Name: assay to measure nucleocytoplasmic transport in real time within motor neuron-like nsc-34 cells
Uploaded: 2017-05-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assay to Measure Nucleocytoplasmic Transport in Real Time within Motor Neuron-like NSC-34 Cells at JoVE.com

Wir danken allen Mitgliedern des AI-Labors für ihre hilfreichen Kommentare und Anregungen. Wir danken Prof. Mark Hipp (Max-Planck-Institut für Biochemie) für die Bereitstellung des Shuttle-GFP-Vektors. Diese Arbeit wurde unterstützt durch Stipendien der israelischen Wissenschaftsstiftung (ISF # 124/14), der Binational Science Foundation (BSF # 2013325), FP7 Marie Curie Karriere Integration Grant (CIG # 333794) und dem Nationalen Institut für Psychobiologie in Israel ( NIPI # b133-14 / 15).

1. Zelllinienvorbereitung <ol><li> Tauen Sie etwa 1.000.000 Maus-Neuroblastom-Rückenmarkszellen (NSC-34-Zellen), die in einem flüssigen Stickstoffbehälter aufbewahrt wurden. Verwenden Sie einen 37 ° C Wasserinkubator, bis die Zellen vollständig aufgetaut sind. </li><li> Füge frisches, warmes Medium hinzu (DMEM-Medium mit 10% fötalem Rinderserum (FBS), 1% L-Glutamin und 1% Pen-Strep-Antibiotika). </li><li> Zentrifugen aufgetaute Zellen (SL16R) bei 500 xg für 5 min zentrifugieren und ein Zellpellet bilden. Verwerfe das Medium und füge 1 ml neues Medium für die Zellresuspension hinzu. </li><li> Legen Sie die resuspendierten Zellen in einen 15-ml-Kolben und fügen Sie zusätzliche 5 ml Medium hinzu. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht in einem sterilen Inkubator mit 5% CO 2 bei 37 ° C. </li><li> Parallel dazu Platz 8 unbeschichtete Deckgläser (Deckglas: 12 mm, 0,13-0,17 mm dick) in einer 60-mm-Kulturschale und sterilisieren mit 70% Ethanol und ca. 30 min UV-Licht bis zum Trocknen. Fügen Sie Medium zu jeder Schale hinzu und entsorgen Sie, um das restliche Ethanol zu waschen.</li><li> Fügen Sie Trypsin-Puffer (2,5 g Trypsin und 0,2 g EDTA in 1 l Hanks &#39;Balanced Salt Solution) zu den Zellen hinzu, nachdem sie etwa 90% Konfluenz erreicht haben (etwa 6 Millionen Zellen pro Kolben), um adhärenten Zellen zu dissoziieren. HINWEIS: NSC-34-Zellen sind empfindlich und benötigen nur 15 s Trypsin-Puffer-Inkubation und 1 zusätzliche Min-Inkubation frei von Trypsin vor der Dissoziation mit dem Medium. </li><li> Die Zellen auf die 60 mm Kulturschalen legen, die bereits die Deckgläser mit 3 ml Medium enthalten, ca. 350.000 pro Schale. Lassen Sie sie in den Inkubator für 24 h, um die Zellbefestigung auf die Deckgläser zu ermöglichen. </li></ol> 2. Zelltransfektion ANMERKUNG: Nach ca. 24 h erreichen die NSC-34-Zellen 40% Konfluenz (ca. 800.000 Zellen) und sind zur Transfektion bereit. <ol><li> Bereiten Sie reines DMEM-Medium (300 &amp; mgr; l DMEM-Medium für jede 60 mm Kulturschale) in einer sterilen Mikrozentrifugenwanne vorEs </li><li> Addieren Sie 2 μg jedes Plasmids, das für die Transfektion benötigt wird, zu jedem DMEM-haltigen Mikrozentrifugenröhrchen. HINWEIS: Das Shuttle-GFP-Plasmid ist bei allen Zelltransfektionen obligatorisch. </li><li> Fügen Sie Transfektionsreagenz zu allen Mikrozentrifugenröhrchen hinzu, die ihre erforderlichen Plasmide enthalten. Hierbei werden 4 μl des handelsüblichen Transfektionsreagens für jeweils 2 μg DNA zugegeben. </li><li> Vortex die Mikrozentrifugenröhrchen, die DMEM, Plasmide und das Transfektionsreagenz enthalten und diese bei Raumtemperatur für 25 min inkubieren. </li><li> Fügen Sie jedes Mikrozentrifugenröhrchen zu einer Kulturschale hinzu und rühren Sie die Schale vorsichtig zu einer homogenen Lösung. Legen Sie das Gericht für 48 Stunden in den Inkubator. ANMERKUNG: Da Shuttle-GFP in allen Zellen exprimiert werden sollte, kann die Shuttle-GFP-Transfektionseffizienz partiell untersucht und mit einer Fluoreszenzmikroskopie nach der Transfektion über Nacht getestet werden. Eine vollständige Untersuchung von nicht-fluoreszierenden exprimierten Proteinen kann unter Verwendung eines Immunoblot-Analysen