Name: assay to measure nucleocytoplasmic transport in real time within motor neuron-like nsc-34 cells
Uploaded: 2017-05-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assay to Measure Nucleocytoplasmic Transport in Real Time within Motor Neuron-like NSC-34 Cells at JoVE.com

AI laboratuvarının tüm üyelerine yararlı yorumları ve önerileri için teşekkür ederiz. Servis-GFP vektörünü bize sağladığı için Prof. Mark Hipp&#39;e (Max Planck Biyokimya Enstitüsü) teşekkür etmek istiyoruz. Bu çalışma, İsrail Bilim Vakfı (ISF # 124/14), Binational Science Foundation (BSF # 2013325), FP7 Marie Curie Kariyer Entegrasyonu Hibe (CIG # 333794) ve İsrail&#39;de Psikobiyoloji için Ulusal Enstitü ( NIPI # b133-14 / 15).

1. Hücre Hattı Hazırlama <ol><li> Sıvı azotlu bir kapta saklanan yaklaşık 1.000.000 fare nöroblastoma spinal kord hücresini (NSC-34 hücreleri) çözdürün. Hücreler tamamen eriyene kadar 37 ° C su kuluçka makinesini kullanın. </li><li> Taze, sıcak ortam (% 10 sığır fetüsü serumu (FBS),% 1 L-glutamin ve% 1 kalem strep antibiyotikleri içeren DMEM ortamı) ekleyin. </li><li> Çözülmüş hücreleri (SL16R) 500 xg&#39;de 5 dakika süreyle santrifüj ederek bir hücre pelletini oluşturun. Ortamı atın ve hücre yeniden süspansiyonu için 1 mL yeni ortam ekleyin. </li><li> Yeniden süspanse edilen hücreleri 15 mL&#39;lik bir şişeye yerleştirin ve ekstra 5 mL&#39;lik bir ortam ekleyin. Hücreleri bir gece boyunca 37 ° C&#39;de% 5 CO 2 ile steril bir inkübatörde inkübe edin. </li><li> Buna paralel olarak, 60 mm&#39;lik bir kültür çanağına 8 kaplanmamış lamelleri (kapak camı: 12 mm, 0.13-0.17 mm kalınlığında) yerleştirin ve kuru olana kadar% 70 etanol ile 30 dakika UV ışığına maruz bırakarak sterilize edin. Her çanağa orta miktarda ilave edin ve artık etanolü yıkamak için atın.</li><li> Yapışkan hücrelerin ayrışmasına izin vermek için yaklaşık% 90 konfluansa (kaba yaklaşık 6 milyon hücreye ulaştıktan sonra) tripsin tamponu (1 L Hanks &#39;Dengeli Tuz Çözeltisi içinde 2.5 g tripsin ve 0.2 g EDTA) ekleyin. NOT: NSC-34 hücreleri hassasdır ve ortamı kullanarak ayrılmadan önce 15 s tripsin tampon inkübasyonu ve tripsin içermeyen inkübasyondan 1 dakika daha gereklidir. </li><li> Plaka zaten 3 ml orta, yaklaşık 350.000 tabak başına lamelleri içeren 60 mm kültür yemekleri üzerine hücreleri. Lamelleri üzerine hücre eklenti sağlamak için 24 saat inkübatör bırakın. </li></ol> 2. Hücre Transfeksiyon NOT: Yaklaşık 24 saat sonra NSC-34 hücreleri% 40 birleşmeye (yaklaşık 800.000 hücre) ulaşır ve transfeksiyon için hazır olacaktır. <ol><li> Steril mikrosantrifüj tüpünde saf DMEM ortamı (her 60 mm kültür çanağı için 300 μL DMEM ortamı hazırlayın) hazırlayınes. </li><li> Her DMEM içeren mikrosantrifüj tüpüne transfeksiyon için gereken 2 μg&#39;lık her plazmid ilave edin. NOT: Mekik-GFP plazmiti, tüm hücre aktarımlarında zorunludur. </li><li> Gerekli plasmidleri içeren tüm mikrosantrifüj tüplerine transfeksiyon reaktifi ekleyin. Burada, her 2 ug DNA için ticari transfeksiyon reaktifi 4 mcL ekleyin. </li><li> DMEM, plazmid ve transfeksiyon reaktifi içeren mikrosantrifüj tüplerini vorteksleyin ve 25 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Her mikrosantrifüj tüpünü bir kültür çanağına ekleyin ve homojen bir solüsyon oluşturmak için çanağı hafifçe karıştırın. Çanağı inkübatöre 48 saat geri koyun. NOT: Mekik-GFP&#39;nin tüm hücrelerde eksprese edilmesi gerektiği için, mekik-GFP transfeksiyon etkinliği kısmen incelenebilir ve gecede transfeksiyon sonrasında floresanlı mikroskopi kullanılarak ön test edilebilir. Floresansız ifade edilen proteinlerin tam bir incelemesi, bir immünoblot analiziolduğunu. </li></ol> 3. Mikroskopi <ol><li> Bir lamel tutucuya transfekte NSC-34 hücreleri içeren lamelleri takın ve müttefiki ölen hücreleri kaldırmak için hafifçe fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın. </li><li> Ters çevrilmiş mikroskoplu yeşil bir fluoresan filtre kullanarak uygun bir hücre yamasını belirleyin. NOT: Uygun bir hücre yaması, çok sayıda hücreyi (bir alandaki 20-30 hücre) gösteren ve çekirdeklerin hücrelerde açıkça tanımlandığı bir mikroskop alan olarak tanımlanır. Hücre yamasındaki hücre çekirdeği önce gözle tanımlanır ve görüntüleme yazılımı ile manuel olarak işaretlenir. </li><li> Mikroskop altında lamelleri damlayan lamelleri PBS 10 ng / mL LMB içeren bir exportin-1 inhibitörü Leptomisin B (LMB) tampon 200 mcL ekleyin. NOT: Bu zaman noktası sıfır aralığı olarak ayarlanır. </li><li> İşaretli çekirdeklerin floresan yoğunluğunu yaklaşık 400-500 s boyunca 3 s aralıklarla ölçün. </li><li&gt; Her bir deneyde her bir transfeksiyon grubu için 3 ila 5 kapak fişi testi yapın. </li></ol> 4. Analiz NOT: Farklı hücreler, farklı düzeylerde floresan mekik-GFP ifade ettiğinden, her hücrenin nükleer flüoresan yoğunluğunu kendi başlangıç ​​flüoresan yoğunluğuna normalleştirmek önemlidir. <ol><li> İşaretlenen çekirdeğin flüoresan yoğunluğunu, her çekirdeğin 3-s floresan aralığını o çekirdeğin başlangıç ​​altı aralık ortalamasına bölerek normalize edin. </li><li> Her çekirdeğin normalleştirilmesinden sonra, her bir hücre yamasının zamana bağlı olarak çekirdek flüoresansındaki değişikliği temsil eden bir floresan yoğunluk eğrisi oluşturun. Bunu yapmak için, her hücre yamasındaki tüm hücrelerin ortalamasını hesaplayın (her yamanın yaklaşık 20-30 hücresinden oluşur). NOT: Çekirdek floresan yoğunluğu eğrisi artan ti içinde daha iyi gözlemlenen bir Michaelis-Menten doygunluk eğrisine benzemektedirBen dönemler. Bunun nedeni, nükleer transporta bağlı olarak zamanla mekik-GFP sitozolik miktarlarında bir azalmadır. Bu azalma, bir mekik-GFP&#39;nin çekirdeğe taşınma ihtimalini istatistiksel olarak düşürmekte ve dolayısıyla nükleer flüoresan satürasyonuna ulaşmaktadır. Eğrinin doğrusal başlangıç ​​hızından türeyen eğim, V max giriş hızını çekirdeğe verir. </li><li> Her bir deney grubunu temsil eden bir eğim oluşturmak için grafik yazılımı kullanarak, üç ila beş bağımsız deneyden türetilen her bir hücre yamasının V maks eğimlerini analiz edin. Tek yönlü ANOVA istatistiksel analizini kullanarak niceleme yapın. </li></ol> 5. Protein İfade Doğrulaması <ol><li> Buz üzerindeki her bir deney grubundan kalıntı hücreleri (yukarıdaki deneyde kullanılmayan) içeren 60 mm&#39;lik kültür yemekleri yerleştirin. </li><li> Ortamı atın ve seyreltmek ve kalan ortamı yıkamak için hücreleri iki kez PBS ile yıkayın. </li><li> Hücrelere 200-400 muamele edinPBS,% 0.5 Triton ve proteaz inhibitörü kokteyl tableti (PI) içeren lizis tamponu μL&#39;si. Hücre kazıyıcı kullanarak kazıyın. </li><li> Lizis tamponunda hücreleri bir mikrosantrifüj tüpünde toplayın ve buz altında 1 dakika süreyle 4.000 rpm&#39;de bir homojenleştirici ile homojenize edin. </li><li> Homojenleştirilmiş hücreleri 2500 xg&#39;de 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı toplayın, bir Bradford testi kullanarak protein konsantrasyonunu ölçün ve -20 ° C&#39;de kullanana kadar saklayın. </li><li> 30 ve 70 μg toplam protein (protein bağlı olarak) arasında toplayın ve bir immunoblot tahlili kullanılarak protein ekspresyonu için test etmek için bir SDS-PAGE jel yükleyin. </li></ol>

