Name: assay to measure nucleocytoplasmic transport in real time within motor neuron-like nsc-34 cells
Uploaded: 2017-05-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assay to Measure Nucleocytoplasmic Transport in Real Time within Motor Neuron-like NSC-34 Cells at JoVE.com

אנו מודים לכל חברי מעבדת AI על הערותיהם והצעותיהם המועילות. ברצוננו להודות פרופ &#39;מארק היפ (מקס פלנק המכון לביוכימיה) עבור מתן לנו את המעבורת- GFP וקטור. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהקרן הישראלית למדע (ISF # 124/14), הקרן הדו-לאומית למדע (BSF # 2013325), FP7 מארי קורי (קרייג # 333794) והמכון הלאומי לפסיכוביולוגיה בישראל NIPI # b133-14 / 15).

1. הכנת קו סלולרי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפשירי כ -1,000,000 תאי עצב בעמוד השדרה של תאי עצב נוירובלסטומה (NSC-34 תאים) שאוחסנו במיכל חנקן נוזלי. השתמש 37 ° C אינקובטור מים עד התאים מופשר לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף בינוני טרי, חם (בינוני DMEM המכיל 10% בסרום שור עוברית (FBS), 1% L- גלוטמין, 1% אנטיביוטיקה עט עט). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה תאים מופשר (SL16R) ב XG 500 במשך 5 דקות, ויצרו תא גלולה. מחק את המדיום ולהוסיף 1 מ&quot;ל של המדיום החדש עבור resuspension התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את התאים resuspended בבקבוק 15 מ&quot;ל ולהוסיף תוספת 5 מ&quot;ל של המדיום. דגירה התאים לילה חממה סטרילית עם 5% CO 2 ב 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקביל, במקום coverslips 8 uncoated (כיסוי זכוכית: 12 מ&quot;מ, 0.13-0.17 מ&quot;מ עובי) בתוך 60 מ&quot;מ צלחת תרבות לעקר באמצעות אתנול 70% וחשיפה 30 דקות של אור UV עד יבש. מוסיפים את המדיום לכל צלחת ומפזרים כדי לשטוף את אתנול שיורית.</li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף חיץ טריפסין (2.5 גרם של טריפסין ו 0.2 גרם של EDTA ב 1 L של תמיסת מלח מאוזן של הנקס) לתאים לאחר שהם מגיעים כ -90% מפגש (בערך 6 מיליון תאים לכל בקבוק) כדי לאפשר תאים חסיד לנתק. הערה: NSC-34 תאים רגישים רק דורשים 15 ים של הדגירה חיץ טריפסין 1 דקות נוספות של הדגירה ללא טריפסין לפני דיסוציאציה באמצעות המדיום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט התאים על 60 מנות תרבות מ&quot;מ כבר המכיל את coverslips עם 3 מ&quot;ל של מדיום, כ 350,000 לכל מנה. להשאיר אותם בחממה במשך 24 שעות כדי לאפשר מצורף התא על coverslips. </li></ol> 2. Transfection Cell הערה: לאחר כ 24 שעות, תאים NSC-34 יגיעו המפגש 40% (כ 800,000 תאים) ויהיה מוכן transfection. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן בינוני DMEM טהור (300 μL של מדיום DMEM עבור כל צלחת 60 מ&quot;מ תרבות) באמבט microcentrifuge סטריליEs. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מיקרוגרם של כל פלסמיד נדרש transfection לכל צינור microcentrifuge המכיל DMEM. הערה: המעבורת- GFP פלסמיד היא חובה בכל transfections התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף transfection מגיב לכל צינורות microcentrifuge המכילים פלסמידים הנדרשים שלהם. הנה, להוסיף 4 μL של מגיב transfection מסחרי עבור כל 2 מיקרוגרם של ה- DNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> וורטקס צינורות microcentrifuge המכיל DMEM, פלסמידים, ואת מגיב transfection ו דגירה אותם בטמפרטורת החדר למשך 25 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים כל צינור microcentrifuge לצלחת תרבות ומערבבים את המנה בעדינות כדי ליצור פתרון הומוגני. מניחים את צלחת בחזרה בחממה במשך 48 שעות. הערה: מאז המעבורת- GFP צריך לבוא לידי ביטוי בכל התאים, המעבורת- GFP יעילות transfection ניתן בחינה חלקית נבדק