durchgeführt werdenIst. </li></ol> 3. Mikroskopie <ol><li> Befestigen Sie die Deckblätter, die transfizierte NSC-34-Zellen enthalten, an einen Deckglashalter und waschen Sie vorsichtig mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), um die abgetrennten toten Zellen zu entfernen. </li><li> Identifizieren Sie einen geeigneten Zellflecken mit einem grünen Fluoreszenzfilter mit einem invertierten Mikroskop. HINWEIS: Ein geeigneter Zellfleck ist definiert als ein Mikroskop-Sichtfeld, das eine große Anzahl von Zellen (20-30 Zellen in einem Feld) zeigt und in der die Kerne in den Zellen klar definiert sind. Zellkerne innerhalb des Zellflecks werden zuerst mit dem Auge identifiziert und manuell durch die Imaging-Software markiert. </li><li> Füge 200 μl eines Exportin-1-Inhibitors Leptomycin B (LMB) -Puffer mit 10 ng / mL LMB in PBS zu den Deckgläsern hinzu, indem man den Puffer auf die Deckgläser unter dem Mikroskop tropft. HINWEIS: Dieser Zeitpunkt wird als Intervall Null gesetzt. </li><li> Quantifizierung der Fluoreszenzintensität der markierten Kerne in 3 s Intervallen für ca. 400-500 s. </li><li&gt; Test zwischen 3 und 5 Deckblättern für jede Transfektionsgruppe in jedem einzelnen Experiment. </li></ol> 4. Analyse HINWEIS: Da verschiedene Zellen unterschiedliche Ebenen von fluoreszierendem Shuttle-GFP exprimieren, ist es wichtig, die nukleare Fluoreszenzintensität jeder Zelle auf ihre eigene initiale Fluoreszenzintensität zu normalisieren. <ol><li> Normalisieren Sie die Fluoreszenzintensität der markierten Kerne, indem Sie das 3-s-Fluoreszenzintervall jedes Kerns mit dem Durchschnitt der anfänglichen sechs Intervalle dieses Kerns teilen. </li><li> Nach der Normalisierung jedes Kerns ergibt sich eine Fluoreszenzintensitätskurve, die die Veränderung der Kernfluoreszenz als Funktion der Zeit für jeden Zellflecken darstellt. Um dies zu erreichen, berechnen Sie den Durchschnitt aller Zellen in jedem Zell-Patch (bestehend aus etwa 20-30 Zellen in jedem Patch). HINWEIS: Die Nuklei-Fluoreszenz-Intensitätskurve ähnelt einer Michaelis-Menten-Sättigungskurve, die bei erhöhten Ti besser beobachtet wirdIch Perioden. Dies ist auf eine Verringerung der zytosolischen Mengen an Shuttle-GFP mit der Zeit aufgrund des Atomtransports zurückzuführen. Diese Abnahme verringert statistisch die Wahrscheinlichkeit eines Shuttle-GFP, um in den Zellkern zu transportieren, wodurch die Sättigung in der Kernfluoreszenz erreicht wird. Die von der linearen Anfangsrate der Kurve abgeleitete Steigung ergibt die V max Eintrittsrate in den Kern. </li><li> Analysieren Sie die V max- Pisten jedes Zell-Patches, die von drei bis fünf unabhängigen Experimenten abgeleitet wurden, wobei die Grafik-Software verwendet wird, um eine Steilheit zu erzeugen, die jede experimentelle Gruppe repräsentiert. Führen Sie die Quantifizierung mit einer einseitigen ANOVA statistischen Analyse durch. </li></ol> 5. Protein Expression Validierung <ol><li> Legen Sie 60 mm Kulturschalen mit den restlichen Zellen (nicht in der oben genannten Experiment) aus jeder experimentellen Gruppe auf Eis. </li><li> Das Medium entsorgen und die Zellen zweimal mit PBS waschen, um das verbleibende Medium zu verdünnen und zu waschen. </li><li> Behandle die Zellen mit 200-400ΜL Lysepuffer, enthaltend PBS, 0,5% Triton und Protease-Inhibitor-Cocktail-Tablette (PI). Kratzen mit einem Zellschaber. </li><li> Sammeln Sie die Zellen in Lysepuffer in einem Mikrozentrifugenröhrchen und homogenisieren Sie mit einem Homogenisator bei 4.000 U / min für 1 min unter Eis. </li><li> Zentrifugieren der homogenisierten Zellen bei 2500 xg für 10 min. Sammeln Sie den Überstand, quantifizieren Sie die Proteinkonzentration unter Verwendung eines Bradford-Assays und lagern bis zur Verwendung bei -20 ° C. </li><li> Sammle zwischen 30 und 70 μg Gesamtprotein (abhängig vom Protein) und lade es in ein SDS-PAGE-Gel, um die Proteinexpression unter Verwendung eines Immunoblot-Assays zu testen. </li></ol>

