegansの蛍光を測定するこの楽器を使用できます。この方法は、統計の重要性が高いデータの取得に非常に適してが、スループットは非常に自動化された顕微鏡に比べて減少しました。流 vermimetry の最も重要な利点は、複製ではなく複数の井戸に分割し、井戸のなかを分析するための 1 つのグループとして全体のワームの集団を分析する能力。劇的にこの方法で大規模なグループの分析統計の力を向上させるし、も小さな効果の検出が可能します。
液体殺害アッセイの変更
アッセイの最近の動向は、蛍光レポーター (図 6) - ハイスループット RNAi 技術 (図 3)、および元の置換も使用しての活性化を試金、その有用性を拡張しています。病原体。
RNAi のセットアップを使用する最も明白な理由は、膿(または他の病原体) に対するホストの防衛の経路をテストします。遺伝子関連アッセイで生存のための RNAi ノックダウンの例を図 3に示します。以前観測20,23,24,25に一貫した、 daf-2(RNAi)強化daf 16 (中に膿露光中にc. の elegans生存RNAi)、 zip-2(RNAi)とcebp-1(RNAi)はそれを短縮します。前述のように、RNAi は multiwell プレートの各ウェルに異なる RNAi クローンを表示上のワームの成長の分析で最も単に含まれています。寒天と小さなボリューム関係の高粘度のため特別な機器なし 96 ウェル プレートの制服、バブル無料充填を実現することは困難です。さらに、外部井戸乾燥寒天割れの不均一性と大きな可能性につながる内部の井戸より速く乾燥菌株、RNAi を運ぶ問題することができますも。上述したように、これはスクリーニング、液体処理機械を目詰まりのリスクのため利用できる動物の数を減らす、巣穴にワームを奨励しています。これらの理由の両方について, 24 ウェル プレート、96 ウェルのプレートよりも簡単です。これは、アッセイのスループットが減少、それ、信頼性向上、提案は、初期画面の特に。
最後に、アッセイに膿を置き換えるe. フェカリスアッセイを変更されています。(原則として、他の細菌種の置換提供しないでください不当な困難される適切な培養と照射条件が識別されます。)考慮すべき最も重要な要因は病原体、成長と発展と病原性の誘導のためのメディアの要件です。たとえば、(BHI) のような栄養豊富なメディアと膿14,26に比べて高温培養、グラム陽性、日和見病原体腸球菌が必要です。考慮これらの要因の適応によって、腸球菌を使用する分析は簡単だった。P. aeruginosaで述べたように、我々 は時間依存の殺害 (図 7) を見た。興味深いことに、死のタイミングは、寒天プレート26日に病因に関与するメカニズムが異なることを示唆するこのステップの不在にもかかわらず感染前を使用される以前に発行されたアッセイに似ていた。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58068/58068fig1.jpg"> 図 1: 液体ベースのc. の elegans -膿感染試験方式。線虫増殖と準備に関連する手順は、左側にある、右の細菌の準備。両方に関連する手順が中心です。<a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/58068/58068fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58068/58068fig2.jpg"> 図 2: c. の elegans 膿の殺害は、適切な細菌の栄養が必要です。大腸菌と膿の存在 (A) c. の elegansの死。(B) (右) と膿の存在下ではc. の elegans死とミックスに追加されます (左) 低速を殺すメディアのない (すなわち、 S 根元のみ)。S 基底は最小限のメディアと細菌の増殖に必要な栄養素が含まれていない、pyoverdine の生産を排除します。(C) 別様に準備された膿の存在下での線虫の死。p < 0.01、スチューデントtに基づいて-テストします。誤差範囲は、生物学的条件あたりあたり使用された井戸 S.E.M. 10 を表しています。<a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/58068/58068fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58068/58068fig3.jpg"> 図 3:線虫抵抗性膿はホストの免疫のパスに依存します。膿(A) または 1, 10-フェナントロリン (液体の膿への暴露を模倣化学キレート剤) の内服で選択した RNAi ノックダウンのパネル (B)。p < # 0.01、p < 0.05、スチューデントtに基づいて-テストします。誤差範囲は、生物学的条件あたりあたり使用された井戸 S.E.M. 10 を表しています。<a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/58068/58068fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58068/58068fig4.jpg"> 図 4:膿にc. の elegansの殺害は堅牢と細菌の集中によって決まります。(A B) 代表的な画像 (A) と緑膿菌のさまざまな濃度への暴露後 72 h pのc. の elegans死の定量化 (B)-学生を算出した t-テストします。(A) スケール バーは生物学的条件あたりあたり 1 mm. 16 井戸が使用されました。BF: 明るい分野, フロリダ: 蛍光。<a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/58068/58068fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58068/58068fig5.jpg"> 図 5: 強い信号でアッセイのデータ集録および画像処理します。(A) 代表的なイメージのライブ (マイナス コントロール) と死者 (肯定的な制御)線虫。(B) の正と負のコントロール データ取得法、処理モード、および分析の井戸の数に基づいて統計解析。(C) 蛍光 (2 つ陽性および陰性対照の 2 つの井戸) 96 ウェル プレートの 4 つの個々 の井戸からワームを調べた。それぞれはよく 〜 100 ワームを含まれています。グラフの各ドットは、飛行時間 (これと相関するが、生きているワームの巻き線、により不完全サイズを表します) と Sytox オレンジ色のステンドがワームの測定された蛍光を示す 1 つのワームを表します。肯定的な制御のワームは、加熱によって殺された前。緊張と死んでワームの形状が変更されたのため ((A) でわかるように、死んでワームよりロッドのようなが表示され、数体の屈曲がある) 生きている相手と比較して、死んでワームがある長い TOF。p-値算出スチューデントのt-テストします。(A) スケール バーは 1 mm です<a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/58068/58068fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するにはここをクリックしてください。</a> 。
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58068/58068fig6.jpg"> 図 6: 中等度の信号とアッセイのデータ集録および画像処理します。(A) 誘導ピンク 1::GFP 記者と mCherry 構成マーカー (染色体外の配列からの遺伝子発現を正常化) に運ぶのc. の elegansの代表的なイメージ。C. の elegans DMSO (マイナス コントロール) または 1, 10-フェナントロリン (肯定的な制御) にさらされます。(B) の正と負のコントロール データ取得法、処理モード、および分析の井戸の数に基づいて統計解析。96 ウェル プレート (2 つ陽性および陰性対照の 2 つの井戸) の 4 (C) 個々 の井戸流 vermimetry を用いていた。p-値算出スチューデントのt-テストします。(A) スケール バーは 1 mm です<a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/58068/58068fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するにはここをクリックしてください。</a> 。
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58068/58068fig7.jpg"> 図 7:腸球菌による線虫の殺害は、堅牢かつ時間依存です。(A B) 代表的な画像 (A) と腸球菌への暴露後にc. の elegans死の定量化 (B)。p < 0.01、スチューデントtに基づいて-テストします。10 井戸は、生物学的条件あたりあたり使用されました。誤差範囲を表すにある S.E.M. スケール バー (A)です 1 mm<a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/58068/58068fig7large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