<ol>
	<li>Alberts, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular biology of the cell. , (2002).</li><li>Freitas, N., Cunha, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+and+signals+for+the+nuclear+import+of+proteins.">Mechanisms and signals for the nuclear import of proteins.</a> Curr Genomics. 10, 550-557 (2009).</li><li>Kalderon, D., Roberts, B. L., Richardson, W. D., Smith, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+short+amino+acid+sequence+able+to+specify+nuclear+location.">A short amino acid sequence able to specify nuclear location.</a> Cell. 39, 499-509 (1984).</li><li>la Cour, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+and+prediction+of+leucine-rich+nuclear+export+signals.">Analysis and prediction of leucine-rich nuclear export signals.</a> Protein Eng Des Sel. 17, 527-536 (2004).</li><li>Boeynaems, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+screen+connects+nuclear+transport+genes+to+DPR+pathology+in+c9ALS/FTD.">Drosophila screen connects nuclear transport genes to DPR pathology in c9ALS/FTD.</a> Sci Rep. 6, 20877 (2016).</li><li>Freibaum, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GGGGCC+repeat+expansion+in+C9orf72+compromises+nucleocytoplasmic+transport.">GGGGCC repeat expansion in C9orf72 compromises nucleocytoplasmic transport.</a> Nature. 525, 129-133 (2015).</li><li>Jovicic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modifiers+of+C9orf72+dipeptide+repeat+toxicity+connect+nucleocytoplasmic+transport+defects+to+FTD/ALS.">Modifiers of C9orf72 dipeptide repeat toxicity connect nucleocytoplasmic transport defects to FTD/ALS.</a> Nat Neurosci. 18, 1226-1229 (2015).</li><li>Kwon, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly-dipeptides+encoded+by+the+C9orf72+repeats+bind+nucleoli,+impede+RNA+biogenesis,+and+kill+cells.">Poly-dipeptides encoded by the C9orf72 repeats bind nucleoli, impede RNA biogenesis, and kill cells.</a> Science. 345, 1139-1145 (2014).</li><li>Rossi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+accumulation+of+mRNAs+underlies+G4C2-repeat-induced+translational+repression+in+a+cellular+model+of+C9orf72+ALS.">Nuclear accumulation of mRNAs underlies G4C2-repeat-induced translational repression in a cellular model of C9orf72 ALS.</a> J Cell Sci. 128, 1787-1799 (2015).</li><li>Shi, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxic+PRn+poly-dipeptides+encoded+by+the+C9orf72+repeat+expansion+block+nuclear+import+and+export.">Toxic PRn poly-dipeptides encoded by the C9orf72 repeat expansion block nuclear import and export.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. , (2017).</li><li>Zhang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C9orf72+repeat+expansion+disrupts+nucleocytoplasmic+transport.">The C9orf72 repeat expansion disrupts nucleocytoplasmic transport.</a> Nature. 525, 56-61 (2015).</li><li>Zhang, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C9ORF72+poly(GA)+aggregates+sequester+and+impair+HR23+and+nucleocytoplasmic+transport+proteins.">C9ORF72 poly(GA) aggregates sequester and impair HR23 and nucleocytoplasmic transport proteins.</a> Nat Neurosci. 19, 668-677 (2016).</li><li>Cleveland, D. W., Rothstein, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+Charcot+to+Lou+Gehrig:+deciphering+selective+motor+neuron+death+in+ALS.">From Charcot to Lou Gehrig: deciphering selective motor neuron death in ALS.</a> Nat Rev Neurosci. 2, 806-819 (2001).</li><li>DeJesus-Hernandez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanded+GGGGCC+hexanucleotide+repeat+in+noncoding+region+of+C9ORF72+causes+chromosome+9p-linked+FTD+and+ALS.">Expanded GGGGCC hexanucleotide repeat in noncoding region of C9ORF72 causes chromosome 9p-linked FTD and ALS.</a> Neuron. 72, 245-256 (2011).</li><li>Renton, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hexanucleotide+repeat+expansion+in+C9ORF72+is+the+cause+of+chromosome+9p21-linked+ALS-FTD.">A hexanucleotide repeat expansion in C9ORF72 is the cause of chromosome 9p21-linked ALS-FTD.</a> Neuron. 72, 257-268 (2011).</li><li>Boeve, B. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+frontotemporal+dementia+and/or+amyotrophic+lateral+sclerosis+associated+with+the+GGGGCC+repeat+expansion+in+C9ORF72.">Characterization of frontotemporal dementia and/or amyotrophic lateral sclerosis associated with the GGGGCC repeat expansion in C9ORF72.</a> Brain. 135, 765-783 (2012).</li><li>Haeusler, A. R., Donnelly, C. J., Rothstein, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expanding+biology+of+the+C9orf72+nucleotide+repeat+expansion+in+neurodegenerative+disease.">The expanding biology of the C9orf72 nucleotide repeat expansion in neurodegenerative disease.</a> Nat Rev Neurosci. 17, 383-395 (2016).</li><li>Woerner, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+protein+aggregates+interfere+with+nucleocytoplasmic+transport+of+protein+and+RNA.">Cytoplasmic protein aggregates interfere with nucleocytoplasmic transport of protein and RNA.</a> Science. 351, 173-176 (2016).</li><li>Tao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleolar+stress+and+impaired+stress+granule+formation+contribute+to+C9orf72+RAN+translation-induced+cytotoxicity.">Nucleolar stress and impaired stress granule formation contribute to C9orf72 RAN translation-induced cytotoxicity.</a> Hum Mol Genet. 24, 2426-2441 (2015).</li><li>Wen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antisense+proline-arginine+RAN+dipeptides+linked+to+C9ORF72-ALS/FTD+form+toxic+nuclear+aggregates+that+initiate+in+vitro+and+in+vivo+neuronal+death.">Antisense proline-arginine RAN dipeptides linked to C9ORF72-ALS/FTD form toxic nuclear aggregates that initiate in vitro and in vivo neuronal death.</a> Neuron. 84, 1213-1225 (2014).</li></ol>