<ol>
	<li>Alberts, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular biology of the cell. , (2002).</li><li>Freitas, N., Cunha, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+and+signals+for+the+nuclear+import+of+proteins.">Mechanisms and signals for the nuclear import of proteins.</a> Curr Genomics. 10, 550-557 (2009).</li><li>Kalderon, D., Roberts, B. L., Richardson, W. D., Smith, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+short+amino+acid+sequence+able+to+specify+nuclear+location.">A short amino acid sequence able to specify nuclear location.</a> Cell. 39, 499-509 (1984).</li><li>la Cour, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+and+prediction+of+leucine-rich+nuclear+export+signals.">Analysis and prediction of leucine-rich nuclear export signals.</a> Protein Eng Des Sel. 17, 527-536 (2004).</li><li>Boeynaems, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+screen+connects+nuclear+transport+genes+to+DPR+pathology+in+c9ALS/FTD.">Drosophila screen connects nuclear transport genes to DPR pathology in c9ALS/FTD.</a> Sci Rep. 6, 20877 (2016).</li><li>Freibaum, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GGGGCC+repeat+expansion+in+C9orf72+compromises+nucleocytoplasmic+transport.">GGGGCC repeat expansion in C9orf72 compromises nucleocytoplasmic transport.</a> Nature. 525, 129-133 (2015).</li><li>Jovicic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modifiers+of+C9orf72+dipeptide+repeat+toxicity+connect+nucleocytoplasmic+transport+defects+to+FTD/ALS.">Modifiers of C9orf72 dipeptide repeat toxicity connect nucleocytoplasmic transport defects to FTD/ALS.</a> Nat Neurosci. 18, 1226-1229 (2015).</li><li>Kwon, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly-dipeptides+encoded+by+the+C9orf72+repeats+bind+nucleoli,+impede+RNA+biogenesis,+and+kill+cells.">Poly-dipeptides encoded by the C9orf72 repeats bind nucleoli, impede RNA biogenesis, and kill cells.</a> Science. 345, 1139-1145 (2014).</li><li>Rossi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+accumulation+of+mRNAs+underlies+G4C2-repeat-induced+translational+repression+in+a+cellular+model+of+C9orf72+ALS.">Nuclear accumulation of mRNAs underlies G4C2-repeat-induced translational repression in a cellular model of C9orf72 ALS.</a> J Cell Sci. 128, 1787-1799 (2015).</li><li>Shi, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxic+PRn+poly-dipeptides+encoded+by+the+C9orf72+repeat+expansion+block+nuclear+import+and+export.">Toxic PRn poly-dipeptides encoded by the C9orf72 repeat expansion block nuclear import and export.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. , (2017).</li><li>Zhang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C9orf72+repeat+expansion+disrupts+nucleocytoplasmic+transport.">The C9orf72 repeat expansion disrupts nucleocytoplasmic transport.</a> Nature. 525, 56-61 (2015).</li><li>Zhang, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C9ORF72+poly(GA)+aggregates+sequester+and+impair+HR23+and+nucleocytoplasmic+transport+proteins.">C9ORF72 poly(GA) aggregates sequester and impair HR23 and nucleocytoplasmic transport proteins.</a> Nat Neurosci. 19, 668-677 (2016).</li><li>Cleveland, D. W., Rothstein, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+Charcot+to+Lou+Gehrig:+deciphering+selective+motor+neuron+death+in+ALS.">From Charcot to Lou Gehrig: deciphering selective motor neuron death in ALS.</a> Nat Rev Neurosci. 2, 806-819 (2001).</li><li>DeJesus-Hernandez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanded+GGGGCC+hexanucleotide+repeat+in+noncoding+region+of+C9ORF72+causes+chromosome+9p-linked+FTD+and+ALS.">Expanded GGGGCC hexanucleotide repeat in noncoding region of C9ORF72 causes chromosome 9p-linked FTD and ALS.</a> Neuron. 72, 245-256 (2011).</li><li>Renton, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hexanucleotide+repeat+expansion+in+C9ORF72+is+the+cause+of+chromosome+9p21-linked+ALS-FTD.">A hexanucleotide repeat expansion in C9ORF72 is the cause of chromosome 9p21-linked ALS-FTD.</a> Neuron. 72, 257-268 (2011).</li><li>Boeve, B. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+frontotemporal+dementia+and/or+amyotrophic+lateral+sclerosis+associated+with+the+GGGGCC+repeat+expansion+in+C9ORF72.">Characterization of frontotemporal dementia and/or amyotrophic lateral sclerosis associated with the GGGGCC repeat expansion in C9ORF72.</a> Brain. 135, 765-783 (2012).</li><li>Haeusler, A. R., Donnelly, C. J., Rothstein, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expanding+biology+of+the+C9orf72+nucleotide+repeat+expansion+in+neurodegenerative+disease.">The expanding biology of the C9orf72 nucleotide repeat expansion in neurodegenerative disease.</a> Nat Rev Neurosci. 17, 383-395 (2016).</li><li>Woerner, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+protein+aggregates+interfere+with+nucleocytoplasmic+transport+of+protein+and+RNA.">Cytoplasmic protein aggregates interfere with nucleocytoplasmic transport of protein and RNA.</a> Science. 351, 173-176 (2016).</li><li>Tao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleolar+stress+and+impaired+stress+granule+formation+contribute+to+C9orf72+RAN+translation-induced+cytotoxicity.">Nucleolar stress and impaired stress granule formation contribute to C9orf72 RAN translation-induced cytotoxicity.</a> Hum Mol Genet. 24, 2426-2441 (2015).</li><li>Wen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antisense+proline-arginine+RAN+dipeptides+linked+to+C9ORF72-ALS/FTD+form+toxic+nuclear+aggregates+that+initiate+in+vitro+and+in+vivo+neuronal+death.">Antisense proline-arginine RAN dipeptides linked to C9ORF72-ALS/FTD form toxic nuclear aggregates that initiate in vitro and in vivo neuronal death.</a> Neuron. 84, 1213-1225 (2014).</li></ol>

