Damos las gracias a todos los miembros del laboratorio de AI por sus útiles comentarios y sugerencias. Nos gustaría agradecer al Prof. Mark Hipp (Instituto Max Planck de Bioquímica) por brindarnos el vector shuttle-GFP. Este trabajo fue apoyado por las concesiones de la fundación israelí de la ciencia (ISF # 124/14), de la fundación binacional de la ciencia (BSF # 2013325), de la concesión de la integración de carrera de Marie Curie FP7 (CIG # 333794), y del instituto nacional para Psychobiology en Israel NIPI # b133 - 14/15).

1. Preparación de la Línea Celular <ol><li> Descongele aproximadamente 1.000.000 de células de médula espinal de neuroblastoma de ratón (células NSC-34) que se almacenaron en un recipiente de nitrógeno líquido. Utilice una incubadora de agua a 37 ° C hasta que las células estén completamente descongeladas. </li><li> Se añade medio fresco y caliente (medio DMEM que contiene 10% de suero bovino fetal (FBS), 1% de L-glutamina y 1% de antibióticos pen-strep). </li><li> Centrifugar las células descongeladas (SL16R) a 500 xg durante 5 min, formando un sedimento celular. Deseche el medio y agregue 1 ml de nuevo medio para la resuspensión celular. </li><li> Coloque las células resuspendidas en un matraz de 15 mL y agregue 5 mL adicionales de medio. Incubar las células durante la noche en una incubadora estéril con 5% de CO 2 a 37 ° C. </li><li> En paralelo, colocar 8 cubreobjetos sin recubrimiento (cubrir el vidrio: 12 mm, 0,13-0,17 mm de espesor) en un plato de cultivo de 60 mm y esterilizar con etanol al 70% y la exposición a 30 minutos de luz UV hasta que esté seco. Agregue el medio a cada plato y disponga para lavar el etanol residual.</li><li> Se añaden tampón de tripsina (2,5 g de tripsina y 0,2 g de EDTA en 1 l de solución balanceada de sal de Hanks) a las células después de alcanzar aproximadamente el 90% de confluencia (aproximadamente 6 millones de células por matraz) para permitir que las células adherentes se disocien. NOTA: Las células NSC-34 son sensibles y sólo requieren 15 s de incubación con tampón de tripsina y 1 min adicional de incubación libre de tripsina antes de la disociación utilizando el medio. </li><li> Se colocan las células sobre las placas de cultivo de 60 mm que ya contienen los cubreobjetos con 3 ml de medio, aproximadamente 350.000 por placa. Dejarlos en la incubadora durante 24 h para permitir la fijación de células en los cubreobjetos. </li></ol> 2. Transfección celular NOTA: Después de aproximadamente 24 h, las células NSC-34 alcanzarán una confluencia del 40% (aproximadamente 800.000 células) y estarán listas para la transfección. <ol><li> Preparar medio DMEM puro (300 μL de medio DMEM para cada recipiente de cultivo de 60 mm) en una cuba de microcentrífuga estérilEs </li><li> Añadir 2 μg de cada plásmido requerido para la transfección a cada tubo de microcentrífuga que contenga DMEM. NOTA: El plásmido shuttle-GFP es obligatorio en todas las transfecciones celulares. </li><li> Agregue el reactivo de transfección a todos los tubos de microcentrífuga que contengan los plásmidos requeridos. A continuación, añadir 4 μl del reactivo de transfección comercial para cada 2 μg de ADN. </li><li> Vórtice los tubos de microcentrífuga que contienen DMEM, plásmidos y el reactivo de transfección y se incuban a temperatura ambiente durante 25 min. </li><li> Añadir cada tubo de microcentrífuga a un plato de cultivo y agitar suavemente el plato para formar una solución homogénea. Coloque el plato de nuevo en la incubadora durante 48 h. NOTA: Dado que la GFP de lanzadera debe expresarse en todas las células, la eficiencia de transfección de GFP-lanzadera se puede examinar parcialmente y pre-probar usando microscopía fluorescente después de una transfección durante la noche. Se puede realizar un examen completo de proteínas expresadas no fluorescentes usando un análisis de inmunotransferenciaes. </li></ol> 3. Microscopía <ol><li> Fijar los cubreobjetos que contienen las células NSC-34 transfectadas a un porta-cubreobjetos y lavar suavemente con solución salina tamponada con fosfato (PBS) para eliminar las células muertas separadas. </li><li> Identificar un parche celular adecuado utilizando un filtro fluorescente verde con un microscopio invertido. NOTA: Se define un parche celular adecuado como un campo de visión de microscopio que muestra un gran número de células (20 - 30 células en un campo) y en las que los núcleos están claramente definidos en las células. Los núcleos celulares dentro del parche celular se identifican primero por el ojo y son marcados manualmente por el software de formación de imágenes. </li><li> Añadir 200 μl de un inhibidor de la exportación-1 de leptomicina B (LMB) conteniendo 10 ng / mL de LMB en PBS a los cubreobjetos por goteo del búfer en los cubreobjetos bajo el microscopio. NOTA: Este punto en el tiempo se establece como intervalo cero. </li><li> Cuantificar la intensidad fluorescente de los núcleos marcados en intervalos de 3 s por alrededor de 400-500 s. </li><li&gt; Prueba entre 3 y 5 portadas para cada grupo de transfección en cada experimento individual. </li></ol> 4. Análisis NOTA: Dado que diferentes células expresan diferentes niveles de transferencia flotante-GFP, es importante normalizar la intensidad fluorescente nuclear de cada célula a su propia intensidad fluorescente inicial. <ol><li> Normalizar la intensidad fluorescente de los núcleos marcados dividiendo el intervalo fluorescente de 3 de cada núcleo con el promedio de los seis intervalos iniciales de ese núcleo. </li><li> Después de la normalización de cada núcleo, producir una curva de intensidad fluorescente que representa el cambio en los núcleos de fluorescencia en función del tiempo para cada parche celular. Para ello, calcule el promedio de todas las