Yazarlar açıklayacak bir şeye sahip değiller.

Bu protokol, nükleositoplazmik taşınımdaki dakika değişikliklerini değerlendirmek için oldukça hassas ve niceliksel yeni bir testi gösterir. Bu sistemi kullanarak, protein dağılımında dramatik değişikliklerle sonuçlanan büyük kusurları değil, nükleositoplazmik taşınmayı ve onun işlev bozukluğunu gerçek zamanlı olarak gözlemlemek ve ölçmek mümkündür. Bu tahlil sadece duyarlılık avantajına sahip olmakla kalmaz, aynı zamanda az miktarda hazırlık gerektirir, ucuzdur ve çok kolay ve düşük etkileşimli bir testtir. Bu sistemin etkinliğini test etmek için daha önce bir nükleositoplazmik ulaşım eksikliğine neden olduğu gösterilen ALS ve FTD modelleri olan C9orf72 proteinleri, poli (GR) ve poli (PR) DPR&#39;ler 5 , 7 , 8 , 10 , 12 kullanıldı. Bu tahlil kullanılarak, gerçek zamanlı olarak, yaklaşık% 50&#39;lik bir düşüş göstermiştir.Bir kontrol vektörü ile transfekte edilen hücrelere kıyasla DPR&#39;leri ifade eden hücrelerde nükleer ithalat oranı. Bu nedenle, bu sistem, nükleositoplazmik nakliyedeki muhtemel kusurların mevcut olabileceği diğer ve bu ALS veya FTD mutantlarının veya diğer hastalıkların neden olabileceği, nükleositoplazmik taşınımdaki küçük değişiklikleri kolayca ölçme olanağını açar. Burada açıklanan protokol motor nöron benzeri hücrelerle ilgiliyse de, diğer hücre tiplerine kolayca adapte edilebilir. En önemlisi, bu sistemi kullanarak, farklı moleküler faktörlerin veya ilaçların, ALS, FTD veya diğer bozukluklarda nükleositoplazmik transport eksikliklerini önlemeye veya kurtarmaya (hatta kısmen de olsa) yardımcı olabileceğini belirlemek artık mümkün. Bu tahlilin kullanılmasında olası bir kısıtlama, net bir çekirdek içermeyen hücrelerde hücre çekirdeğini gözlemleme ve işaretleme yeteneğinin sınırlı olmasıdır. Bunun üstesinden gelmek için olası bir çözüm, daha büyük bir görkemli<html> tirme. Bununla birlikte, bu sonuçta her hücre yamasındaki hücrelerin miktarını düşürecek ve önemli bir değere ulaşmak için gerekli deney miktarını artıracaktır. Başka bir husus, LMB ilavesinden önceki mekik-GFP çekirdeğinden sitoplazma oranına ilişkindir. Bu oran, farklı hücre tiplerinde çok farklı olabilir ve sonuç olarak görünür bir çekirdeği göstermek için çok küçük olabilir (1: 1&#39;e yakın bir oran olabilir). Olası bir çözüm, önceden bir nükleer işaretleyici kullanmaktır. Her hücre kendi orijinal nükleer flüoresansına normalleştirildiğinden bu, nihai analizi etkilemez. Ek olarak, bu tahlil, nükleer flüoresansta optimal artışın etkin bir şekilde izlenmesi için gerçekleştirilmeden önce, exportin inhibisyonu için kullanılan LMB konsantrasyonunun kalibre edilmesi önerilir. Nükleositoplazmik transport yetersizliğinin ALS 5&#39;deki motor nöronların dejenerasyonunda ana rolü oynadığı öne sürülmüştür ,= &quot;Xref&quot;&gt; 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 . Durum buysa, C9orf72 modelinde gözlemlenenlere benzer nükleosittoplazmik nakil kusurlarının diğer ALS modellerinde rol oynayacağı öngörülmektedir. Bununla birlikte, farklı modeller arasındaki büyük değişkenlik nedeniyle, nihai sonuçlan ve nükleositoplazmik bozulmadan kaynaklanan moleküler bulgular her iki durumda farkedilmeyebilir veya fenotipik olarak farklı olabilir. Farklı FALS modelleri üzerine kapsamlı araştırmalara rağmen, bunları ortak mekanizmalarla ilişkilendirmek bir sorun olarak kalmaktadır. Bu tahlil, şimdi bu meydan okumanın en azından kısmen aşılması için fırsat sağlayabilir.