מראש באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי לאחר transfection לילה. בדיקה מלאה של חלבונים שאינם פלואורסצנטי לידי ביטוי יכול להתבצע באמצעות analys immunoblotJ </li></ol> 3. מיקרוסקופיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף את coverslips המכילים transfected NSC-34 תאים לבעלים coverslip ולשטוף בעדינות עם מלוחים שנאגרו מלוחים (PBS) כדי להסיר את התאים המתים מנותקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זיהוי תיקון התא מתאים באמצעות מסנן פלואורסצנטי ירוק עם מיקרוסקופ הפוך. הערה: תיקון תא מתאים מוגדר שדה מיקרוסקופ של נוף מראה מספר גדול של תאים (20-30 תאים בשדה) שבו גרעינים מוגדרים בבירור בתאים. גרעיני תאים בתוך תיקון התא מזוהים לראשונה על ידי העין מסומנים ידנית על ידי תוכנת הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 200 μL של מעכב exportin 1 Leptomycin B (LMB) המכיל 10 ng / mL LMB ב PBS כדי coverslips ידי טפטוף המאגר על coverslips תחת המיקרוסקופ. הערה: נקודת זמן זו נקבעת כאפס מרווח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת את עוצמת הניאון של גרעינים מסומנים במרווחים של 3 במשך כ 400-500 s. </li><li&gt; בדוק בין 3 ל 5 כיסוי לכסות עבור כל קבוצת transfection בכל ניסוי בודדים. </li></ol> 4. ניתוח הערה: מאז תאים שונים להביע רמות שונות של מעבורת ניאון- GFP, חשוב לנרמל את עוצמת הניאון הגרעיני של כל תא כדי עוצמת ניאון הראשונית שלה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנרמל את עוצמת הניאון של הגרעינים המסומנים על ידי חלוקת מרווח פלורסנט 3-s של כל גרעין עם הממוצע של שישה אינטרוולים הראשונים של גרעין זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הנורמליזציה של כל גרעין, לייצר עקומת עוצמת ניאון המייצג את השינוי גרעיני הקרינה כפונקציה של זמן עבור כל תיקון התא. כדי לעשות זאת, לחשב את הממוצע של כל התאים בכל תיקון תאים (בהיקף של כ 20-30 תאים בכל תיקון). הערה: עקומת עוצמת ניאון גרעיני דומה עקומת הרוויה Michaelis-Menten, אשר נצפה טוב יותר בתוך ti מוגברתלי תקופות. זאת בשל ירידה בכמויות cytosolic של המעבורת- GFP עם הזמן עקב התחבורה הגרעינית. ירידה זו סטטיסטית מורידה את ההסתברות של המעבורת- GFP להובלה לגרעין, ובכך להגיע הרוויה הקרינה הגרעינית. המדרון נגזר מן השיעור ההתחלתי ליניארי של עקומת התשואות קצב הכניסה V מקסימום לתוך הגרעין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את המדרונות V מקסימום של כל תיקון התא, נגזר שלושה עד חמישה ניסויים עצמאיים, באמצעות תוכנת גרפים לייצר מדרון אחד המייצג כל קבוצה ניסיונית. בצע כימות באמצעות ניתוח סטטיסטי חד כיווני ANOVA. </li></ol> 5. אימות חלבון ואלידציה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום 60 מנות תרבות מ&quot;מ המכילים תאים שיורית (לא נעשה שימוש בניסוי לעיל) מכל קבוצה ניסיונית על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשליך את המדיום לשטוף את התאים פעמיים עם PBS לדלל ולשטוף את המדיום שנותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטפל בתאים עם 200-400ΜL של חיץ תמוגה המכיל PBS, 0.5% Triton, ו פרוטאז מעכב קוקטייל Tablet (PI). לגרד באמצעות מגרד תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את התאים במאגר תמוגה בצינור microcentrifuge ו homogenize עם homogenizer בסל&quot;ד 4,000 דקות 1 מתחת לקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה תאים homogenized ב 2,500 xg במשך 10 דקות. איסוף supernatant, לכמת את ריכוז החלבון באמצעות assay Bradford, ולאחסן עד לשימוש ב -20 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף בין 30 ו - 70 מיקרוגרם של חלבון הכולל (תלוי בחלבון) לטעון אותו לתוך ג&#39;ל SDS-PAGE לבדיקת ביטוי חלבון באמצעות assay immunoblot. </li></ol>