células de cada parche celular (que consta de aproximadamente 20 a 30 células en cada parche). NOTA: La curva de intensidad de fluorescencia de los núcleos se asemeja a una curva de saturación de Michaelis-Menten, la cual se observa mejor dentro de tiMe períodos. Esto se debe a una disminución de las cantidades citosólicas de la lanzadera-GFP con el tiempo debido al transporte nuclear. Esta disminución disminuye estadísticamente la probabilidad de que un transbordador-GFP se transporte al núcleo, alcanzando así la saturación en la fluorescencia nuclear. La pendiente derivada de la tasa inicial lineal de la curva produce la velocidad de entrada de Vmax en el núcleo. </li><li> Analizar las pendientes de Vmax de cada parche celular, derivadas de tres a cinco experimentos independientes, utilizando el software de representación gráfica para producir una pendiente que representa cada grupo experimental. Realizar la cuantificación mediante análisis estadístico ANOVA unidireccional. </li></ol> 5. Validación de la expresión de la proteína <ol><li> Se colocan placas de cultivo de 60 mm que contienen las células residuales (no usadas en el experimento anterior) de cada grupo experimental sobre hielo. </li><li> Desechar el medio y lavar las células dos veces con PBS para diluir y lavar el medio restante. </li><li> Tratar las células con 200-400 Mu l de tampón de lisis que contiene PBS, 0,5% de Triton y comprimido de coctel de inhibidor de proteasa (PI). Raspe con un rascador de celdas. </li><li> Recoger las células en tampón de lisis en un tubo de microcentrífuga y homogeneizar con un homogeneizador a 4.000 rpm durante 1 min bajo hielo. </li><li> Centrifugar las células homogeneizadas a 2.500 xg durante 10 min. Recoger el sobrenadante, cuantificar la concentración de proteína usando un ensayo de Bradford, y almacenar hasta su uso a -20 ° C. </li><li> Recoger entre 30 y 70 μ g de proteína total (dependiendo de la proteína) y cargar en un SDS-PAGE gel para probar la expresión de proteínas utilizando un inmunoblot ensayo. </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Este protocolo demuestra un nuevo ensayo altamente sensible y cuantitativo para evaluar cambios minuciosos en el transporte nucleocitoplasmático. Utilizando este sistema, es posible observar y medir el transporte nucleocitoplasmático y su disfunción en tiempo real, no sólo grandes defectos que resultan en cambios dramáticos en la distribución de proteínas. Este ensayo no sólo tiene una ventaja de sensibilidad, sino que también requiere poca preparación, es barato y es un ensayo muy fácil y de bajo compromiso. Para probar la eficacia de este sistema, se utilizaron proteínas C9orf72, DPRs poli (GR) y poli (PR), modelos de ALS y FTD que se demostraron anteriormente como causantes de una deficiencia de transporte nucleocitoplasmático 5 , 7 , 8 , 10 , 12 . Utilizando este ensayo, fue posible demostrar, en tiempo real, una disminución de aproximadamente el 50% en elNuclear en las células que expresan los DPR en comparación con las células transfectadas con un vector de control. Por lo tanto, este sistema abre la posibilidad de medir fácilmente pequeños cambios en el transporte nucleocitoplasmático, que pueden ser causados ​​por estos y otros mutantes ALS o FTD u otras enfermedades en las que pueden existir defectos potenciales en el transporte nucleocitoplasmático. Aunque el protocolo descrito aquí se refiere a neuronas motoras como las células, podría ser fácilmente adaptado a otros tipos de células. Lo que es más importante, utilizando este sistema, ahora es posible determinar cómo diferentes factores moleculares o fármacos pueden ayudar a prevenir o rescatar (incluso parcialmente) deficiencias de transporte nucleocitoplasmático en ALS, FTD u otros trastornos. Una limitación posible en el uso de este ensayo es la capacidad limitada de observar y marcar los núcleos celulares en células que no poseen un núcleo claro o que poseen un núcleo muy pequeño. Para superar esto, una posible solución puede ser simplemente utilizar un mayor magnífico<html> Ción. Sin embargo, esto finalmente disminuirá la cantidad de células en cada parche celular, aumentando así la cantidad de experimentos necesarios para alcanzar un valor significativo. Otra consideración se refiere a la relación de nucleo-citoplasma de lanzadera-GFP antes de la adición de LMB. Esta relación puede ser muy diferente en diferentes tipos de células y, en consecuencia, puede ser demasiado pequeña (cerca de una relación 1: 1) para mostrar un núcleo visible. Una posible solución es usar un marcador nuclear de antemano. Esto no afectará al análisis final, ya que cada célula se normaliza a su fluorescencia nuclear original. Además, se recomienda calibrar la concentración de LMB utilizada para la inhibición de la exportación antes de realizar este ensayo para observar eficazmente el aumento óptimo de la fluorescencia nuclear. Se sugiere que la deficiencia de transporte nucleocitoplasmático desempeñe un papel principal en la degeneración de las neuronas motoras en la ELA 5 ,= &quot;Xref&quot;&gt; 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 . Si este es el caso, los defectos de transporte nucleocitoplasmático similares a los observados en el modelo C9orf72 se prevé que juegan un papel en otros modelos de ALS. Sin embargo, debido a la gran variabilidad entre los diferentes modelos, los resultados finales y las manifestaciones moleculares resultantes de la disrupción nucleocitoplasmática en cada caso pueden ser desapercibidos o fenotípicamente diferentes. A pesar de la extensa investigación sobre diferentes modelos FALS, su vinculación con mecanismos comunes sigue siendo un desafío. Este ensayo puede proporcionar ahora la oportunidad de superar, al menos parcialmente, este desafío.