Nükleer gözenek kompleksi (NPC), büyük moleküllerin hücre çekirdeğine girip çıkmasını kontrol eder. Düzenleme 1 olmadan çekirdeğe girebilen küçük moleküllerin aksine, daha büyük moleküllerin taşınması NPC tarafından güçlü bir şekilde kontrol edilir. Proteinler ve RNA gibi bu büyük moleküller, çekirdekten ithal edilecek ve ihraç edilecek olan importinler ve exportinler de dahil olmak üzere ulaşım faktörleri ile ilişkilendirilmektedir. İthal edilmek için, proteinler, genellikle nükleer lokalizasyon sinyali (NLS) olarak adlandırılan ve importins 2 ile bağlanan küçük bir peptid motifi içermelidir. Bu amino asit dizileri bir etiket görevi görür ve 3 , 4 bileşiminde çeşitlilik gösterir. Proteinler, çekirdeğin, exportin ile ilişkisinden dolayı sitoplazmaya ihraç edilebilirS, genellikle bir nükleer ihraç sinyali (NES) 2 olarak adlandırılan bir sinyal sekansını bağlar. Hem importins hem de exportins, küçük Ras ile ilgili nükleer protein GTPase (Ran) 2&#39;nin düzenlenmesi nedeniyle yüklerini taşıyabiliyorlar. Ran&#39;ın, GTP&#39;ye veya GSYİH&#39;ye bağlı olup olmadığına bağlı olarak farklı konformasyonel hallerde bulunduğu gösterilmiştir. GTP&#39;ye bağlandığında, Ran importins veya exportins&#39;e bağlanabilir. Exportins, RanGTP&#39;ye bağlandığında yüklerini serbest bırakırken, exportins&#39;ler ihracat kargolarıyla bir kompleks oluşturmak için RanGTP&#39;yi bağlamalıdır. Ran&#39;ın hakim nükleotid bağlanma durumu, çekirdeğin (RanGTP) veya sitoplazmanın konumuna (RanGDP) bağlıdır. Son zamanlarda, bir dizi çalışma, nükleositoplazmik yolakta ve hem amiyotrofik lateral sklerozda (ALS) hem de frontotemporal bunama (FTD) 5,6 arasındaki bozukluklar arasında bir bağlantı olduğunu göstermiştir </sup&gt; , 7,8,9,10,11,12 . ALS, hem üst hem de alt motor nöronlarını (MN) etkileyen ve sonuçta ortalama 2-5 yıl içinde felç ile sonuçlanan ilerleyici ve ölümcül nörodejeneratif bir hastalıktır. Çoğu ALS vakası, herhangi bir görünür genetik bağlantı bulunmayan sporadik (SALS) olarak sınıflandırılır, ancak% 10 dominant bir şekilde miras kalır (ailesel ALS; FALS). Son zamanlarda, kromozom 9 açık okuma çerçevesi 72 (C9orf72) genindeki hekzanükleotid tekrar genişlemeleri (HRE), ALS ve FTD&#39;nin genetik bir nedeni olarak 14 , 15 olarak tanımlandı. Bu mutantlar FALS vakalarının% 30-40&#39;ını oluşturur ve farklı çalışmalar iddia edilmiştirNükleositoplazmik taşınımı etkileyerek toksikliğe neden olduklarını, 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 . Bu çalışmalar çoğunlukla HRE&#39;lerin nükleositoplazmik nakil üzerindeki nihai sonuçlarını ve tezahürlerini göstermiştir, ancak gerçek zamanlı olarak nükleositoplazmik bozulma göstermezler. Sonuç olarak, sadece ağır nükleositoplazmik transport yetersizliği 11 , 17 , 18 olarak değerlendirildi. Bu protokol yeni ve veGerçek zamanlı olarak nükleositoplazmik transport bozukluğunu değerlendirmek ve ölçmek için hassas duyarlılık testi. Bir NLS-NES-GFP proteini (mekik-GFP) alma oranı, flüoresan mikroskobu kullanılarak gerçek zamanlı olarak nicelleştirilebilir. Bu daha önce tarif edildiği gibi bir exportin inhibitörü kullanılarak yapılır, böylece mekik-GFP&#39;nin çekirdeğe girmesine izin verir. Floresan mikroskopi ve gerçek zamanlı olarak flöresan değişiklikleri nicelikli bir yazılım kullanarak çekirdekte bulunan mekik-GFP&#39;nin flüoresans yoğunluğundaki kademeli değişikliklerin sayısal olarak tespit edilmesi mümkündür. Sonuç olarak, herhangi bir zamanda nükleer mekik-GFP miktarını temsil eden, flüoresan-zaman ekseninin bir Michaelis-Menten benzeri doyum eğrisi yapılabilir. Eğrilerin başlangıçtaki doğrusal oranını kullanarak, flüoresans doygunluğundan önce çekirdeğe girme oranını temsil eden bir eğim oluşturmak mümkündür. Deneyi doğrulamak için, tercüme etmekDaha önce nükleositoplazmik taşınmayı kesintiye uğrattığı bildirilen poli (GR) ve poli (PR) C9orf72 dipeptide tekrarlar 5 , 7 , 8 , 10 , 12 kullanıldı. Bu tahlil kullanılarak, kontrole kıyasla nükleer ithalat oranında% 50&#39;lik bir düşüş gözlendi. Bu sistemi kullanarak, nükleositoplazmik taşınımdaki dakika değişiklikleri incelenebilir. Dahası, farklı faktörlerin bir nükleositoplazmik nakil defekti kurtarma kabiliyeti belirlenebilir.

<table><tbody><tr><td>Mouse Motor Neuron-Like hybrid Cell Line (NSC-34)</td><td>tebu-bio</td><td>CLU140-A</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 4.5 g/L L-glucose</td><td>Biological Industries</td><td>01-055-1A</td><td></td></tr><tr><td>FBS European Grade</td><td>Biological Industries</td><td>04-007-1A</td><td></td></tr><tr><td>SL 16R Centrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004030</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Forma Series ii Water Jacketed CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Incubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>3111</td><td></td></tr><tr><td>Cover glass 12 mm dia., 0.13-0.17 mm thick</td><td>Bar Naor LTD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TurboFect Transfection Reagent</td><td>Thermo Scientific</td><td>&lt;a href=&quot;https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/R0531&quot;&gt;R0531&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Axiovert 100 inverted microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaging Workbench 2</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leptomycin B</td><td>Sigma</td><td>L2913</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Biological Industries</td><td>02-023-1A</td><td></td></tr><tr><td>Homogenizer motor/control/chuck/90 degree clamp</td><td>Glas-Col</td><td>099C K5424CE</td><td></td></tr><tr><td>MicroCL 17R Centrifuge, Refrigerated</td><td>Thermo Scientific</td><td>75002455</td><td></td></tr></tbody></table>

assay to measure nucleocytoplasmic transport in real time within motor neuron-like nsc-34 cells