<ol>
	<li>Alberts, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular biology of the cell. , (2002).</li><li>Freitas, N., Cunha, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+and+signals+for+the+nuclear+import+of+proteins.">Mechanisms and signals for the nuclear import of proteins.</a> Curr Genomics. 10, 550-557 (2009).</li><li>Kalderon, D., Roberts, B. L., Richardson, W. D., Smith, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+short+amino+acid+sequence+able+to+specify+nuclear+location.">A short amino acid sequence able to specify nuclear location.</a> Cell. 39, 499-509 (1984).</li><li>la Cour, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+and+prediction+of+leucine-rich+nuclear+export+signals.">Analysis and prediction of leucine-rich nuclear export signals.</a> Protein Eng Des Sel. 17, 527-536 (2004).</li><li>Boeynaems, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+screen+connects+nuclear+transport+genes+to+DPR+pathology+in+c9ALS/FTD.">Drosophila screen connects nuclear transport genes to DPR pathology in c9ALS/FTD.</a> Sci Rep. 6, 20877 (2016).</li><li>Freibaum, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GGGGCC+repeat+expansion+in+C9orf72+compromises+nucleocytoplasmic+transport.">GGGGCC repeat expansion in C9orf72 compromises nucleocytoplasmic transport.</a> Nature. 525, 129-133 (2015).</li><li>Jovicic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modifiers+of+C9orf72+dipeptide+repeat+toxicity+connect+nucleocytoplasmic+transport+defects+to+FTD/ALS.">Modifiers of C9orf72 dipeptide repeat toxicity connect nucleocytoplasmic transport defects to FTD/ALS.</a> Nat Neurosci. 18, 1226-1229 (2015).</li><li>Kwon, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly-dipeptides+encoded+by+the+C9orf72+repeats+bind+nucleoli,+impede+RNA+biogenesis,+and+kill+cells.">Poly-dipeptides encoded by the C9orf72 repeats bind nucleoli, impede RNA biogenesis, and kill cells.</a> Science. 345, 1139-1145 (2014).</li><li>Rossi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+accumulation+of+mRNAs+underlies+G4C2-repeat-induced+translational+repression+in+a+cellular+model+of+C9orf72+ALS.">Nuclear accumulation of mRNAs underlies G4C2-repeat-induced translational repression in a cellular model of C9orf72 ALS.</a> J Cell Sci. 128, 1787-1799 (2015).</li><li>Shi, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxic+PRn+poly-dipeptides+encoded+by+the+C9orf72+repeat+expansion+block+nuclear+import+and+export.">Toxic PRn poly-dipeptides encoded by the C9orf72 repeat expansion block nuclear import and export.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. , (2017).</li><li>Zhang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C9orf72+repeat+expansion+disrupts+nucleocytoplasmic+transport.">The C9orf72 repeat expansion disrupts nucleocytoplasmic transport.</a> Nature. 525, 56-61 (2015).