ここでは適応可能、全体のホスト、ホスト病原体の相互作用を研究し、創薬に使用することが出来、高コンテンツ スクリーニング ツール プロトコルについて述べる。

高スループット、高コンテンツ、液体ベースのc. の elegans病態システム

The number of new drugs identified by traditional, in vitro screens has waned, reducing the success of this approach in the search for new weapons to ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

14.4K ビュー.  Rice University. ここでは適応可能、全体のホスト、ホスト病原体の相互作用を研究し、創薬に使用することが出来、高コンテンツ スクリーニング ツール プロトコルについて述べる。

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A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages for identifying biologically active chemical structures that can modify complex phenotypes such as lifespan. Described here is a simple protocol for producing hundreds of 96-well culture plates with fairly consistent numbers of C. elegans in each well. Next, we specified how to use these cultures to screen thousands of chemicals for effects on the lifespan of the nematode C. elegans. This protocol makes use of temperature sensitive sterile strains, agar plate conditions, and simple animal handling to facilitate the rapid and high throughput production of synchronized animal cultures for screening.

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Here we describe a simple protocol for rapidly producing hundreds of nematode growth media agar, 96-well culture plates with consistent numbers of Caenorhhabditis elegans per well. These cultures are useful for the phenotypic screening of whole organisms. We focus here on using these cultures to screen chemicals for pro-longevity effects.