Nükleositoplazmik nakil, büyük moleküllerin hücre çekirdeğinden ithalatı ve ihracını ifade eder. Yakın geçmişte, bir dizi çalışma amyotrofik lateral skleroz (ALS) ile nükleositoplazmik yolakta bozulmalar arasında bir bağlantı olduğunu göstermiştir. ALS motor nöronları etkileyen nörodejeneratif bir hastalıktır ve sonuçta ortalama 2-5 yıl içinde felç ile sonuçlanır ve ölümle sonuçlanır. Çoğu ALS olgusu, herhangi bir görünür genetik bağlantıdan yoksun, dağınıktır, ancak% 10 hakim bir şekilde kalıtsaldır. Yakın zamanda, kromozom 9 açık okuma çerçevesi 72 (C9orf72) genindeki hekzanükleotid tekrar genişlemesi (HRE), ALS ve frontotemporal bunama (FTD) genetik bir nedeni olarak tanımlandı. Önemli olarak, farklı gruplar yakın zamanda, bu mutantların nükleositoplazmik taşınımı etkilediğini önermişlerdir. Bu çalışmalar çoğunlukla HRE&#39;lerin nükleositoplazmik nakil üzerinde nihai sonucu ve tezahür göstermiştir ancak bunlar nükleer transport bozukluğunu göstermemektedirgerçek zaman. Sonuç olarak, çoğunlukla yüksek aşırı ekspresyon veya eksojen protein yerleştirilmesinden dolayı ciddi nükleositoplazmik ulaşım eksikliği saptanabilir. Bu protokol, nükleositoplazmik transport bozukluğunun gerçek zamanlı olarak değerlendirilmesi ve nicelleştirilmesi için yeni ve çok hassas bir tahlil tarif etmektedir. Bir NLS-NES-GFP proteini (mekik-GFP) alma oranı, flüoresan mikroskobu kullanılarak gerçek zamanlı olarak nicelleştirilebilir. Bu bir exportin inhibitörü kullanılarak gerçekleştirilir, böylece GFP&#39;nin mekik içine girmesine izin verilir. Tahlilin geçerliliği için, C9orf72 HRE, daha önce nükleositoplazmik taşınmayı bozduğu gösterilen, poli (GR) ve poli (PR) dipeptid tekrarlarını çevirmiştir. Tanımlanan tahlil kullanılarak, kontrole kıyasla nükleer ithalat oranında% 50&#39;lik bir düşüş gözlendi. Bu sistemi kullanarak, nükleositoplazmik taşınımdaki küçük değişiklikler incelenebilir ve farklı faktörlerin bir nükleositoplazmik tr&#39;ini (kısmen bile) kurtarma yeteneği incelenebilirAnsport defekti belirlenebilir.

Burada sunulan prosedürü kullanarak, motor nöron benzeri NSC-34 hücreleri bir NLS-NES-GFP (mekik-GFP) proteini ile transfekte edildi. NLS ve NES sinyal sekanslarına sahip olan bu protein ( Şekil 1 ), çekirdek ve sitoplazma arasında dolaşım yapabilir. Jenerik GFP, difüzyon yoluyla herhangi bir lokalizasyon sinyal etiketinin yokluğunda çekirdeğe girebilir veya çekilebilir ve dolayısıyla çekirdek ile sitoplazma arasında eşit olarak dağıtılır ( Şekil 2A ). Bunun aksine, mekik-GFP proteini çoğunlukla sitoplazmada, dağılımını etkileyen NES ve NLS sinyali nedeniyle bulunur ( Şekil 2B ). Böylece, sadece protein ihracatını inhibe eden exportin inhibitörü leptomycin B (LMB) ilavesi, mekik-GFP&#39;nin çekirdeğe biriktirilmesine ve en sonunda mekik-GFP ithalat oranının ölçülmesine izin verir ( Şekil 2C ). Bir floresan mikroskop kullanarak<html> Floresan değişiklikleri gerçek zamanlı olarak ölçmek için ftware, mekik-GFP&#39;nin nükleer flüoresans yoğunluğundaki kademeli değişiklikler nicelenebilir. Sonuç olarak, herhangi bir zamanda nükleer mekik-GFP miktarını temsil eden, flüoresans zaman zaman ekseni ( Şekil 3 ) bir Michaelis-Menten benzeri doyma eğrisi üretilebilir. Eğrilerin başlangıçtaki doğrusal oranını kullanarak ( Şekil 3&#39;deki daire ile gösterildiği gibi) flüoresan doyumundan önce çekirdeğe giriş hızını temsil eden bir eğim oluşturulabilir. Çeşitli çalışmalar, farklı C9orf72 proteinlerinin Drosophila melanogaster modellerinde ve / veya kültürlenmiş hücrelerde 6 , 11 zehirli olduğunu göstermektedir . Mutasyon geçirmiş C9orf72 geninde HRE&#39;lerden üretilen di-peptid tekrarları (DPR&#39;ler), poli (PR) ve poli (GR) nükleoler stres 8&#39;i indüklediği bulunmuştur ,Lass = &quot;xref&quot;&gt; 19 , 20 ve nükleositoplazmik bozukluğun engellenmesi ile ilişkilendirildi ve onları özellikle zararlı görünmelerini sağladı. Tanımlanan deneyin faydasını doğrulamak için, motor nöron benzeri NSC-34 hücreleri, bu iki DPR plazmiti poli (PR) ve poli (GR) ile transfekte edildi. Poli (PR) ve poli (GR) DPR&#39;ler de GFP&#39;ye konjuge edildiğinden, DPR&#39;lerin leptomisin-B&#39;den de etkilenmediğini doğrulamak önemlidir ve bu da sahte pozitif sonuçlara neden olur. Poli (PR) ekspresyonu nükleusta tamamen inklüzyon olarak gözlendi; Dolayısıyla, yanlış pozitif bir nükleer ithalat sinyali veremedi ( Şekil 4A ). Öte yandan, poli (GR) ekspresyonu, sitozolde homojen olarak ve çekirdeği kapanımlar olarak görüldü ( Şekil 4B ). NSC-34 hücrelerini yalnızca poli (GR) ile transfekte edip leptomisin-B ekleyince eksprese edilen poli (GR) mekik hareketi gözlenmedi ( Şekil 5 ). <p class=Mekik-GFP&#39;nin nükleositoplazmik nakil oranını analiz ederek, NSC-34 hücrelerinin poli (PR) veya poli (GR) DPR&#39;leri birlikte eksprese ettiği bulunmuştur , Kontrol olarak boş bir plazmitle transfekte edilen hücrelere nazaran nükleer ithalat oranının yaklaşık% 50 oranında azaldığını göstermektedir ( Şekil 5 ). <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/55676/55676fig1.jpg" /> Şekil 1: NLS-NES-GFP (mekik-GFP) yapısının şematik. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55676/55676fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/55676/55676fig2.jpg" /> Şekil 2: Leptomisin B, mekik-GFP&#39;nin NSC-34 hücrelerinden çekilmesini engelliyor. NSC-34 hücrelerinin temsili görüntüsü exp( B ) önce ve 10 ng / mL Leptomisin B (LMB) ( C ) ilavesinden 20 dakika sonra jenerik GFP ( A ) veya mekik-GFP proteinini içermektedir. LMB ilavesinin ardından, mekik-GFP çekirdeğe girer, ancak sitoplazma geri dönüşü engellenir. Böylece, mekik-GFP çekirdeklerde birikir. Ölçek çubuğu = 15 μm. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55676/55676fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/55676/55676fig3.jpg" /> Şekil 3: Nükleer flüoresansında bir artış gösteren Michaelis-Menten benzeri arsa. Temsilci Michaelis-Menten&#39;e benzer eğriler, iki grubun nükleer flüoresansında bir artış gösterdi, etkilenen ve etkilenmeyen nükleositoplazmik nakil hücreleri, 25 dakika içinde. Başlangıçtaki 5 dakika, artan oranda yüksek bir fark gösteriyor;Zamanla katlandı. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55676/55676fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/55676/55676fig4.jpg" /> Şekil 4: NSC-34 hücrelerinde C9orf72 DPR poli (PR) ve poli (GR) ekspresyonu. C9orf72 DPR&#39;leri, poli (GR) ( A ) ve poli (PR) ( B ) ile transfekte edilen NSC-34 hücrelerinin temsili görüntüleri. Poli (GR) hücrelerin çekirdeklerinde eksprese edilir ancak aynı zamanda sitozolda homojen olarak dağıtılır. Poli (PR) ağırlıklı olarak çekirdeklerde ifade edilir. Ölçek çubuğu = 30 μm. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55676/55676fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5" src="/files/ftp_upload/55676/55676fig5.jpg" /><br/&gt; Şekil 5: Poli (PR) ve poli (GR) C9orf72 DPR&#39;leri, NSC-34 hücrelerinde nükleer ithalat oranını kuvvetle inhibe eder. Motor nöron benzeri NSC-34 hücreleri boş bir plazmid, poli (PR) veya poli (GR) ile birlikte mekik-GFP ile birlikte transfekte edildi. Nükleer ithalat oranı, eğrinin V max&#39;daki başlangıç ​​doğrusal oranı eğimi olarak tanımlandı . Boş plasmidle elde edilen nakil oranı% 100 olarak tanımlandı. Poli (PR) ve poli (GR) ile birlikte transfeksiyon, taşınım oranını kontrol ile karşılaştırıldığında yaklaşık% 50 inhibe etti. Kantitatif analiz, tek yönlü ANOVA kullanılarak üç ila beş bağımsız deney üzerinde gerçekleştirildi. **** p &lt;0.0001; *** p &lt;0.001. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55676/55676fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Assay to Measure Nucleocytoplasmic Transport in Real Time within Motor Neuron-like NSC-34 Cells at JoVE.com