</li><li>Zhang, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C9ORF72+poly(GA)+aggregates+sequester+and+impair+HR23+and+nucleocytoplasmic+transport+proteins.">C9ORF72 poly(GA) aggregates sequester and impair HR23 and nucleocytoplasmic transport proteins.</a> Nat Neurosci. 19, 668-677 (2016).</li><li>Cleveland, D. W., Rothstein, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+Charcot+to+Lou+Gehrig:+deciphering+selective+motor+neuron+death+in+ALS.">From Charcot to Lou Gehrig: deciphering selective motor neuron death in ALS.</a> Nat Rev Neurosci. 2, 806-819 (2001).</li><li>DeJesus-Hernandez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanded+GGGGCC+hexanucleotide+repeat+in+noncoding+region+of+C9ORF72+causes+chromosome+9p-linked+FTD+and+ALS.">Expanded GGGGCC hexanucleotide repeat in noncoding region of C9ORF72 causes chromosome 9p-linked FTD and ALS.</a> Neuron. 72, 245-256 (2011).</li><li>Renton, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hexanucleotide+repeat+expansion+in+C9ORF72+is+the+cause+of+chromosome+9p21-linked+ALS-FTD.">A hexanucleotide repeat expansion in C9ORF72 is the cause of chromosome 9p21-linked ALS-FTD.</a> Neuron. 72, 257-268 (2011).</li><li>Boeve, B. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+frontotemporal+dementia+and/or+amyotrophic+lateral+sclerosis+associated+with+the+GGGGCC+repeat+expansion+in+C9ORF72.">Characterization of frontotemporal dementia and/or amyotrophic lateral sclerosis associated with the GGGGCC repeat expansion in C9ORF72.</a> Brain. 135, 765-783 (2012).</li><li>Haeusler, A. R., Donnelly, C. J., Rothstein, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expanding+biology+of+the+C9orf72+nucleotide+repeat+expansion+in+neurodegenerative+disease.">The expanding biology of the C9orf72 nucleotide repeat expansion in neurodegenerative disease.</a> Nat Rev Neurosci. 17, 383-395 (2016).</li><li>Woerner, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+protein+aggregates+interfere+with+nucleocytoplasmic+transport+of+protein+and+RNA.">Cytoplasmic protein aggregates interfere with nucleocytoplasmic transport of protein and RNA.</a> Science. 351, 173-176 (2016).</li><li>Tao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleolar+stress+and+impaired+stress+granule+formation+contribute+to+C9orf72+RAN+translation-induced+cytotoxicity.">Nucleolar stress and impaired stress granule formation contribute to C9orf72 RAN translation-induced cytotoxicity.</a> Hum Mol Genet. 24, 2426-2441 (2015).</li><li>Wen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antisense+proline-arginine+RAN+dipeptides+linked+to+C9ORF72-ALS/FTD+form+toxic+nuclear+aggregates+that+initiate+in+vitro+and+in+vivo+neuronal+death.">Antisense proline-arginine RAN dipeptides linked to C9ORF72-ALS/FTD form toxic nuclear aggregates that initiate in vitro and in vivo neuronal death.</a> Neuron. 84, 1213-1225 (2014).</li></ol>