El complejo de poros nucleares (NPC) controla la importación y exportación de moléculas grandes dentro y fuera del núcleo celular. En contraste con las moléculas pequeñas, que pueden entrar en el núcleo sin la regulación 1 , el transporte de moléculas más grandes es fuertemente controlado por el NPC. Estas moléculas grandes, como las proteínas y el ARN, se asocian con factores de transporte, incluyendo importaciones y exportaciones, para ser importados y exportados desde el núcleo 2 . Para ser importados, las proteínas deben contener un pequeño motivo peptídico, generalmente llamado una señal de localización nuclear (NLS), que está limitada por importins 2 . Estas secuencias de aminoácidos actúan como una etiqueta y son diversas en la composición 3 , 4 . Las proteínas pueden ser exportadas desde el núcleo hasta el citoplasma debido a su asociación con laS, que se unen a una secuencia señal, generalmente llamada una señal de exportación nuclear (NES) 2 . Ambos importins y exportins son capaces de transportar su carga debido a la regulación de la pequeña proteína nuclear relacionada con Ras GTPase (Ran) 2 . Ran se ha demostrado que existen en diferentes estados conformacionales dependiendo de si está ligado a GTP o GDP. Cuando se vincula a GTP, Ran puede vincular a importins o exportins. Al unirse a RanGTP, importins liberan su carga, mientras que las exportaciones deben obligar a RanGTP a formar un complejo con su carga de exportación. El estado de enlace de nucleótidos dominante de Ran depende de su ubicación en el núcleo (RanGTP) o el citoplasma (RanGDP). Recientemente, varios estudios han demostrado una conexión entre los trastornos en la vía nucleocitoplasmática y tanto la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) como la demencia frontotemporal (FTD) 5 , 6 </sup&gt; , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 . La ELA es una enfermedad neurodegenerativa progresiva y fatal que afecta tanto a las neuronas motoras superiores como inferiores (MN) 13 y resulta en parálisis y en última instancia en la muerte, en un promedio de 2-5 años. La mayoría de los casos de ELA se clasifican como esporádica (SALS), carece de cualquier vínculo genético aparente, pero el 10% se hereda de manera dominante (ALS familiar, FALS). Recientemente, se identificaron las expansiones de repetición de hexanucleótidos (HRE) en el gen de lectura abierta del cromosoma 9 72 (C9orf72) 14 , 15 como causa genética de ALS y FTD. Estos mutantes representan el 30-40% de los casos FALS 16 , y diferentes estudios han sostenidoQue causan toxicidad al afectar el transporte nucleocitoplasmático 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 . Estos estudios han mostrado en su mayoría los resultados finales y las manifestaciones de las ERH sobre el transporte nucleocitoplasmático, pero no demuestran alteración nucleocitoplasmática en tiempo real. Como resultado, sólo se ha evaluado la deficiencia severa de transporte nucleocitoplasmático 11 , 17 , 18 . Este protocolo describe una nueva y veRy para evaluar y cuantificar la disfunción del transporte nucleocitoplasmático en tiempo real. La tasa de importación de una proteína NLS-NES-GFP (shuttle-GFP) se puede cuantificar en tiempo real usando microscopía fluorescente. Esto se hace usando un inhibidor de la exportación, tal como se ha descrito anteriormente 18 , permitiendo así que la lanzadera-GFP solamente ingrese al núcleo. Utilizando microscopía fluorescente y un software capaz de cuantificar los cambios fluorescentes en tiempo real, es posible cuantificar cambios graduales en la intensidad de fluorescencia de la lanzadera-GFP, localizada en el núcleo. Como resultado, se puede hacer una curva de saturación similar a Michaelis-Menten del eje de fluorescencia a tiempo, que representa la cantidad de enlace-GFP nuclear en un momento dado. Mediante el uso de la tasa lineal inicial de las curvas, es posible generar una pendiente, que representa la tasa de entrada en el núcleo antes de la saturación de fluorescencia. Para validar el ensayo, el traductorSe utilizaron repeticiones de dipeptidos C9orf72, poli (GR) y poli (PR), que se han descrito previamente para interrumpir el transporte nucleocitoplasmático, 5 , 7 , 8 , 10 , 12 . Usando este ensayo, se observó una disminución del 50% en la tasa de importación nuclear en comparación con el control. Utilizando este sistema, se pueden examinar cambios minuciosos en el transporte nucleocitoplasmático. Además, se puede determinar la capacidad de diferentes factores para rescatar un defecto de transporte nucleocitoplasmático.