Autoren haben nichts zu offenbaren.

Dieses Protokoll zeigt einen hochempfindlichen und quantitativen neuen Assay, um winzige Veränderungen im nucleozytoplasmatischen Transport zu bewerten. Mit diesem System ist es möglich, den nucleozytoplasmatischen Transport und seine Dysfunktion in Echtzeit zu beobachten und zu messen, nicht nur große Defekte, die zu dramatischen Veränderungen der Proteinverteilung führen. Dieser Assay hat nicht nur einen Sensitivitätsvorteil, sondern erfordert auch wenig Vorbereitung, ist preiswert und ist ein sehr einfacher und...

Der nukleare Porenkomplex (NPC) kontrolliert den Import und Export von großen Molekülen in und aus dem Zellkern. Im Gegensatz zu kleinen Molekülen, die ohne Regulation 1 in den Kern eindringen können, wird der Transport größerer Moleküle stark vom NPC kontrolliert. Diese großen Moleküle, wie Proteine ​​und RNA, assoziieren mit Transportfaktoren, einschließlich Importins und Exportins, importiert und exportiert aus dem Kern 2 . Um importiert zu werden, müssen Proteine ​​ein kleines Peptidmotiv enthalten, das im Allgemeinen als nukleares Lokalisierungssignal (NLS) bezeichnet wird, das durch Importine 2 gebunden ist. Diese Sequenzen von Aminosäuren wirken als Tag und sind in der Zusammensetzung 3 , 4 verschieden. Proteine ​​können aus dem Kern in das Zytoplasma aufgrund ihrer Assoziation mit Exportin exportiert werdenS, die eine Signalsequenz binden, die allgemein als nukleares Exportsignal (NES) bezeichnet wird 2 . Sowohl Importins als auch Exportins sind in der Lage, ihre Ladung aufgrund der Regulierung des kleinen Ras-verwandten Nuklearproteins GTPase (Ran) 2 zu transportieren. Es wurde gezeigt, dass Ran in verschiedenen Konformationszuständen existiert, je nachdem, ob es an GTP oder BIP gebunden ist. Wenn an GTP gebunden, kann Ran an importins oder exportins binden. Nach der Bindung an RanGTP veröffentlichen die Importine ihre Fracht, während die Exportine RanGTP binden müssen, um einen Komplex mit ihrer Exportfracht zu bilden. Der dominante Nukleotidbindungszustand von Ran hängt von seinem Standort im Kern (RanGTP) oder dem Cytoplasma (RanGDP) ab. In jüngster Zeit haben eine Reihe von Studien eine Verbindung zwischen Beeinträchtigungen im nukleozytoplasmatischen Weg und sowohl der amyotrophischen Lateralsklerose (ALS) als auch der frontotemporalen Demenz (FTD) 5 , 6 gezeigt </sup&gt; , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 . ALS ist eine fortschreitende und tödliche neurodegenerative Erkrankung, die sowohl die oberen als auch die unteren motorischen Neuronen (MNs) 13 beeinflusst und zu einer Lähmung und letztlich zum Tode führt, innerhalb von 2-5 Jahren im Durchschnitt. Die meisten Fälle von ALS werden als sporadische (SALS) eingestuft, ohne jede offensichtliche genetische Verknüpfung, aber 10% werden dominant vererbt (familiäres ALS, FALS). Kürzlich wurden Hexanukleotid-Wiederholungserweiterungen (HREs) im Chromosom 9 offenen Leserahmen 72 (C9orf72) Gen 14 , 15 als genetische Ursache von ALS und FTD identifiziert. Diese Mutanten machen 30-40% der FALS-Fälle aus, und verschiedene Studien haben behauptetDass sie eine Toxizität durch Beeinträchtigung des nucleozytoplasmatischen Transports verursachen 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 . Diese Studien haben zumeist die endgültigen Ergebnisse und Manifestationen von HREs auf den nucleozytoplasmatischen Transport gezeigt, aber sie zeigen keine nukleocytoplasmatische Störung in Echtzeit. Infolgedessen wurde nur ein schwerer nukleozytoplasmatischer Transportmangel 11 , 17 , 18 untersucht. Dieses Protokoll beschreibt eine neue und veRy-sensitiven Assay zur Bewertung und Quantifizierung der nukleozytoplasmatischen Transportdysfunktion in Echtzeit. Die Importrate eines NLS-NES-GFP-Proteins (Shuttle-GFP) kann in Echtzeit mittels Fluoreszenzmikroskopie quantifiziert werden. Dies geschieht unter Verwendung eines Exportin-Inhibitors, wie zuvor beschrieben, so daß der Shuttle-GFP nur in den Kern gelangen kann. Mit der Fluoreszenzmikroskopie und einer Software, die in der Lage ist, Fluoreszenzveränderungen in Echtzeit zu quantifizieren, ist es möglich, allmähliche Änderungen der Fluoreszenzintensität des im Zellkern befindlichen Shuttle-GFP zu quantifizieren. Als Ergebnis kann eine Michaelis-Menten-ähnliche Sättigungskurve der Fluoreszenz-zu-Zeit-Achse, die die Menge an nuklearem Shuttle-GFP zu irgendeiner gegebenen Zeit darstellt, hergestellt werden. Durch die Verwendung der anfänglichen linearen Geschwindigkeit der Kurven ist es möglich, eine Steigung zu erzeugen, die die Eintrittsrate in den Kern vor der Fluoreszenzsättigung darstellt. Um den Test zu validieren, das übersetzenD C9orf72 Dipeptidwiederholungen, Poly (GR) und Poly (PR), die bisher berichtet wurden, um den nucleozytoplasmatischen Transport zu stören, wurden 5 , 7 , 8 , 10 , 12 verwendet. Unter Verwendung dieses Assays wurde eine 50% ige Abnahme der nuklearen Einfuhrrate im Vergleich zur Kontrolle beobachtet. Mit diesem System können winzige Veränderungen im nucleozytoplasmatischen Transport untersucht werden. Darüber hinaus kann die Fähigkeit verschiedener Faktoren, einen nukleozytoplasmatischen Transportdefekt zu retten, bestimmt werden.