למחברים אין מה לגלות.

פרוטוקול זה מדגים assay חדש רגיש וכמותי חדש להעריך שינויים דקה התחבורה nucleocytoplasmic. באמצעות מערכת זו, ניתן לבחון ולמדוד התחבורה nucleocytoplasmic ואת תפקוד לקוי שלה בזמן אמת, לא רק פגמים גדולים המביאים לשינויים דרמטיים בחלוקה חלבון. Assay זה לא רק יש יתרון רגישות, אבל זה גם דורש הכנה ...

קומפלקס הגרעין הגרעיני (NPC) שולט ביבוא וביצוא של מולקולות גדולות אל תוך גרעין התא וממנו. בניגוד מולקולות קטנות, אשר יכול להיכנס לגרעין ללא תקנה 1 , הובלה של מולקולות גדולות נשלטת מאוד על ידי NPC. מולקולות גדולות אלה, כגון חלבונים ורנ&quot;א, מקושרות לגורמי תובלה, כולל יבואנים ויצואנים, לייבוא ​​ולייצוא מהגרעין 2 . כדי לייבא, חלבונים חייבים להכיל מוטיב פפטיד קטן, הנקרא בדרך כלל אות לוקליזציה גרעינית (NLS), אשר מחויב על ידי importins 2 . רצפים אלה של חומצות אמינו לשמש תג והם מגוונים בהרכב 3 , 4 . חלבונים ניתן לייצא מן הגרעין כדי הציטופלסמה בשל הקשר שלהם עם exportinS, אשר נקשרים רצף האות, נקרא בדרך כלל אות הייצוא הגרעיני (NES) 2 . הן importins ו exportins מסוגלים להעביר את המטען שלהם עקב הרגולציה של קטן ראס הקשורים חלבון גרעיני GTPase (רן) 2 . רן הוכח להתקיים במצבים קונפורמטיביים שונים, תלוי אם הוא קשור ל- GTP או לתוצר. כאשר מחויב ל- GTP, רן יכול להיקשר לייבוא ​​או לייצוא. עם החובה ל- RanGTP, היבואנים משחררים את מטענם, ואילו היצואנים חייבים לחייב את רנג-טאפ כדי ליצור קומפלקס עם מטען היצוא שלהם. מצב נוקליאוטיד הדומיננטי מחייב של רן תלוי במיקום שלה בגרעין (RanGTP) או הציטופלסמה (RanGDP). לאחרונה, מספר מחקרים הראו קשר בין ליקויים בנתיב nucleocytoplasmic לבין טרשת לרוחב amyotrophic (ALS) ו דמנציה frontotemporal (FTD) 5 , 6 </sup&gt; , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 . ALS היא מחלה נוירודגנרטיבית פרוגרסיבית וקטלנית המשפיעה על שני נוירונים מוטוריים עליונים ותחתונים (MNs) 13 וכתוצאה מכך שיתוק ובסופו של דבר למוות, בתוך 2-5 שנים בממוצע. רוב המקרים של ALS מסווגים כ- SPS, ללא כל קשר גנטי לכאורה, אך 10% הם בירושה באופן דומיננטי (ALS משפחתי, FALS). לאחרונה, hexanucleotide הרחבות חוזרות (HREs) של כרומוזום 9 פתוח מסגרת הקריאה 72 (C9orf72) הגן זוהו 14 , 15 כגורם גנטי של ALS ו FTD. מוטציות אלה מהווים 30-40% מהמקרים של FALS 16 , ומחקרים שונים טענוכי הם גורמים לרעילות על ידי המשפיעים על התחבורה nucleocytoplasmic 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 . מחקרים אלה הראו בעיקר את התוצאות הסופיות ואת הביטויים של HRS על התחבורה nucleocytoplasmic, אבל הם לא מראים הפרעה nucleocytoplasmic בזמן אמת. כתוצאה מכך, רק מחסור חמור nucleocytoplasmic התחבורה הוערך 11 , 17 , 18 . פרוטוקול זה מתאר חדש וישAssay רגיש להעריך להעריך לכמת nucleocytoplasmic תפקוד לקוי בזמן אמת. שיעור היבוא של NLS-NES-GFP חלבון (מעבורת-GFP) ניתן לכמת בזמן אמת באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. זה נעשה באמצעות מעכב exportin, כפי שתואר קודם לכן 18 , ובכך מאפשר המעבורת- GFP רק כדי להזין את הגרעין. באמצעות מיקרוסקופ פלורסנט תוכנה לכימות שינויי פלורסנט בזמן אמת, ניתן לכמת שינויים הדרגתיים בעוצמת הקרינה של המעבורת- GFP, הממוקם בגרעין. כתוצאה מכך, עקומת הרוויה Michaelis-Menten כמו של ציר הקרינה אל הזמן, המייצג את כמות המעבורת הגרעינית- GFP בכל זמן נתון, ניתן לבצע. באמצעות שיעור ליניארי הראשוני של הקימורים, ניתן ליצור מדרון, אשר מייצג את שיעור הכניסה לגרעין לפני הרוויה הקרינה. כדי לאמת את assay, לתרגםD C9orf72 dipeptide חוזר, פולי (GR) ו פולי (יחסי ציבור), אשר דווחו בעבר כדי לשבש את התחבורה nucleocytoplasmic, שימשו 5 , 7 , 8 , 10 , 12 . באמצעות assay זה, ירידה של 50% בשיעור היבוא הגרעיני נצפתה בהשוואה לשליטה. באמצעות מערכת זו, שינויים דקה התחבורה nucleocytoplasmic ניתן לבדוק. יתר על כן, היכולת של גורמים שונים כדי להציל פגם תחבורה nucleocytoplasmic ניתן לקבוע.