<table><tbody><tr><td>Mouse Motor Neuron-Like hybrid Cell Line (NSC-34)</td><td>tebu-bio</td><td>CLU140-A</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 4.5 g/L L-glucose</td><td>Biological Industries</td><td>01-055-1A</td><td></td></tr><tr><td>FBS European Grade</td><td>Biological Industries</td><td>04-007-1A</td><td></td></tr><tr><td>SL 16R Centrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004030</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Forma Series ii Water Jacketed CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Incubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>3111</td><td></td></tr><tr><td>Cover glass 12 mm dia., 0.13-0.17 mm thick</td><td>Bar Naor LTD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TurboFect Transfection Reagent</td><td>Thermo Scientific</td><td>&lt;a href=&quot;https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/R0531&quot;&gt;R0531&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Axiovert 100 inverted microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaging Workbench 2</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leptomycin B</td><td>Sigma</td><td>L2913</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Biological Industries</td><td>02-023-1A</td><td></td></tr><tr><td>Homogenizer motor/control/chuck/90 degree clamp</td><td>Glas-Col</td><td>099C K5424CE</td><td></td></tr><tr><td>MicroCL 17R Centrifuge, Refrigerated</td><td>Thermo Scientific</td><td>75002455</td><td></td></tr></tbody></table>

assay to measure nucleocytoplasmic transport in real time within motor neuron-like nsc-34 cells

El transporte nucleocitoplasmático se refiere a la importación y exportación de grandes moléculas del núcleo celular. Recientemente, varios estudios han demostrado una conexión entre la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) y las alteraciones en la vía nucleocitoplasmática. ALS es una enfermedad neurodegenerativa que afecta a las neuronas motoras y resulta en parálisis y en última instancia en la muerte, en 2-5 años en promedio. La mayoría de los casos de ELA son esporádicos, carecen de cualquier vínculo genético aparente, pero el 10% se hereda de manera dominante. Recientemente, se identificaron las expansiones de repetición de hexanucleótidos (HREs) en el gen del gen 72 de lectura abierta del cromosoma 9 (C9orf72) como una causa genética de ALS y demencia frontotemporal (FTD). Es importante destacar que diferentes grupos han propuesto recientemente que estos mutantes afectan el transporte nucleocitoplasmático. Estos estudios han demostrado principalmente el resultado final y las manifestaciones causadas por HREs en el transporte nucleocytoplasmic, pero no demuestran disfunción de transporte nuclear entiempo real. Como resultado, sólo se puede determinar una deficiencia severa de transporte nucleocitoplasmático, principalmente debido a una alta sobreexpresión o inserción de proteínas exógenas. Este protocolo describe un nuevo y muy sensible ensayo para evaluar y cuantificar la disfunción nucleocitoplasmática de transporte en tiempo real. La tasa de importación de una proteína NLS-NES-GFP (shuttle-GFP) se puede cuantificar en tiempo real usando microscopía fluorescente. Esto se realiza usando un inhibidor de la exportación, permitiendo así que la GFP de la lanzadera sólo entre en el núcleo. Para validar el ensayo, se usaron las repeticiones de dipéptido traducido HRE de C9orf72, poli (GR) y poli (PR), que se han mostrado anteriormente para interrumpir el transporte nucleocitoplasmático. Utilizando el ensayo descrito, se observó una disminución del 50% en la tasa de importación nuclear en comparación con el control. Usando este sistema, se pueden examinar cambios minuciosos en el transporte nucleocitoplasmático y la capacidad de diferentes factores para rescatar (incluso parcialmente)Se puede determinar el defecto de soporte.