<table><tbody><tr><td>Mouse Motor Neuron-Like hybrid Cell Line (NSC-34)</td><td>tebu-bio</td><td>CLU140-A</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 4.5 g/L L-glucose</td><td>Biological Industries</td><td>01-055-1A</td><td></td></tr><tr><td>FBS European Grade</td><td>Biological Industries</td><td>04-007-1A</td><td></td></tr><tr><td>SL 16R Centrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004030</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Forma Series ii Water Jacketed CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Incubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>3111</td><td></td></tr><tr><td>Cover glass 12 mm dia., 0.13-0.17 mm thick</td><td>Bar Naor LTD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TurboFect Transfection Reagent</td><td>Thermo Scientific</td><td>&lt;a href=&quot;https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/R0531&quot;&gt;R0531&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Axiovert 100 inverted microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaging Workbench 2</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leptomycin B</td><td>Sigma</td><td>L2913</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Biological Industries</td><td>02-023-1A</td><td></td></tr><tr><td>Homogenizer motor/control/chuck/90 degree clamp</td><td>Glas-Col</td><td>099C K5424CE</td><td></td></tr><tr><td>MicroCL 17R Centrifuge, Refrigerated</td><td>Thermo Scientific</td><td>75002455</td><td></td></tr></tbody></table>

assay to measure nucleocytoplasmic transport in real time within motor neuron-like nsc-34 cells

Der nukleozytoplasmatische Transport bezieht sich auf den Import und Export von großen Molekülen aus dem Zellkern. In jüngster Zeit haben eine Reihe von Studien eine Verbindung zwischen der amyotrophischen Lateralsklerose (ALS) und den Beeinträchtigungen im nukleocytoplasmatischen Weg gezeigt. ALS ist eine neurodegenerative Erkrankung, die die motorischen Neuronen beeinflusst und zu einer Lähmung und letztlich im Tode führt, innerhalb von 2-5 Jahren im Durchschnitt. Die meisten Fälle von ALS sind sporadisch, ohne irgendeine offensichtliche genetische Verknüpfung, aber 10% werden in einer dominanten Weise vererbt. Kürzlich wurden Hexanucleotid-Repeat-Expansionen (HREs) im Chromosom 9 offenen Leserahmen 72 (C9orf72) Gen als genetische Ursache von ALS und frontotemporaler Demenz (FTD) identifiziert. Wichtig ist, dass verschiedene Gruppen vor kurzem vorgeschlagen haben, dass diese Mutanten den nucleozytoplasmatischen Transport beeinflussen. Diese Studien haben zumeist das endgültige Ergebnis und die Manifestationen, die durch HREs auf den nucleozytoplasmatischen Transport verursacht wurden, gezeigt, aber sie zeigen keine nukleare Transportdysfunktion inEchtzeit. Als Ergebnis kann nur ein schwerer nukleozytoplasmatischer Transportmangel bestimmt werden, was hauptsächlich auf eine hohe Überexpression oder exogene Proteineinfügung zurückzuführen ist. Dieses Protokoll beschreibt einen neuen und sehr empfindlichen Assay zur Bewertung und Quantifizierung der nukleozytoplasmatischen Transportdysfunktion in Echtzeit. Die Importrate eines NLS-NES-GFP-Proteins (Shuttle-GFP) kann in Echtzeit mittels Fluoreszenzmikroskopie quantifiziert werden. Dies wird durch die Verwendung eines Exportin-Inhibitors durchgeführt, so dass der Shuttle-GFP nur in den Kern eindringen kann. Zur Validierung des Assays wurden die C9orf72 HRE translatierten Dipeptidwiederholungen, Poly (GR) und Poly (PR), die bisher gezeigt wurden, um den nucleozytoplasmatischen Transport zu stören, verwendet. Unter Verwendung des beschriebenen Assays wurde im Vergleich zur Kontrolle eine 50% ige Abnahme der nuklearen Importrate beobachtet. Mit diesem System können winzige Veränderungen des nucleozytoplasmatischen Transports untersucht und die Fähigkeit verschiedener Faktoren zur Rettung (auch nur teilweise) einer nukleozytoplasmatischen trAnsport-Defekt kann bestimmt werden.

Unter Verwendung des hier vorgestellten Verfahrens wurden motorneuronartige NSC-34-Zellen mit einem NLS-NES-GFP (Shuttle-GFP) -Protein transfiziert. Dieses Protein, das NLS- und NES-Signalsequenzen aufweist (Abbildung 1 ), kann zwischen dem Zellkern und dem Cytoplasma pendeln. Generisches GFP kann den Kern in Abwesenheit eines Lokalisierungssignal-Tags nur durch Diffusion eintreten oder verlassen und ist daher gleichmäßig zwischen dem Kern und dem Cytoplasma verteilt (...

Watch this Scientific Journal Video about Assay to Measure Nucleocytoplasmic Transport in Real Time within Motor Neuron-like NSC-34 Cells at JoVE.com

Assay to Measure Nucleocytoplasmic Transport in Real Time within Motor Neuron-like NSC-34 Cells

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur sensitiven Messung der nukleozytoplasmatischen Transportrate in motorischen neuronähnlichen NSC-34-Zellen durch Quantifizierung der Echtzeitveränderung des nuklearen Importes eines NLS-NES-GFP-Proteins.