<table><tbody><tr><td>Mouse Motor Neuron-Like hybrid Cell Line (NSC-34)</td><td>tebu-bio</td><td>CLU140-A</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 4.5 g/L L-glucose</td><td>Biological Industries</td><td>01-055-1A</td><td></td></tr><tr><td>FBS European Grade</td><td>Biological Industries</td><td>04-007-1A</td><td></td></tr><tr><td>SL 16R Centrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004030</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Forma Series ii Water Jacketed CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Incubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>3111</td><td></td></tr><tr><td>Cover glass 12 mm dia., 0.13-0.17 mm thick</td><td>Bar Naor LTD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TurboFect Transfection Reagent</td><td>Thermo Scientific</td><td>&lt;a href=&quot;https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/R0531&quot;&gt;R0531&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Axiovert 100 inverted microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaging Workbench 2</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leptomycin B</td><td>Sigma</td><td>L2913</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Biological Industries</td><td>02-023-1A</td><td></td></tr><tr><td>Homogenizer motor/control/chuck/90 degree clamp</td><td>Glas-Col</td><td>099C K5424CE</td><td></td></tr><tr><td>MicroCL 17R Centrifuge, Refrigerated</td><td>Thermo Scientific</td><td>75002455</td><td></td></tr></tbody></table>

assay to measure nucleocytoplasmic transport in real time within motor neuron-like nsc-34 cells

התחבורה Nucleocytoplasmic מתייחס יבוא ויצוא של מולקולות גדולות מן הגרעין התא. לאחרונה, מספר מחקרים הראו קשר בין טרשת לרוחב האמיטרופית (ALS) לבין ליקויים במסלול nucleocytoplasmic. ALS היא מחלה נוירודגנרטיבית המשפיעה על נוירונים מוטוריים וכתוצאה מכך שיתוק ובסופו של דבר למוות, בתוך 2-5 שנים בממוצע. רוב המקרים של ALS הם ספורדיים, ללא כל קישור גנטי לכאורה, אבל 10% יורשים באופן דומיננטי. לאחרונה, hexanucleotide הרחבות חוזרות (HREs) ב chromosome 9 פתוח מסגרת הקריאה 72 (C9orf72) הגן זוהו כגורם גנטי של ALS ו דמנציה פרונטוטמפוראל (FTD). חשוב לציין, קבוצות שונות הציעו לאחרונה כי מוטציות אלה משפיעות על התחבורה nucleocytoplasmic. מחקרים אלה הראו בעיקר את התוצאה הסופית ואת הביטויים שנגרמו על ידי HRS על התחבורה nucleocytoplasmic, אבל הם לא מראים תפקוד התחבורה הגרעינית בזמן אמת. כתוצאה מכך, רק מחסור חמור nucleocytoplasmic התחבורה ניתן לקבוע, בעיקר בשל overexpression גבוה או הכנסת חלבון אקסוגני. פרוטוקול זה מתאר assay חדש ורגיש מאוד להעריך לכמת תפקוד לקוי nucleocytoplasmic בזמן אמת. שיעור היבוא של NLS-NES-GFP חלבון (מעבורת-GFP) ניתן לכמת בזמן אמת באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. זה מבוצע באמצעות מעכב exportin, ובכך מאפשר המעבורת GFP רק כדי להזין את הגרעין. כדי לאמת את assay, C9orf72 HRE מתורגם חוזר dipeptide, פולי (GR) ו פולי (PR), אשר הוכחו בעבר לשבש את התחבורה nucleocytoplasmic, שימשו. באמצעות assay המתואר, ירידה של 50% בשיעור היבוא הגרעיני נצפתה בהשוואה לשליטה. באמצעות מערכת זו, שינויים זעירים בתחבורה nucleocytoplasmic ניתן לבחון את היכולת של גורמים שונים כדי להציל (אפילו באופן חלקי) nucleocytoplasmic trפגם ansport ניתן לקבוע.