Usando el procedimiento presentado aquí, las neuronas motrices-NSC-34 células fueron transfectadas con un NLS-NES-GFP (shuttle-GFP) de proteínas. Esta proteína, que tiene secuencias de señales NLS y NES ( Figura 1 ), puede transferirse entre el núcleo y el citoplasma. GFP genérico puede entrar o salir del núcleo en la ausencia de cualquier etiqueta de señal de localización sólo por difusión y por lo tanto, distribuido uniformemente entre el núcleo y el citoplasma ( Figura 2A ]. En contraste, la proteína GFP-lanzadera se encuentra principalmente en el citoplasma debido a la señal NES y NLS que afectan su dispersión ( Figura 2B ). Por lo tanto, sólo la adición del inhibidor de la exportación de leptomicina B (LMB), que inhibe la exportación de proteínas, permite la acumulación de la GFP transportista en el núcleo y, finalmente, para la medición de la tasa de importación transbordador-GFP ( Figura 2C ). Utilizando un microscopio fluorescente y<html> Ftware para cuantificar los cambios fluorescentes en tiempo real, los cambios graduales en la intensidad de fluorescencia nuclear de la lanzadera-GFP pueden ser cuantificados. Como resultado, se puede producir una curva de saturación de tipo Michaelis-Menten del eje de fluorescencia a tiempo ( Figura 3 ), que representa la cantidad de transbordador-GFP nuclear en un momento dado. Mediante el uso de la tasa lineal inicial de las curvas (como se indica por el círculo en la Figura 3 ), se puede generar una pendiente, que representa la velocidad de entrada en el núcleo antes de la saturación de fluorescencia. Varios estudios indican que diferentes proteínas C9orf72 son tóxicas en modelos de Drosophila melanogaster y / o células cultivadas 6 , 11 . Se descubrió que las repeticiones dipeptídicas (DPR), poli (PR) y poli (GR), producidas a partir de HRE en el gen mutado C9orf72, inducen el estrés nucleolar 8 ,Lass = &quot;xref&quot;&gt; 19 , 20 y han sido implicados en el transporte nucleocytoplasmic dañado, haciéndolos parecer especialmente dañino. Para verificar la utilidad del ensayo descrito, las células NSC-34 de tipo neurona motora se transfectaron con estos dos plásmidos DPR, poli (PR) y poli (GR). Dado que los DPR poli (PR) y poli (GR) se conjugan también con GFP, era importante validar que los DPR no estaban afectados por la leptomicina B, lo que daría como resultado un falso positivo. La expresión de poli (PR) se observó completamente en el núcleo como inclusiones; Por lo tanto, no podría dar una señal de importación nuclear falsamente positiva ( Figura 4A ). Poly (GR) expresión, por otro lado, se observó de forma homogénea en el citosol y también como inclusiones en el núcleo ( Figura 4B ]. Cuando se transfectaron células NSC-34 con poli (GR) solamente y se añadió leptomicina B, no se observó movimiento de lanzadera del poli (GR) expresado ( Figura 5 ). <p class=Analizando la velocidad de transporte nucleocitoplasmático de la GFP-lanzadera, se encontró que las células NSC-34 coexpresan los DPRs poli (PR) o poli (GR) (GR) , Mostrando una disminución de la tasa de importación nuclear de aproximadamente el 50% en comparación con las células transfectadas con un plásmido vacío como un control ( Figura 5 ]. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55676/55676fig1.jpg" /> Figura 1: Esquema de la construcción NLS-NES-GFP (shuttle-GFP). <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55676/55676fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55676/55676fig2.jpg" /> Figura 2: La leptomicina B inhibe la exportación de la GFP-lanzadera desde los núcleos de las células NSC-34. Imágenes representativas de células NSC-34 exp( B ) y 20 min después de la adición de 10 ng / mL de Leptomicina B (LMB) ( C ). Después de la adición de LMB, las importaciones de GFP en el núcleo, pero la exportación de vuelta al citoplasma se bloquea. Así, la lanzadera-GFP se acumula en los núcleos. Barra de escala = 15 μm. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55676/55676fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/55676/55676fig3.jpg" /> Figura 3: diagrama similar a Michaelis-Menten que muestra un aumento en la fluorescencia nuclear. Curvas representativas de tipo Michaelis-Menten que representan un aumento en la fluorescencia nuclear de dos grupos, células de transporte nucleocitoplasmático afectadas y no afectadas, en 25 minutos. Los 5 minutos iniciales muestran una alta diferencia en la tasa de incremento, que es deCon el tiempo. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55676/55676fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/55676/55676fig4.jpg" /> Figura 4: DPRs C9orf72 expresión poli (PR) y poli (GR) en células NSC-34. Imágenes representativas de células NSC-34 transfectadas con los DPRs C9orf72, poli (GR) ( A ) y poli (PR) ( B ). Poli (GR) se expresa en los núcleos de las células, pero también se distribuye de forma homogénea en el citosol. Poly (PR) se expresa principalmente en los núcleos. Barra de escala = 30 μm. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55676/55676fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/55676/55676fig5.jpg" /><brFigura 5: Los DPRs de C9orf72, poli (PR) y poli (GR), inhiben fuertemente la tasa de importación nuclear en células NSC-34. Las células NSC-34 de tipo neurona motora fueron co-transfectadas con GFP-lanzadera, junto con un plásmido vacío, poli (PR) o poli (GR). La tasa de importación nuclear se definió como la pendiente de la tasa lineal inicial de la curva a Vmax . La velocidad de transporte obtenida con el plásmido vacío se definió como 100%. La co-transfección con poli (PR) y poli (GR) inhibió la velocidad de transporte en aproximadamente 50% en comparación con el control. El análisis cuantitativo se realizó en tres a cinco experimentos independientes utilizando una vía ANOVA. **** p &lt;0,0001; *** p &lt;0,001. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55676/55676fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Assay to Measure Nucleocytoplasmic Transport in Real Time within Motor Neuron-like NSC-34 Cells

Este protocolo describe un método para medir sensitivamente la tasa de transporte nucleocitoplasmático dentro de las neuronas motoras NSC-34 células mediante la cuantificación del cambio en tiempo real en la importación nuclear de una proteína NLS-NES-GFP.