カエノラブディティス ・ エレガンスにおけるハイスループット化合物スクリーニングのための簡単な方法

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

生化学

Automated Analysis of a Nematode Population-based Chemosensory Preference Assay

The nematode, Caenorhabditis elegans' compact nervous system of only 302 neurons underlies a diverse repertoire of behaviors. To facilitate the dissection of the neural circuits underlying these behaviors, the development of robust and reproducible behavioral assays is necessary. Previous C. elegans behavioral studies have used variations of a "drop test", a "chemotaxis assay", and a "retention assay" to investigate the response of C. elegans to soluble compounds. The method described in this article seeks to combine the complementary strengths of the three aforementioned assays. Briefly, a small circle in the middle of each assay plate is divided into four quadrants with the control and experimental solutions alternately placed. After the addition of the worms, the assay plates are loaded into a behavior chamber where microscope cameras record the worms' encounters with the treated regions. Automated video analysis is then performed and a preference index (PI) value for each video is generated. The video acquisition and automated analysis features of this method minimizes the experimenter's involvement and any associated errors. Furthermore, minute amounts of the experimental compound are used per assay and the behavior chamber's multi-camera setup increases experimental throughput. This method is particularly useful for conducting behavioral screens of genetic mutants and novel chemical compounds. However, this method is not appropriate for studying stimulus gradient navigation due to the close proximity of the control and experimental solution regions. It should also not be used when only a small population of worms is available. While suitable for assaying responses only to soluble compounds in its current form, this method can be easily modified to accommodate multimodal sensory interaction and optogenetic studies. This method can also be adapted to assay the chemosensory responses of other nematode species.

We present a behavior recording setup and protocol that enables automated analysis of the nematode, Caenorhabditis elegans' preference for soluble compounds in a population-based assay. This article describes the construction of a behavior chamber, the behavioral assay protocol, and video analysis software usage.

線虫集団ベースの化学感覚嗜好アッセイの自動解析

The nematode, Caenorhabditis elegans' compact nervous system of only 302 neurons underlies a diverse repertoire of behaviors. To facilitate the dissection ...

行動学

A High-throughput Assay for the Prediction of Chemical Toxicity by Automated Phenotypic Profiling of Caenorhabditis elegans

Applying toxicity testing of chemicals in higher order organisms, such as mice or rats, is time-consuming and expensive, due to their long lifespan and maintenance issues. On the contrary, the nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) has advantages to make it an ideal choice for toxicity testing: a short lifespan, easy cultivation, and efficient reproduction. Here, we describe a protocol for the automatic phenotypic profiling of C. elegans in a 384-well plate. The nematode worms are cultured in a 384-well plate with liquid medium and chemical treatment, and videos are taken of each well to quantify the chemical influence on 33 worm features. Experimental results demonstrate that the quantified phenotype features can classify and predict the acute toxicity for different chemical compounds and establish a priority list for further traditional chemical toxicity assessment tests in a rodent model.

A High-throughput Assay for the Prediction of Chemical Toxicity by Automated Phenotypic Profiling of Caenorhabditis elegans

A quantitative method has been developed to identify and predict the acute toxicity of chemicals by automatically analyzing the phenotypic profiling of Caenorhabditis elegans. This protocol describes how to treat worms with chemicals in a 384-well plate, capture videos, and quantify toxicological related phenotypes.

線虫の表現型プロファイリングを自動化によって化学的毒性予測のための高スループット試金

Applying toxicity testing of chemicals in higher order organisms, such as mice or rats, is time-consuming and expensive, due to their long lifespan and ...

環境学

Culture and Assay of Large-Scale Mixed-Stage Caenorhabditis elegans Populations

Caenorhabditis elegans (C. elegans) has been and remains a valuable model organism to study developmental biology, aging, neurobiology, and genetics. The large body of work on C. elegans makes it an ideal candidate to integrate into large-population, whole-animal studies to dissect the complex biological components and their relationships with another organism. In order to use C. elegans in collaborative -omics research, a method is needed to generate large populations of animals where a single sample can be split and assayed across diverse platforms for comparative analyses.
Here, a method to culture and collect an abundant mixed-stage C. elegans population on a large-scale culture plate (LSCP) and subsequent phenotypic data is presented. This pipeline yields sufficient numbers of animals to collect phenotypic and population data, along with any data needed for -omics experiments (i.e., genomics, transcriptomics, proteomics, and metabolomics). In addition, the LSCP method requires minimal manipulation to the animals themselves, less user preparation time, provides tight environmental control, and ensures that handling of each sample is consistent throughout the study for overall reproducibility. Lastly, methods to document population size and population distribution of C. elegans life stages in a given LSCP are presented.