באמצעות הנוהל המוצג כאן, נוירון כמו מנוע NSC-34 תאים היו transfected עם NLS-NES-GFP (מעבורת- GFP) חלבון. חלבון זה, אשר NLS ו- NES רצפים האות ( איור 1 ), יכול מעבורת בין הגרעין לבין הציטופלזמה. Generic GFP יכול להיכנס או לצאת הגרעין בהעדר כל תג לוקליזציה רק ​​על ידי דיפו...

Watch this Scientific Journal Video about Assay to Measure Nucleocytoplasmic Transport in Real Time within Motor Neuron-like NSC-34 Cells at JoVE.com

Assay to Measure Nucleocytoplasmic Transport in Real Time within Motor Neuron-like NSC-34 Cells

פרוטוקול זה מתאר שיטה רגיש למדוד את קצב ההעברה nucleocytoplasmic בתוך נוירון כמו NSC-34 תאים תאים על ידי כימות השינוי בזמן אמת ביבוא גרעיני של חלבון NLS-NES-GFP.

Assay למדוד Nucleocytoplasmic התחבורה בזמן אמת בתוך מוטורי נוירון כמו NSC-34 תאים

Nucleocytoplasmic transport refers to the import and export of large molecules from the cell nucleus. Recently, a number of studies have shown a ...

assay-to-measure-nucleocytoplasmic-transport-real-time-within-motor

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.6K Views.  Ben-Gurion University of the Negev.  פרוטוקול זה מתאר שיטה רגיש למדוד את קצב ההעברה nucleocytoplasmic בתוך נוירון כמו NSC-34 תאים תאים על ידי כימות השינוי בזמן אמת ביבוא גרעיני של חלבון NLS-NES-GFP. 

Video: Assay to Measure Nucleocytoplasmic Transport in Real Time within Motor Neuron-like NSC-34 Cells

Nucleofection of Rodent Neuroblasts to Study Neuroblast Migration In vitro

The subventricular zone (SVZ) located in the lateral wall of the lateral ventricles plays a fundamental role in adult neurogenesis. In this restricted area of the brain, neural stem cells proliferate and constantly generate neuroblasts that migrate tangentially in chains along the rostral migratory stream (RMS) to reach the olfactory bulb (OB). Once in the OB, neuroblasts switch to radial migration and then differentiate into mature neurons able to incorporate into the preexisting neuronal network. Proper neuroblast migration is a fundamental step in neurogenesis, ensuring the correct functional maturation of newborn neurons. Given the ability of SVZ-derived neuroblasts to target injured areas in the brain, investigating the intracellular mechanisms underlying their motility will not only enhance the understanding of neurogenesis but may also promote the development of neuroregenerative strategies.
This manuscript describes a detailed protocol for the transfection of primary rodent RMS postnatal neuroblasts and the analysis of their motility using a 3D in vitro migration assay recapitulating their mode of migration observed in vivo. Both rat and mouse neuroblasts can be quickly and efficiently transfected via nucleofection with either plasmid DNA, small hairpin (sh)RNA or short interfering (si)RNA oligos targeting genes of interest. To analyze migration, nucleofected cells are reaggregated in &#39;hanging drops&#39; and subsequently embedded in a three-dimensional matrix. Nucleofection per se does not significantly impair the migration of neuroblasts. Pharmacological treatment of nucleofected and reaggregated neuroblasts can also be performed to study the role of signaling pathways involved in neuroblast migration.

Nucleofection of Rodent Neuroblasts to Study Neuroblast Migration In vitro

Neuroblast migration is a crucial step in postnatal neurogenesis. The protocol described here can be used to investigate the role of candidate regulators of neuroblast migration by employing DNA/small hairpin RNA (shRNA) nucleofection and a 3D migration assay with neuroblasts isolated from the rodent postnatal rostral migratory stream.

Nucleofection של neuroblasts מכרסמים לחקר הגירת neuroblast<em&gt; במבחנה</em

The subventricular zone (SVZ) located in the lateral wall of the lateral ventricles plays a fundamental role in adult neurogenesis. In this restricted ...