Ensayo para medir el transporte nucleocitoplasmático en tiempo real dentro de las células NSC-34 similares a neuronas motoras

Nucleocytoplasmic transport refers to the import and export of large molecules from the cell nucleus. Recently, a number of studies have shown a ...

assay-to-measure-nucleocytoplasmic-transport-real-time-within-motor

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.7K vistas.  Ben-Gurion University of the Negev.  Este protocolo describe un método para medir sensitivamente la tasa de transporte nucleocitoplasmático dentro de las neuronas motoras NSC-34 células mediante la cuantificación del cambio en tiempo real en la importación nuclear de una proteína NLS-NES-GFP. 

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Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein are molecular motors that regulate anterograde and retrograde transport, respectively. These motors use microtubule networks as rails. Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a powerful model organism to study axonal transport and IFT in vivo. Here, I describe a protocol to observe axonal transport and IFT in living C. elegans. Transported cargo can be visualized by tagging cargo proteins using fluorescent proteins such as green fluorescent protein (GFP). C. elegans is transparent and GFP-tagged cargo proteins can be expressed in specific cells under cell-specific promoters. Living worms can be fixed by microbeads on 10% agarose gel without killing or anesthetizing the worms. Under these conditions, cargo movement can be directly observed in the axons and cilia of living C. elegans without dissection. This method can be applied to the observation of any cargo molecule in any cells by modifying the target proteins and/or the cells they are expressed in. Most basic proteins such as molecular motors and adaptor proteins that are involved in axonal transport and IFT are conserved in C. elegans. Compared to other model organisms, mutants can be obtained and maintained more easily in C. elegans. Combining this method with various C. elegans mutants can clarify the molecular mechanisms of axonal transport and IFT.

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a good model to study axonal and intracellular transport. Here, I describe a protocol for in vivo recording and analysis of axonal and intraflagellar transport in C. elegans.

Inmovilización de Caenorhabditis elegans para analizar el transporte intracelular en las neuronas

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Characterizing the Composition of Molecular Motors on Moving Axonal Cargo Using "Cargo Mapping" Analysis

Understanding the mechanisms by which molecular motors coordinate their activities to transport vesicular cargoes within neurons requires the quantitative analysis of motor/cargo associations at the single vesicle level. The goal of this protocol is to use quantitative fluorescence microscopy to correlate (&#8220;map&#8221;) the position and directionality of movement of live cargo to the composition and relative amounts of motors associated with the same cargo. &#8220;Cargo mapping&#8221; consists of live imaging of fluorescently labeled cargoes moving in axons cultured on microfluidic devices, followed by chemical fixation during recording of live movement, and subsequent immunofluorescence (IF) staining of the exact same axonal regions with antibodies against motors. Colocalization between cargoes and their associated motors is assessed by assigning sub-pixel position coordinates to motor and cargo channels, by fitting Gaussian functions to the diffraction-limited point spread functions representing individual fluorescent point sources. Fixed cargo and motor images are subsequently superimposed to plots of cargo movement, to &#8220;map&#8221; them to their tracked trajectories. The strength of this protocol is the combination of live and IF data to record both the transport of vesicular cargoes in live cells and to determine the motors associated to these exact same vesicles. This technique overcomes previous challenges that use biochemical methods to determine the average motor composition of purified heterogeneous bulk vesicle populations, as these methods do not reveal compositions on single moving cargoes. Furthermore, this protocol can be adapted for the analysis of other transport and/or trafficking pathways in other cell types to correlate the movement of individual intracellular structures with their protein composition. Limitations of this protocol are the relatively low throughput due to low transfection efficiencies of cultured primary neurons and a limited field of view available for high-resolution imaging. Future applications could include methods to increase the number of neurons expressing fluorescently labeled cargoes.

Intracellular transport of cargoes, such as vesicles or organelles, is carried out by molecular motor proteins that track on polarized microtubules. This protocol describes the correlation of the directionality of transport of individual cargo particles moving inside neurons, to the relative amount and type of associated motor proteins.

La caracterización de la composición de los motores moleculares sobre el logro axonal Cargo Uso del análisis &quot;Mapeo de carga&quot;

Understanding the mechanisms by which molecular motors coordinate their activities to transport vesicular cargoes within neurons requires the quantitative ...

Neurociencias

Single-Molecule Imaging of Nuclear Transport

The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the last decade. The investigation of molecular interactions with high temporal and spatial resolutions deep within cells has remained challenging due to the inherently weak signals arising from individual molecules. Recent works by Yang et al. demonstrated that narrow-field epifluorescence microscopy allows visualization of nucleocytoplasmic transport at the single molecule level. By the single molecule approach, important kinetics, such as nuclear transport time and efficiency, for signal-dependent and independent cargo molecules have been obtained. Here we described a protocol for the methodological approach with an improved spatiotemporal resolution of 0.4 ms and 12 nm. The improved resolution enabled us to capture transient active transport and passive diffusion events through the nuclear pore complexes (NPC) in semi-intact cells. We expect this method to be used in elucidating other binding and trafficking events within cells.

Single molecule microscopy approch provided novel insights into nuclear transport.