Assay to Measure Nucleocytoplasmic Transport in Real Time within Motor Neuron-like NSC-34 Cells

Bu protokol, bir NLS-NES-GFP proteininin nükleer ithalatında gerçek zamanlı değişikliği niceleyerek motor nöron benzeri NSC-34 hücrelerindeki nükleositoplazmik taşınım oranını duyarlı bir şekilde ölçmek için bir yöntem açıklamaktadır.

Motor Nöron benzeri NSC-34 Hücrelerinde Gerçek Zamanlı Nükleositoplazmik Taşınımı Ölçüm Testi

Nucleocytoplasmic transport refers to the import and export of large molecules from the cell nucleus. Recently, a number of studies have shown a ...

assay-to-measure-nucleocytoplasmic-transport-real-time-within-motor

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.6K Görüntüleme.  Ben-Gurion University of the Negev.  Bu protokol, bir NLS-NES-GFP proteininin nükleer ithalatında gerçek zamanlı değişikliği niceleyerek motor nöron benzeri NSC-34 hücrelerindeki nükleositoplazmik taşınım oranını duyarlı bir şekilde ölçmek için bir yöntem açıklamaktadır. 

Video: Assay to Measure Nucleocytoplasmic Transport in Real Time within Motor Neuron-like NSC-34 Cells

Nucleofection of Rodent Neuroblasts to Study Neuroblast Migration In vitro

The subventricular zone (SVZ) located in the lateral wall of the lateral ventricles plays a fundamental role in adult neurogenesis. In this restricted area of the brain, neural stem cells proliferate and constantly generate neuroblasts that migrate tangentially in chains along the rostral migratory stream (RMS) to reach the olfactory bulb (OB). Once in the OB, neuroblasts switch to radial migration and then differentiate into mature neurons able to incorporate into the preexisting neuronal network. Proper neuroblast migration is a fundamental step in neurogenesis, ensuring the correct functional maturation of newborn neurons. Given the ability of SVZ-derived neuroblasts to target injured areas in the brain, investigating the intracellular mechanisms underlying their motility will not only enhance the understanding of neurogenesis but may also promote the development of neuroregenerative strategies.
This manuscript describes a detailed protocol for the transfection of primary rodent RMS postnatal neuroblasts and the analysis of their motility using a 3D in vitro migration assay recapitulating their mode of migration observed in vivo. Both rat and mouse neuroblasts can be quickly and efficiently transfected via nucleofection with either plasmid DNA, small hairpin (sh)RNA or short interfering (si)RNA oligos targeting genes of interest. To analyze migration, nucleofected cells are reaggregated in &#39;hanging drops&#39; and subsequently embedded in a three-dimensional matrix. Nucleofection per se does not significantly impair the migration of neuroblasts. Pharmacological treatment of nucleofected and reaggregated neuroblasts can also be performed to study the role of signaling pathways involved in neuroblast migration.

Nucleofection of Rodent Neuroblasts to Study Neuroblast Migration In vitro

Neuroblast migration is a crucial step in postnatal neurogenesis. The protocol described here can be used to investigate the role of candidate regulators of neuroblast migration by employing DNA/small hairpin RNA (shRNA) nucleofection and a 3D migration assay with neuroblasts isolated from the rodent postnatal rostral migratory stream.

Kemirgen neuroblasts nucleofection Neuroblast Göç Eğitim için<em&gt; In vitro</em

The subventricular zone (SVZ) located in the lateral wall of the lateral ventricles plays a fundamental role in adult neurogenesis. In this restricted ...