Culture and Assay of Large-Scale Mixed-Stage Caenorhabditis elegans Populations

To use Caenorhabditis elegans (C. elegans) in omics research, a method is needed to generate large populations of worms where a single sample can be measured across platforms for comparative analyses. Here, a method to culture C. elegans populations on large-scale culture plates (LSCPs) and to document population growth is presented.

大規模混合ステージ カエノハブディティス・エレガンス集団の 文化とアッセイ

Caenorhabditis elegans (C. elegans) has been and remains a valuable model organism to study developmental biology, aging, neurobiology, and genetics. The ...

遺伝学

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of Alzheimer's disease (AD) and is found in Lewy body dementia, inclusion body myositis and cerebral amyloid angiopathy 1-4. Amylopathies progressively develop with time. For this reason simple organisms with short lifespans may help to elucidate molecular aspects of these conditions. Here, we describe experimental protocols to study A&beta;-mediated neurodegeneration using the worm Caenorhabditis elegans. Thus, we construct transgenic worms by injecting DNA encoding human A&beta;42 into the syncytial gonads of adult hermaphrodites. Transformant lines are stabilized by a mutagenesis-induced integration. Nematodes are age synchronized by collecting and seeding their eggs. The function of neurons expressing A&beta;42 is tested in opportune behavioral assays (chemotaxis assays). Primary neuronal cultures obtained from embryos are used to complement behavioral data and to test the neuroprotective effects of anti-apoptotic compounds.

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

We describe methods to study aspects of amylopathies in the worm C. elegans. We show how to construct worms expressing human A&beta;42 in neurons and how to test their function in behavioral assays. We further show how to obtain primary neuronal cultures that can be used for pharmacological testing.

A<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</emAmylopathyの研究のための&gt;モデルシステム

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of ...

神経科学

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes. However, many compounds identified in screens using cell culture models are often found to be toxic or pharmacologically inactive in vivo1-2. Screening in whole animal models can help avoid these pitfalls and streamline the path to drug development.
C. elegans is a multicellular model organism well suited for HTS. It is small (&lt;1 mm) and can be economically cultured and dispensed in liquids. C. elegans is also one of the most experimentally tractable animal models permitting rapid and detailed identification of drug mode-of-action3.
We describe a protocol for culturing and dispensing fluorescent strains of C. elegans for high-throughput screening of chemical libraries or detection of environmental contaminants that alter the expression of a specific gene. Large numbers of developmentally synchronized worms are grown in liquid culture, harvested, washed, and suspended at a defined density. Worms are then added to black, flat-bottomed 384-well plates using a peristaltic liquid dispenser. Small molecules from a chemical library or test samples (e.g., water, food, or soil) can be added to wells with worms. In vivo, real-time fluorescence intensity is measured with a fluorescence microplate reader. This method can be adapted to any inducible gene in C. elegans for which a suitable reporter is available. Many inducible stress and developmental transcriptional pathways are well defined in C. elegans and GFP transgenic reporter strains already exist for many of them4. When combined with the appropriate transgenic reporters, our method can be used to screen for pathway modulators or to develop robust biosensor assays for environmental contaminants. 
We demonstrate our C. elegans culture and dispensing protocol with an HTS assay we developed to monitor the C. elegans cap &#x2018;n&#x2019; collar transcription factor SKN-1. SKN-1 and its mammalian homologue Nrf2 activate cytoprotective genes during oxidative and xenobiotic stress5-10. Nrf2 protects mammals from numerous age-related disorders such as cancer, neurodegeneration, and chronic inflammation and has become a major chemotherapeutic target11-13.Our assay is based on a GFP transgenic reporter for the SKN-1 target gene gst-414, which encodes a glutathione-s transferase6. The gst-4 reporter is also a biosensor for xenobiotic and oxidative chemicals that activate SKN-1 and can be used to detect low levels of contaminants such as acrylamide and methyl-mercury15-16.

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

A procedure for liquid-based culturing and dispensing of C. elegans strains expressing fluorescent reporter proteins is described that does not require expensive sorting equipment. This approach can be applied to numerous inducible C. elegans genes for drug discovery or biosensing of contaminants.

蛍光とハイスループットスクリーニングとバイオセンシング C.エレガンス菌株

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes.  However, many compounds identified in ...