Imagen de una sola molécula de transporte nuclear

The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the ...

Biología

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, survival, and glial communications. To date, numerous studies have reported that defects in these systems cause various neuronal diseases. Thus, understanding the mechanisms underlying vesicle dynamics may provide influential clues that could aid in the treatment of several neuronal disorders. Here, we describe a method for quantifying vesicle motilities, such as motility distance and rate of movement, using a software plug-in for the ImageJ platform. To obtain images for quantification, we labeled neuronal endosome-lysosome structures with EGFP-tagged vesicle marker proteins and observed the movement of vesicles using a time-lapse microscopy. This method is highly useful and simplify measuring vesicle motility in neurites, such as axons and dendrites, as well as in the soma of both neurons and glial cells. Furthermore, this method can be applied to other cell lines, such as fibroblasts and endothelial cells. This approach could provide a valuable advancement of our understanding of membrane trafficking.

The investigation of membrane trafficking is crucial for understanding neuronal functions. Here, we introduce a method for quantifying vesicle motility in neurons. This is a convenient method that can be adapted to the quantification of membrane trafficking in the nervous system.

Cuantificación de endosomas y de las motilidades de los lisosomas en neuronas cultivadas utilizando sondas fluorescentes

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...

A High-content Assay for Monitoring AMPA Receptor Trafficking

Postsynaptic trafficking of receptors to and from the cell surface is an important mechanism by which neurons modulate their responsiveness to different stimuli. The &#945;-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid (AMPA) receptors, which are responsible for fast excitatory synaptic transmission in neurons, are trafficked to and from the postsynaptic surface to dynamically alter neuronal excitability. AMPA receptor trafficking is essential for synaptic plasticity and can be disrupted in neurological disease. However, prevalent approaches for quantifying receptor trafficking ignore entire receptor pools, are overly time- and labor-intensive, or potentially disrupt normal trafficking mechanisms and therefore complicate the interpretation of resulting data. We present a high-content assay for the quantification of both surface and internal AMPA receptor populations in cultured primary hippocampal neurons using dual fluorescent immunolabeling and a near-infrared fluorescent 96-well microplate scanner. This approach facilitates the rapid screening of bulk internalized and surface receptor densities while minimizing sample material. However, our method has limitations in obtaining single-cell resolution or conducting live cell imaging. Finally, this protocol may be amenable to other receptors and different cell types, provided proper adjustments and optimization.

Neuronal excitability can be modulated through a dynamic process of endo- and exocytosis of excitatory ionotropic glutamate receptors. Described here is an accessible, high-content assay for quantifying surface and internal receptor population pools.

Un análisis de contenido de alta para seguimiento AMPA del Receptor de tráfico

Postsynaptic trafficking of receptors to and from the cell surface is an important mechanism by which neurons modulate their responsiveness to different ...

Imaging and Analysis of Neurofilament Transport in Excised Mouse Tibial Nerve

Neurofilament protein polymers move along axons in the slow component of axonal transport at average speeds of ~0.35-3.5 mm/day. Until recently the study of this movement in situ was only possible using radioisotopic pulse-labeling, which permits analysis of axonal transport in whole nerves with a temporal resolution of days and a spatial resolution of millimeters. To study neurofilament transport in situ with higher temporal and spatial resolution, we developed a hThy1-paGFP-NFM transgenic mouse that expresses neurofilament protein M tagged with photoactivatable GFP in neurons. Here we describe fluorescence photoactivation pulse-escape and pulse-spread methods to analyze neurofilament transport in single myelinated axons of tibial nerves from these mice ex vivo. Isolated nerve segments are maintained on the microscope stage by perfusion with oxygenated saline and imaged by spinning disk confocal fluorescence microscopy. Violet light is used to activate the fluorescence in a short axonal window. The fluorescence in the activated and flanking regions is analyzed over time, permitting the study of neurofilament transport with temporal and spatial resolution on the order of minutes&#160;and microns, respectively. Mathematical modeling can be used to extract kinetic parameters of neurofilament transport including the velocity, directional bias and pausing behavior from the resulting data. The pulse-escape and pulse-spread methods can also be adapted to visualize neurofilament transport in other nerves. With the development of additional transgenic mice, these methods could also be used to image and analyze the axonal transport of other cytoskeletal and cytosolic proteins in axons.

We describe fluorescence photoactivation methods to analyze the axonal transport of neurofilaments in single myelinated axons of peripheral nerves from transgenic mice that express a photoactivatable neurofilament protein.

Imágenes y análisis del transporte de neurofilamento en el nervio tibial de ratón extirpado

Neurofilament protein polymers move along axons in the slow component of axonal transport at average speeds of ~0.35-3.5 mm/day. Until recently the study ...