Assay zur Messung des nukleozytoplasmatischen Transports in Echtzeit in motorischen Neuronen-ähnlichen NSC-34-Zellen

Nucleocytoplasmic transport refers to the import and export of large molecules from the cell nucleus. Recently, a number of studies have shown a ...

assay-to-measure-nucleocytoplasmic-transport-real-time-within-motor

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.6K Aufrufe.  Ben-Gurion University of the Negev.  Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur sensitiven Messung der nukleozytoplasmatischen Transportrate in motorischen neuronähnlichen NSC-34-Zellen durch Quantifizierung der Echtzeitveränderung des nuklearen Importes eines NLS-NES-GFP-Proteins. 

Serie: Assay to Measure Nucleocytoplasmic Transport in Real Time within Motor Neuron-like NSC-34 Cells

Nucleofection of Rodent Neuroblasts to Study Neuroblast Migration In vitro

The subventricular zone (SVZ) located in the lateral wall of the lateral ventricles plays a fundamental role in adult neurogenesis. In this restricted area of the brain, neural stem cells proliferate and constantly generate neuroblasts that migrate tangentially in chains along the rostral migratory stream (RMS) to reach the olfactory bulb (OB). Once in the OB, neuroblasts switch to radial migration and then differentiate into mature neurons able to incorporate into the preexisting neuronal network. Proper neuroblast migration is a fundamental step in neurogenesis, ensuring the correct functional maturation of newborn neurons. Given the ability of SVZ-derived neuroblasts to target injured areas in the brain, investigating the intracellular mechanisms underlying their motility will not only enhance the understanding of neurogenesis but may also promote the development of neuroregenerative strategies.
This manuscript describes a detailed protocol for the transfection of primary rodent RMS postnatal neuroblasts and the analysis of their motility using a 3D in vitro migration assay recapitulating their mode of migration observed in vivo. Both rat and mouse neuroblasts can be quickly and efficiently transfected via nucleofection with either plasmid DNA, small hairpin (sh)RNA or short interfering (si)RNA oligos targeting genes of interest. To analyze migration, nucleofected cells are reaggregated in &#39;hanging drops&#39; and subsequently embedded in a three-dimensional matrix. Nucleofection per se does not significantly impair the migration of neuroblasts. Pharmacological treatment of nucleofected and reaggregated neuroblasts can also be performed to study the role of signaling pathways involved in neuroblast migration.

Nucleofection of Rodent Neuroblasts to Study Neuroblast Migration In vitro

Neuroblast migration is a crucial step in postnatal neurogenesis. The protocol described here can be used to investigate the role of candidate regulators of neuroblast migration by employing DNA/small hairpin RNA (shRNA) nucleofection and a 3D migration assay with neuroblasts isolated from the rodent postnatal rostral migratory stream.

Nucleofection von Nagerneuroblasten zu Neuroblast Migrationsstudie<em&gt; In-vitro-</em

The subventricular zone (SVZ) located in the lateral wall of the lateral ventricles plays a fundamental role in adult neurogenesis. In this restricted ...

Forschung

Neurowissenschaften

A High Content Imaging Assay for Identification of Botulinum Neurotoxin Inhibitors

Synaptosomal-associated protein-25 (SNAP-25) is a component of the soluble NSF attachment protein receptor (SNARE) complex that is essential for synaptic neurotransmitter release. Botulinum neurotoxin serotype A (BoNT/A) is a zinc metalloprotease that blocks exocytosis of neurotransmitter by cleaving the SNAP-25 component of the SNARE complex. Currently there are no licensed medicines to treat BoNT/A poisoning after internalization of the toxin by motor neurons. The development of effective therapeutic measures to counter BoNT/A intoxication has been limited, due in part to the lack of robust high-throughput assays for screening small molecule libraries. Here we describe a high content imaging (HCI) assay with utility for identification of BoNT/A inhibitors. Initial optimization efforts focused on improving the reproducibility of inter-plate results across multiple, independent experiments. Automation of immunostaining, image acquisition, and image analysis were found to increase assay consistency and minimize variability while enabling the multiparameter evaluation of experimental compounds in a murine motor neuron system.

Botulinum neurotoxin is one of the most potent toxins among Category-A biothreat agents, yet a post-exposure therapeutic is not available. The high content imaging approach is a powerful methodology for identifying novel inhibitors as it enables multiparameter screening using biologically relevant motor neurons, the primary target of this toxin.

Ein hoher Gehalt Imaging Assay zur Identifizierung von Botulinum Neurotoxin-Inhibitoren

Synaptosomal-associated protein-25 (SNAP-25) is a component of the soluble NSF attachment protein receptor (SNARE) complex that is essential for synaptic ...

Single-Molecule Imaging of Nuclear Transport

The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the last decade. The investigation of molecular interactions with high temporal and spatial resolutions deep within cells has remained challenging due to the inherently weak signals arising from individual molecules. Recent works by Yang et al. demonstrated that narrow-field epifluorescence microscopy allows visualization of nucleocytoplasmic transport at the single molecule level. By the single molecule approach, important kinetics, such as nuclear transport time and efficiency, for signal-dependent and independent cargo molecules have been obtained. Here we described a protocol for the methodological approach with an improved spatiotemporal resolution of 0.4 ms and 12 nm. The improved resolution enabled us to capture transient active transport and passive diffusion events through the nuclear pore complexes (NPC) in semi-intact cells. We expect this method to be used in elucidating other binding and trafficking events within cells.

Single molecule microscopy approch provided novel insights into nuclear transport.

The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the ...