生物学

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

RNA interference is a powerful method to understand gene function, especially when conducted at a whole-genome scale and in a quantitative context. In C. elegans, gene function can be knocked down simply and efficiently by feeding worms with bacteria expressing a dsRNA corresponding to a specific gene 1. While the creation of libraries of RNAi clones covering most of the C. elegans genome 2,3 opened the way for true functional genomic studies (see for example 4-7), most established methods are laborious. Moy and colleagues have developed semi-automated protocols that facilitate genome-wide screens 8. The approach relies on microscopic imaging and image analysis. 
	Here we describe an alternative protocol for a high-throughput genome-wide screen, based on robotic handling of bacterial RNAi clones, quantitative analysis using the COPAS Biosort (Union Biometrica (UBI)), and an integrated software: the MBioLIMS (Laboratory Information Management System from Modul-Bio) a technology that provides increased throughput for data management and sample tracking. The method allows screens to be conducted on solid medium plates. This is particularly important for some studies, such as those addressing host-pathogen interactions in C. elegans, since certain microbes do not efficiently infect worms in liquid culture.
	We show how the method can be used to quantify the importance of genes in anti-fungal innate immunity in C. elegans. In this case, the approach relies on the use of a transgenic strain carrying an epidermal infection-inducible fluorescent reporter gene, with GFP under the control of the promoter of the antimicrobial peptide gene nlp 29 and a red fluorescent reporter that is expressed constitutively in the epidermis. The latter provides an internal control for the functional integrity of the epidermis and nonspecific transgene silencing9. When control worms are infected by the fungus they fluoresce green. Knocking down by RNAi a gene required for nlp 29 expression results in diminished fluorescence after infection. Currently, this protocol allows more than 3,000 RNAi clones to be tested and analyzed per week, opening the possibility of screening the entire genome in less than 2 months.

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

We describe a protocol using C. elegans and RNAi feeding libraries that allows automated measurement of multiple parameters such as fluorescence, size and opacity of individual worms in a population. We give one example of a screen to identify genes involved in anti-fungal innate immunity in C. elegans.

の定量と自動ハイスループットゲノムワイドRNAiスクリーニング C.エレガンス</em

RNA interference is a powerful method to understand gene function, especially when conducted at a whole-genome scale and in a quantitative context. In C. ...

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

Caenorhabditis elegans is a well-established animal model in biomedical research, widely employed in functional genomics and ageing studies. To assess the health and fitness of the animals under study, one typically relies on motility readouts, such as the measurement of the number of body bends or the speed of movement. These measurements usually involve manual counting, making it challenging to obtain good statistical significance, as time and labor constraints often limit the number of animals in each experiment to 25 or less. Since high statistical power is necessary to obtain reproducible results and limit false positive and negative results when weak phenotypic effects are investigated, efforts have recently been made to develop automated protocols focused on increasing the sensitivity of motility detection and multi-parametric behavioral profiling. In order to extend the limit of detection to the level needed to capture the small phenotypic changes that are often crucial in genetic studies and drug discovery, we describe here a technological development that enables the study of up to 5,000 individual animals simultaneously, increasing the statistical power of the measurements by about 1,000-fold compared to manual assays and about 100-fold compared to other available automated methods.

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

We describe protocols for using the wide field-of-view nematode tracking platform (WF-NTP), which enables high-throughput phenotypic characterization of large populations of Caenorhabditis elegans. These protocols can be used to characterize subtle behavioral changes in mutant strains or in response to pharmacological treatment in a highly scalable fashion.

自動行動分析の大規模なc. の elegans集団による視野が広い追跡プラットフォーム

Caenorhabditis elegans is a well-established animal model in biomedical research, widely employed in functional genomics and ageing studies. To assess the ...

免疫・感染学

C. elegans Chemotaxis Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates. Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis behavior.
 The premise behind testing the response of the worms to an odorant is to place them in an area and observe the movement evoked in response to an odorant. Even with the many available assays, optimizing worm starting location relative to both the control and test areas, while minimizing the interaction of worms with each other, while maintaining a significant sample size remains a work in progress 1-10. The method described here aims to address these issues by modifying the assay developed by Bargmann et al.1. A Petri dish is divided into four quadrants, two opposite quadrants marked "Test" and two are designated "Control". Anesthetic is placed in all test and control sites. The worms are placed in the center of the plate with a circle marked around the origin to ensure that non-motile worms will be ignored. Utilizing a four-quadrant system rather than one 2 or two 1 eliminates bias in the movement of the worms, as they are equidistant from test and control samples, regardless of which side of the origin they began. This circumvents the problem of worms being forced to travel through a cluster of other worms to respond to an odorant, which can delay worms or force them to take a more circuitous route, yielding an incorrect interpretation of their intended path. This method also shows practical advantages by having a larger sample size and allowing the researcher to run the assay unattended and score the worms once the allotted time has expired.