Nörobilim

A High Content Imaging Assay for Identification of Botulinum Neurotoxin Inhibitors

Synaptosomal-associated protein-25 (SNAP-25) is a component of the soluble NSF attachment protein receptor (SNARE) complex that is essential for synaptic neurotransmitter release. Botulinum neurotoxin serotype A (BoNT/A) is a zinc metalloprotease that blocks exocytosis of neurotransmitter by cleaving the SNAP-25 component of the SNARE complex. Currently there are no licensed medicines to treat BoNT/A poisoning after internalization of the toxin by motor neurons. The development of effective therapeutic measures to counter BoNT/A intoxication has been limited, due in part to the lack of robust high-throughput assays for screening small molecule libraries. Here we describe a high content imaging (HCI) assay with utility for identification of BoNT/A inhibitors. Initial optimization efforts focused on improving the reproducibility of inter-plate results across multiple, independent experiments. Automation of immunostaining, image acquisition, and image analysis were found to increase assay consistency and minimize variability while enabling the multiparameter evaluation of experimental compounds in a murine motor neuron system.

Botulinum neurotoxin is one of the most potent toxins among Category-A biothreat agents, yet a post-exposure therapeutic is not available. The high content imaging approach is a powerful methodology for identifying novel inhibitors as it enables multiparameter screening using biologically relevant motor neurons, the primary target of this toxin.

Botulinum nörotoksininin önleyicilerinin tanımlanmasına daha yüksek bir miktarda Görüntüleme Deneyi

Synaptosomal-associated protein-25 (SNAP-25) is a component of the soluble NSF attachment protein receptor (SNARE) complex that is essential for synaptic ...

Single-Molecule Imaging of Nuclear Transport

The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the last decade. The investigation of molecular interactions with high temporal and spatial resolutions deep within cells has remained challenging due to the inherently weak signals arising from individual molecules. Recent works by Yang et al. demonstrated that narrow-field epifluorescence microscopy allows visualization of nucleocytoplasmic transport at the single molecule level. By the single molecule approach, important kinetics, such as nuclear transport time and efficiency, for signal-dependent and independent cargo molecules have been obtained. Here we described a protocol for the methodological approach with an improved spatiotemporal resolution of 0.4 ms and 12 nm. The improved resolution enabled us to capture transient active transport and passive diffusion events through the nuclear pore complexes (NPC) in semi-intact cells. We expect this method to be used in elucidating other binding and trafficking events within cells.

Single molecule microscopy approch provided novel insights into nuclear transport.

Tek Molekül Görüntüleme Nükleer Ulaştırma

The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the ...

Biyoloji

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, survival, and glial communications. To date, numerous studies have reported that defects in these systems cause various neuronal diseases. Thus, understanding the mechanisms underlying vesicle dynamics may provide influential clues that could aid in the treatment of several neuronal disorders. Here, we describe a method for quantifying vesicle motilities, such as motility distance and rate of movement, using a software plug-in for the ImageJ platform. To obtain images for quantification, we labeled neuronal endosome-lysosome structures with EGFP-tagged vesicle marker proteins and observed the movement of vesicles using a time-lapse microscopy. This method is highly useful and simplify measuring vesicle motility in neurites, such as axons and dendrites, as well as in the soma of both neurons and glial cells. Furthermore, this method can be applied to other cell lines, such as fibroblasts and endothelial cells. This approach could provide a valuable advancement of our understanding of membrane trafficking.

The investigation of membrane trafficking is crucial for understanding neuronal functions. Here, we introduce a method for quantifying vesicle motility in neurons. This is a convenient method that can be adapted to the quantification of membrane trafficking in the nervous system.

Floresan Probları Kullanan Kültürlü Nöronlarda Endozom ve Lizozom Hareketlerinin Nicelendirilmesi

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...

A High-content Assay for Monitoring AMPA Receptor Trafficking

Postsynaptic trafficking of receptors to and from the cell surface is an important mechanism by which neurons modulate their responsiveness to different stimuli. The &#945;-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid (AMPA) receptors, which are responsible for fast excitatory synaptic transmission in neurons, are trafficked to and from the postsynaptic surface to dynamically alter neuronal excitability. AMPA receptor trafficking is essential for synaptic plasticity and can be disrupted in neurological disease. However, prevalent approaches for quantifying receptor trafficking ignore entire receptor pools, are overly time- and labor-intensive, or potentially disrupt normal trafficking mechanisms and therefore complicate the interpretation of resulting data. We present a high-content assay for the quantification of both surface and internal AMPA receptor populations in cultured primary hippocampal neurons using dual fluorescent immunolabeling and a near-infrared fluorescent 96-well microplate scanner. This approach facilitates the rapid screening of bulk internalized and surface receptor densities while minimizing sample material. However, our method has limitations in obtaining single-cell resolution or conducting live cell imaging. Finally, this protocol may be amenable to other receptors and different cell types, provided proper adjustments and optimization.

Neuronal excitability can be modulated through a dynamic process of endo- and exocytosis of excitatory ionotropic glutamate receptors. Described here is an accessible, high-content assay for quantifying surface and internal receptor population pools.

AMPA izlemek için bir yüksek-içerik tahlil reseptör ticareti

Postsynaptic trafficking of receptors to and from the cell surface is an important mechanism by which neurons modulate their responsiveness to different ...

Imaging and Analysis of Neurofilament Transport in Excised Mouse Tibial Nerve

Neurofilament protein polymers move along axons in the slow component of axonal transport at average speeds of ~0.35-3.5 mm/day. Until recently the study of this movement in situ was only possible using radioisotopic pulse-labeling, which permits analysis of axonal transport in whole nerves with a temporal resolution of days and a spatial resolution of millimeters. To study neurofilament transport in situ with higher temporal and spatial resolution, we developed a hThy1-paGFP-NFM transgenic mouse that expresses neurofilament protein M tagged with photoactivatable GFP in neurons. Here we describe fluorescence photoactivation pulse-escape and pulse-spread methods to analyze neurofilament transport in single myelinated axons of tibial nerves from these mice ex vivo. Isolated nerve segments are maintained on the microscope stage by perfusion with oxygenated saline and imaged by spinning disk confocal fluorescence microscopy. Violet light is used to activate the fluorescence in a short axonal window. The fluorescence in the activated and flanking regions is analyzed over time, permitting the study of neurofilament transport with temporal and spatial resolution on the order of minutes&#160;and microns, respectively. Mathematical modeling can be used to extract kinetic parameters of neurofilament transport including the velocity, directional bias and pausing behavior from the resulting data. The pulse-escape and pulse-spread methods can also be adapted to visualize neurofilament transport in other nerves. With the development of additional transgenic mice, these methods could also be used to image and analyze the axonal transport of other cytoskeletal and cytosolic proteins in axons.

We describe fluorescence photoactivation methods to analyze the axonal transport of neurofilaments in single myelinated axons of peripheral nerves from transgenic mice that express a photoactivatable neurofilament protein.