Biologie

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, survival, and glial communications. To date, numerous studies have reported that defects in these systems cause various neuronal diseases. Thus, understanding the mechanisms underlying vesicle dynamics may provide influential clues that could aid in the treatment of several neuronal disorders. Here, we describe a method for quantifying vesicle motilities, such as motility distance and rate of movement, using a software plug-in for the ImageJ platform. To obtain images for quantification, we labeled neuronal endosome-lysosome structures with EGFP-tagged vesicle marker proteins and observed the movement of vesicles using a time-lapse microscopy. This method is highly useful and simplify measuring vesicle motility in neurites, such as axons and dendrites, as well as in the soma of both neurons and glial cells. Furthermore, this method can be applied to other cell lines, such as fibroblasts and endothelial cells. This approach could provide a valuable advancement of our understanding of membrane trafficking.

The investigation of membrane trafficking is crucial for understanding neuronal functions. Here, we introduce a method for quantifying vesicle motility in neurons. This is a convenient method that can be adapted to the quantification of membrane trafficking in the nervous system.

Quantifizierung von Endosom- und Lysosom-Motilen in kultivierten Neuronen mit fluoreszierenden Sonden

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...

A High-content Assay for Monitoring AMPA Receptor Trafficking

Postsynaptic trafficking of receptors to and from the cell surface is an important mechanism by which neurons modulate their responsiveness to different stimuli. The &#945;-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid (AMPA) receptors, which are responsible for fast excitatory synaptic transmission in neurons, are trafficked to and from the postsynaptic surface to dynamically alter neuronal excitability. AMPA receptor trafficking is essential for synaptic plasticity and can be disrupted in neurological disease. However, prevalent approaches for quantifying receptor trafficking ignore entire receptor pools, are overly time- and labor-intensive, or potentially disrupt normal trafficking mechanisms and therefore complicate the interpretation of resulting data. We present a high-content assay for the quantification of both surface and internal AMPA receptor populations in cultured primary hippocampal neurons using dual fluorescent immunolabeling and a near-infrared fluorescent 96-well microplate scanner. This approach facilitates the rapid screening of bulk internalized and surface receptor densities while minimizing sample material. However, our method has limitations in obtaining single-cell resolution or conducting live cell imaging. Finally, this protocol may be amenable to other receptors and different cell types, provided proper adjustments and optimization.

Neuronal excitability can be modulated through a dynamic process of endo- and exocytosis of excitatory ionotropic glutamate receptors. Described here is an accessible, high-content assay for quantifying surface and internal receptor population pools.

Ein High-Content-Assay für die Überwachung der AMPA Rezeptor Menschenhandel

Postsynaptic trafficking of receptors to and from the cell surface is an important mechanism by which neurons modulate their responsiveness to different ...

Imaging and Analysis of Neurofilament Transport in Excised Mouse Tibial Nerve

Neurofilament protein polymers move along axons in the slow component of axonal transport at average speeds of ~0.35-3.5 mm/day. Until recently the study of this movement in situ was only possible using radioisotopic pulse-labeling, which permits analysis of axonal transport in whole nerves with a temporal resolution of days and a spatial resolution of millimeters. To study neurofilament transport in situ with higher temporal and spatial resolution, we developed a hThy1-paGFP-NFM transgenic mouse that expresses neurofilament protein M tagged with photoactivatable GFP in neurons. Here we describe fluorescence photoactivation pulse-escape and pulse-spread methods to analyze neurofilament transport in single myelinated axons of tibial nerves from these mice ex vivo. Isolated nerve segments are maintained on the microscope stage by perfusion with oxygenated saline and imaged by spinning disk confocal fluorescence microscopy. Violet light is used to activate the fluorescence in a short axonal window. The fluorescence in the activated and flanking regions is analyzed over time, permitting the study of neurofilament transport with temporal and spatial resolution on the order of minutes&#160;and microns, respectively. Mathematical modeling can be used to extract kinetic parameters of neurofilament transport including the velocity, directional bias and pausing behavior from the resulting data. The pulse-escape and pulse-spread methods can also be adapted to visualize neurofilament transport in other nerves. With the development of additional transgenic mice, these methods could also be used to image and analyze the axonal transport of other cytoskeletal and cytosolic proteins in axons.

We describe fluorescence photoactivation methods to analyze the axonal transport of neurofilaments in single myelinated axons of peripheral nerves from transgenic mice that express a photoactivatable neurofilament protein.

Bildgebung und Analyse des Neurofilamenttransports in verbraucheten Maus-Tibialnerv

Neurofilament protein polymers move along axons in the slow component of axonal transport at average speeds of ~0.35-3.5 mm/day. Until recently the study ...

Nuclear Transport Assays in Permeabilized Mouse Cortical Neurons

Disruption of nucleocytoplasmic transport is increasingly implicated in the pathogenesis of neurodegenerative diseases. Moreover, there is a growing recognition of cell-specific differences in nuclear pore complex structure, prompting a need to adapt nuclear transport methods for use in neurons. Permeabilized cell assays, in which the plasma membrane is selectively perforated by digitonin, are widely used to study passive and active nuclear transport in immortalized cell lines but have not been applied to neuronal cultures. In our initial attempts, we observed the rapid loss of nuclear membrane integrity in primary mouse cortical neurons exposed to even low concentrations of digitonin. We hypothesized that neuronal nuclear membranes may be uniquely vulnerable to the loss of cytoplasmic support. After testing multiple approaches to improve nuclear stability, we observed optimal nuclear integrity following hypotonic lysis in the presence of a concentrated bovine serum albumin cushion. Neuronal nuclei prepared by this approach reliably import recombinant fluorescent cargo in an energy-dependent manner, facilitating analysis of nuclear import by high content microscopy with automated analysis. We anticipate that this method will be broadly applicable to studies of passive and active nuclear transport in primary neurons.