C. elegans Chemotaxis Assay

A method of quantitatively evaluating the chemotactic response of Caenorhabditis elegans is described. A chemotactic index (CI) was employed as a way to precisely evaluate the response of worms to certain targets, and serve as a platform of comparison between strains and compounds of interest.

C. elegansの走化性アッセイ

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

High-Throughput Screening of Microbial Isolates with Impact on Caenorhabditis elegans Health

With its small size, short lifespan, and easy genetics, Caenorhabditis elegans offers a convenient platform to study the impact of microbial isolates on host physiology. It also fluoresces in blue when dying, providing a convenient means of pinpointing death. This property has been exploited to develop high-throughput label-free C. elegans survival assays (LFASS). These involve time-lapse fluorescence recording of worm populations set in multiwell plates, from which population median time of death can be derived. The present study adopts the LFASS approach to screen multiple microbial isolates at once for the effects on C. elegans susceptibility to severe heat and oxidative stresses. Such microbial screening pipeline, which can notably be used to prescreen probiotics, using severe stress resistance as a proxy for host health is reported here. The protocol describes how to grow both C. elegans gut microbiota isolate collections and synchronous worm populations in multiwell arrays before combining them for the assays. The example provided covers the testing of 47 bacterial isolates and one control strain on two worm strains, in two stress assays in parallel. However, the approach pipeline is readily scalable and applicable to the screening of many other modalities. Thus, it provides a versatile setup to rapidly survey a multiparametric landscape of biological and biochemical conditions that impact C. elegans health.

High-Throughput Screening of Microbial Isolates with Impact on Caenorhabditis elegans Health

Gut microbes may positively or negatively impact the health of their host via specific or conserved mechanisms. Caenorhabditis elegans is a convenient platform to screen for such microbes. The present protocol describes high-throughput screening of 48 bacterial isolates for impact on nematode stress resistance, used as a proxy for worm health.

カエノラブディティス・エレガンスの健康に影響を与える微生物分離物のハイスループットスクリーニング

With its small size, short lifespan, and easy genetics, Caenorhabditis elegans offers a convenient platform to study the impact of microbial isolates on ...

高スループット、高コンテンツ、液体ベースのc. の elegans病態システム

要約

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カエノラブディティス・エレガンスにおけるハイスループット化合物スクリーニングのための簡単な方法

線虫集団ベースの化学感覚嗜好アッセイの自動解析

線虫の表現型プロファイリングを自動化によって化学的毒性予測のための高スループット試金

大規模混合ステージカエノハブディティス・エレガンス集団の文化とアッセイ

A

蛍光とハイスループットスクリーニングとバイオセンシング C.エレガンス菌株

の定量と自動ハイスループットゲノムワイドRNAiスクリーニング C.エレガンス

自動行動分析の大規模なc. の elegans集団による視野が広い追跡プラットフォーム

C. elegansの走化性アッセイ

カエノラブディティス・エレガンスの健康に影響を与える微生物分離物のハイスループットスクリーニング

高スループット、高コンテンツ、液体ベースのc. の elegans病態システム

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カエノラブディティス ・ エレガンスにおけるハイスループット化合物スクリーニングのための簡単な方法

線虫集団ベースの化学感覚嗜好アッセイの自動解析

線虫の表現型プロファイリングを自動化によって化学的毒性予測のための高スループット試金

大規模混合ステージ カエノハブディティス・エレガンス集団の 文化とアッセイ

A

蛍光とハイスループットスクリーニングとバイオセンシング C.エレガンス菌株

の定量と自動ハイスループットゲノムワイドRNAiスクリーニング C.エレガンス

自動行動分析の大規模なc. の elegans集団による視野が広い追跡プラットフォーム

C. elegansの走化性アッセイ

カエノラブディティス・エレガンスの健康に影響を与える微生物分離物のハイスループットスクリーニング

カエノラブディティス・エレガンスにおけるハイスループット化合物スクリーニングのための簡単な方法

大規模混合ステージカエノハブディティス・エレガンス集団の文化とアッセイ