Excised Mouse Tibial Nerve Nörofilament Transport Görüntüleme ve Analizi

Neurofilament protein polymers move along axons in the slow component of axonal transport at average speeds of ~0.35-3.5 mm/day. Until recently the study ...

Nuclear Transport Assays in Permeabilized Mouse Cortical Neurons

Disruption of nucleocytoplasmic transport is increasingly implicated in the pathogenesis of neurodegenerative diseases. Moreover, there is a growing recognition of cell-specific differences in nuclear pore complex structure, prompting a need to adapt nuclear transport methods for use in neurons. Permeabilized cell assays, in which the plasma membrane is selectively perforated by digitonin, are widely used to study passive and active nuclear transport in immortalized cell lines but have not been applied to neuronal cultures. In our initial attempts, we observed the rapid loss of nuclear membrane integrity in primary mouse cortical neurons exposed to even low concentrations of digitonin. We hypothesized that neuronal nuclear membranes may be uniquely vulnerable to the loss of cytoplasmic support. After testing multiple approaches to improve nuclear stability, we observed optimal nuclear integrity following hypotonic lysis in the presence of a concentrated bovine serum albumin cushion. Neuronal nuclei prepared by this approach reliably import recombinant fluorescent cargo in an energy-dependent manner, facilitating analysis of nuclear import by high content microscopy with automated analysis. We anticipate that this method will be broadly applicable to studies of passive and active nuclear transport in primary neurons.

We have developed a reliable method of selective plasma membrane permeabilization of primary mouse cortical neurons for high content automated analysis of neuronal nucleocytoplasmic transport.

Disruption of nucleocytoplasmic transport is increasingly implicated in the pathogenesis of neurodegenerative diseases. Moreover, there is a growing ...

Real-Time Fluorescent Measurement of Synaptic Functions in Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis

Before neuronal degeneration, the cause of motor and cognitive deficits in patients with amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and/or frontotemporal lobe dementia (FTLD) is dysfunction of communication between neurons and motor neurons and muscle. The underlying process of synaptic transmission involves membrane depolarization-dependent synaptic vesicle fusion and the release of neurotransmitters into the synapse. This process occurs through localized calcium influx into the presynaptic terminals where synaptic vesicles reside. Here, the protocol describes fluorescence-based live-imaging methodologies that reliably report depolarization-mediated synaptic vesicle exocytosis and presynaptic terminal calcium influx dynamics in cultured neurons.
Using a styryl dye that is incorporated into synaptic vesicle membranes, the synaptic vesicle release is elucidated. On the other hand, to study calcium entry, Gcamp6m is used, a genetically encoded fluorescent reporter. We employ high potassium chloride-mediated depolarization to mimic neuronal activity. To quantify synaptic vesicle exocytosis unambiguously, we measure the loss of normalized styryl dye fluorescence as a function of time. Under similar stimulation conditions, in the case of calcium influx, Gcamp6m fluorescence increases. Normalization and quantification of this fluorescence change are performed in a similar manner to the styryl dye protocol. These methods can be multiplexed with transfection-based overexpression of fluorescently tagged mutant proteins. These protocols have been extensively used to study synaptic dysfunction in models of FUS-ALS and C9ORF72-ALS, utilizing primary rodent cortical and motor neurons. These protocols easily allow for rapid screening of compounds that may improve neuronal communication. As such, these methods are valuable not only for the study of ALS but for all areas of neurodegenerative and developmental neuroscience research.

Two related methods are described to visualize subcellular events required for synaptic transmission. These protocols enable the real-time monitoring of the dynamics of presynaptic calcium influx and synaptic vesicle membrane fusion using live-cell imaging of in vitro cultured neurons.

Amiyotrofik Lateral Skleroz Modellerinde Sinaptik Fonksiyonların Gerçek Zamanlı Floresan Ölçümü

Before neuronal degeneration, the cause of motor and cognitive deficits in patients with amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and/or frontotemporal lobe ...

Expanding the Toolkit for In Vivo Imaging of Axonal Transport

Axonal transport maintains neuronal homeostasis by enabling the bidirectional trafficking of diverse organelles and cargoes. Disruptions in axonal transport have devastating consequences for individual neurons and their networks, and contribute to a plethora of neurological disorders. As many of these conditions involve both cell autonomous and non-autonomous mechanisms, and often display a spectrum of pathology across neuronal subtypes, methods to accurately identify and analyze neuronal subsets are imperative.
This paper details protocols to assess in vivo axonal transport of signaling endosomes and mitochondria in sciatic nerves of anesthetized mice. Stepwise instructions are provided to 1) distinguish motor from sensory neurons in vivo, in situ, and ex vivo by using mice that selectively express fluorescent proteins within cholinergic motor neurons; and 2) separately or concurrently assess in vivo axonal transport of signaling endosomes and mitochondria. These complementary intravital approaches facilitate the simultaneous imaging of different cargoes in distinct peripheral nerve axons to quantitatively monitor axonal transport in health and disease.

Expanding the Toolkit for In Vivo Imaging of Axonal Transport

Using transgenic fluorescent mice, detailed protocols are described to assess in vivo axonal transport of signaling endosomes and mitochondria within motor and sensory axons of the intact sciatic nerve in live animals.

Aksonal Taşımacılığın In Vivo Görüntülemesi için Araç Kitinin Genişletilmesi

Axonal transport maintains neuronal homeostasis by enabling the bidirectional trafficking of diverse organelles and cargoes. Disruptions in axonal ...

Measuring Axonal Cargo Transport in Mouse Primary Cortical Cultured Neurons

Neuronal cells are highly polarized cells that stereotypically harbor several dendrites and an axon. The length of an axon necessitates efficient bidirectional transport by motor proteins. Various reports have suggested that defects in axonal transport are associated with neurodegenerative diseases. Also, the mechanism of the coordination of multiple motor proteins has been an attractive topic. Since the axon has uni-directional microtubules, it is easier to determine which motor proteins are involved in the movement. Therefore, understanding the mechanisms underlying the transport of axonal cargo is crucial for uncovering the molecular mechanism of neurodegenerative diseases and the regulation of motor proteins. Here, we introduce the entire process of axonal transport analysis, including the culturing of mouse primary cortical neurons, transfection of plasmids encoding cargo proteins, and directional and velocity analyses without the effect of pauses. Furthermore, the open-access software "KYMOMAKER" is introduced, which enables the generation of a kymograph to highlight transport traces according to their direction and allow easier visualization of axonal transport.

The present protocol describes the whole procedure of analysis for axonal transport. In particular, the calculation of transport velocity, not including the pausing, and the visualization method using open-access software "KYMOMAKER" are shown here.