We have developed a reliable method of selective plasma membrane permeabilization of primary mouse cortical neurons for high content automated analysis of neuronal nucleocytoplasmic transport.

Disruption of nucleocytoplasmic transport is increasingly implicated in the pathogenesis of neurodegenerative diseases. Moreover, there is a growing ...

Real-Time Fluorescent Measurement of Synaptic Functions in Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis

Before neuronal degeneration, the cause of motor and cognitive deficits in patients with amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and/or frontotemporal lobe dementia (FTLD) is dysfunction of communication between neurons and motor neurons and muscle. The underlying process of synaptic transmission involves membrane depolarization-dependent synaptic vesicle fusion and the release of neurotransmitters into the synapse. This process occurs through localized calcium influx into the presynaptic terminals where synaptic vesicles reside. Here, the protocol describes fluorescence-based live-imaging methodologies that reliably report depolarization-mediated synaptic vesicle exocytosis and presynaptic terminal calcium influx dynamics in cultured neurons.
Using a styryl dye that is incorporated into synaptic vesicle membranes, the synaptic vesicle release is elucidated. On the other hand, to study calcium entry, Gcamp6m is used, a genetically encoded fluorescent reporter. We employ high potassium chloride-mediated depolarization to mimic neuronal activity. To quantify synaptic vesicle exocytosis unambiguously, we measure the loss of normalized styryl dye fluorescence as a function of time. Under similar stimulation conditions, in the case of calcium influx, Gcamp6m fluorescence increases. Normalization and quantification of this fluorescence change are performed in a similar manner to the styryl dye protocol. These methods can be multiplexed with transfection-based overexpression of fluorescently tagged mutant proteins. These protocols have been extensively used to study synaptic dysfunction in models of FUS-ALS and C9ORF72-ALS, utilizing primary rodent cortical and motor neurons. These protocols easily allow for rapid screening of compounds that may improve neuronal communication. As such, these methods are valuable not only for the study of ALS but for all areas of neurodegenerative and developmental neuroscience research.

Two related methods are described to visualize subcellular events required for synaptic transmission. These protocols enable the real-time monitoring of the dynamics of presynaptic calcium influx and synaptic vesicle membrane fusion using live-cell imaging of in vitro cultured neurons.

Echtzeit-Fluoreszenzmessung synaptischer Funktionen in Modellen der amyotrophen Lateralsklerose

Before neuronal degeneration, the cause of motor and cognitive deficits in patients with amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and/or frontotemporal lobe ...

Expanding the Toolkit for In Vivo Imaging of Axonal Transport

Axonal transport maintains neuronal homeostasis by enabling the bidirectional trafficking of diverse organelles and cargoes. Disruptions in axonal transport have devastating consequences for individual neurons and their networks, and contribute to a plethora of neurological disorders. As many of these conditions involve both cell autonomous and non-autonomous mechanisms, and often display a spectrum of pathology across neuronal subtypes, methods to accurately identify and analyze neuronal subsets are imperative.
This paper details protocols to assess in vivo axonal transport of signaling endosomes and mitochondria in sciatic nerves of anesthetized mice. Stepwise instructions are provided to 1) distinguish motor from sensory neurons in vivo, in situ, and ex vivo by using mice that selectively express fluorescent proteins within cholinergic motor neurons; and 2) separately or concurrently assess in vivo axonal transport of signaling endosomes and mitochondria. These complementary intravital approaches facilitate the simultaneous imaging of different cargoes in distinct peripheral nerve axons to quantitatively monitor axonal transport in health and disease.

Expanding the Toolkit for In Vivo Imaging of Axonal Transport

Using transgenic fluorescent mice, detailed protocols are described to assess in vivo axonal transport of signaling endosomes and mitochondria within motor and sensory axons of the intact sciatic nerve in live animals.

Erweiterung des Toolkits für die In-vivo-Bildgebung des axonalen Transports

Axonal transport maintains neuronal homeostasis by enabling the bidirectional trafficking of diverse organelles and cargoes. Disruptions in axonal ...

Measuring Axonal Cargo Transport in Mouse Primary Cortical Cultured Neurons

Neuronal cells are highly polarized cells that stereotypically harbor several dendrites and an axon. The length of an axon necessitates efficient bidirectional transport by motor proteins. Various reports have suggested that defects in axonal transport are associated with neurodegenerative diseases. Also, the mechanism of the coordination of multiple motor proteins has been an attractive topic. Since the axon has uni-directional microtubules, it is easier to determine which motor proteins are involved in the movement. Therefore, understanding the mechanisms underlying the transport of axonal cargo is crucial for uncovering the molecular mechanism of neurodegenerative diseases and the regulation of motor proteins. Here, we introduce the entire process of axonal transport analysis, including the culturing of mouse primary cortical neurons, transfection of plasmids encoding cargo proteins, and directional and velocity analyses without the effect of pauses. Furthermore, the open-access software "KYMOMAKER" is introduced, which enables the generation of a kymograph to highlight transport traces according to their direction and allow easier visualization of axonal transport.

The present protocol describes the whole procedure of analysis for axonal transport. In particular, the calculation of transport velocity, not including the pausing, and the visualization method using open-access software "KYMOMAKER" are shown here.