Nuclear Transport Assays in Permeabilized Mouse Cortical Neurons

Disruption of nucleocytoplasmic transport is increasingly implicated in the pathogenesis of neurodegenerative diseases. Moreover, there is a growing recognition of cell-specific differences in nuclear pore complex structure, prompting a need to adapt nuclear transport methods for use in neurons. Permeabilized cell assays, in which the plasma membrane is selectively perforated by digitonin, are widely used to study passive and active nuclear transport in immortalized cell lines but have not been applied to neuronal cultures. In our initial attempts, we observed the rapid loss of nuclear membrane integrity in primary mouse cortical neurons exposed to even low concentrations of digitonin. We hypothesized that neuronal nuclear membranes may be uniquely vulnerable to the loss of cytoplasmic support. After testing multiple approaches to improve nuclear stability, we observed optimal nuclear integrity following hypotonic lysis in the presence of a concentrated bovine serum albumin cushion. Neuronal nuclei prepared by this approach reliably import recombinant fluorescent cargo in an energy-dependent manner, facilitating analysis of nuclear import by high content microscopy with automated analysis. We anticipate that this method will be broadly applicable to studies of passive and active nuclear transport in primary neurons.

<meta charset="utf8"></head><body>Ensayos de transporte nuclear en neuronas corticales de ratón permeabilizadas

We have developed a reliable method of selective plasma membrane permeabilization of primary mouse cortical neurons for high content automated analysis of neuronal nucleocytoplasmic transport.

Ensayos de transporte nuclear en neuronas corticales de ratón permeabilizadas

Disruption of nucleocytoplasmic transport is increasingly implicated in the pathogenesis of neurodegenerative diseases. Moreover, there is a growing ...

Real-Time Fluorescent Measurement of Synaptic Functions in Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis

Before neuronal degeneration, the cause of motor and cognitive deficits in patients with amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and/or frontotemporal lobe dementia (FTLD) is dysfunction of communication between neurons and motor neurons and muscle. The underlying process of synaptic transmission involves membrane depolarization-dependent synaptic vesicle fusion and the release of neurotransmitters into the synapse. This process occurs through localized calcium influx into the presynaptic terminals where synaptic vesicles reside. Here, the protocol describes fluorescence-based live-imaging methodologies that reliably report depolarization-mediated synaptic vesicle exocytosis and presynaptic terminal calcium influx dynamics in cultured neurons.
Using a styryl dye that is incorporated into synaptic vesicle membranes, the synaptic vesicle release is elucidated. On the other hand, to study calcium entry, Gcamp6m is used, a genetically encoded fluorescent reporter. We employ high potassium chloride-mediated depolarization to mimic neuronal activity. To quantify synaptic vesicle exocytosis unambiguously, we measure the loss of normalized styryl dye fluorescence as a function of time. Under similar stimulation conditions, in the case of calcium influx, Gcamp6m fluorescence increases. Normalization and quantification of this fluorescence change are performed in a similar manner to the styryl dye protocol. These methods can be multiplexed with transfection-based overexpression of fluorescently tagged mutant proteins. These protocols have been extensively used to study synaptic dysfunction in models of FUS-ALS and C9ORF72-ALS, utilizing primary rodent cortical and motor neurons. These protocols easily allow for rapid screening of compounds that may improve neuronal communication. As such, these methods are valuable not only for the study of ALS but for all areas of neurodegenerative and developmental neuroscience research.

Two related methods are described to visualize subcellular events required for synaptic transmission. These protocols enable the real-time monitoring of the dynamics of presynaptic calcium influx and synaptic vesicle membrane fusion using live-cell imaging of in vitro cultured neurons.

Medición fluorescente en tiempo real de las funciones sinápticas en modelos de esclerosis lateral amiotrófica

Before neuronal degeneration, the cause of motor and cognitive deficits in patients with amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and/or frontotemporal lobe ...

Expanding the Toolkit for In Vivo Imaging of Axonal Transport

Axonal transport maintains neuronal homeostasis by enabling the bidirectional trafficking of diverse organelles and cargoes. Disruptions in axonal transport have devastating consequences for individual neurons and their networks, and contribute to a plethora of neurological disorders. As many of these conditions involve both cell autonomous and non-autonomous mechanisms, and often display a spectrum of pathology across neuronal subtypes, methods to accurately identify and analyze neuronal subsets are imperative.
This paper details protocols to assess in vivo axonal transport of signaling endosomes and mitochondria in sciatic nerves of anesthetized mice. Stepwise instructions are provided to 1) distinguish motor from sensory neurons in vivo, in situ, and ex vivo by using mice that selectively express fluorescent proteins within cholinergic motor neurons; and 2) separately or concurrently assess in vivo axonal transport of signaling endosomes and mitochondria. These complementary intravital approaches facilitate the simultaneous imaging of different cargoes in distinct peripheral nerve axons to quantitatively monitor axonal transport in health and disease.

Expanding the Toolkit for In Vivo Imaging of Axonal Transport

Using transgenic fluorescent mice, detailed protocols are described to assess in vivo axonal transport of signaling endosomes and mitochondria within motor and sensory axons of the intact sciatic nerve in live animals.

Ensayo para medir el transporte nucleocitoplasmático en tiempo real dentro de las células NSC-34 similares a neuronas motoras

Resumen

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Ensayos de transporte nuclear en neuronas corticales de ratón permeabilizadas

Ensayos de transporte nuclear en neuronas corticales de ratón permeabilizadas

Medición fluorescente en tiempo real de las funciones sinápticas en modelos de esclerosis lateral amiotrófica

Ampliación del kit de herramientas para imágenes in vivo del transporte axonal