A High Content Imaging Assay for Identification of Botulinum Neurotoxin Inhibitors

Synaptosomal-associated protein-25 (SNAP-25) is a component of the soluble NSF attachment protein receptor (SNARE) complex that is essential for synaptic neurotransmitter release. Botulinum neurotoxin serotype A (BoNT/A) is a zinc metalloprotease that blocks exocytosis of neurotransmitter by cleaving the SNAP-25 component of the SNARE complex. Currently there are no licensed medicines to treat BoNT/A poisoning after internalization of the toxin by motor neurons. The development of effective therapeutic measures to counter BoNT/A intoxication has been limited, due in part to the lack of robust high-throughput assays for screening small molecule libraries. Here we describe a high content imaging (HCI) assay with utility for identification of BoNT/A inhibitors. Initial optimization efforts focused on improving the reproducibility of inter-plate results across multiple, independent experiments. Automation of immunostaining, image acquisition, and image analysis were found to increase assay consistency and minimize variability while enabling the multiparameter evaluation of experimental compounds in a murine motor neuron system.

Botulinum neurotoxin is one of the most potent toxins among Category-A biothreat agents, yet a post-exposure therapeutic is not available. The high content imaging approach is a powerful methodology for identifying novel inhibitors as it enables multiparameter screening using biologically relevant motor neurons, the primary target of this toxin.

Assay הדמיה תוכן גבוה לזיהוי של טוקסין עצבי המעכבים

Synaptosomal-associated protein-25 (SNAP-25) is a component of the soluble NSF attachment protein receptor (SNARE) complex that is essential for synaptic ...

Single-Molecule Imaging of Nuclear Transport

The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the last decade. The investigation of molecular interactions with high temporal and spatial resolutions deep within cells has remained challenging due to the inherently weak signals arising from individual molecules. Recent works by Yang et al. demonstrated that narrow-field epifluorescence microscopy allows visualization of nucleocytoplasmic transport at the single molecule level. By the single molecule approach, important kinetics, such as nuclear transport time and efficiency, for signal-dependent and independent cargo molecules have been obtained. Here we described a protocol for the methodological approach with an improved spatiotemporal resolution of 0.4 ms and 12 nm. The improved resolution enabled us to capture transient active transport and passive diffusion events through the nuclear pore complexes (NPC) in semi-intact cells. We expect this method to be used in elucidating other binding and trafficking events within cells.

Single molecule microscopy approch provided novel insights into nuclear transport.

מולקולה בודדת הדמיה התחבורה גרעיני

The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the ...

Biology

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, survival, and glial communications. To date, numerous studies have reported that defects in these systems cause various neuronal diseases. Thus, understanding the mechanisms underlying vesicle dynamics may provide influential clues that could aid in the treatment of several neuronal disorders. Here, we describe a method for quantifying vesicle motilities, such as motility distance and rate of movement, using a software plug-in for the ImageJ platform. To obtain images for quantification, we labeled neuronal endosome-lysosome structures with EGFP-tagged vesicle marker proteins and observed the movement of vesicles using a time-lapse microscopy. This method is highly useful and simplify measuring vesicle motility in neurites, such as axons and dendrites, as well as in the soma of both neurons and glial cells. Furthermore, this method can be applied to other cell lines, such as fibroblasts and endothelial cells. This approach could provide a valuable advancement of our understanding of membrane trafficking.

The investigation of membrane trafficking is crucial for understanding neuronal functions. Here, we introduce a method for quantifying vesicle motility in neurons. This is a convenient method that can be adapted to the quantification of membrane trafficking in the nervous system.

כימות של Endosome ו Lysosome Motilities ב נוירונים תרבותיים באמצעות בדיקות פלואורסצנטי

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...

A High-content Assay for Monitoring AMPA Receptor Trafficking

Postsynaptic trafficking of receptors to and from the cell surface is an important mechanism by which neurons modulate their responsiveness to different stimuli. The &#945;-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid (AMPA) receptors, which are responsible for fast excitatory synaptic transmission in neurons, are trafficked to and from the postsynaptic surface to dynamically alter neuronal excitability. AMPA receptor trafficking is essential for synaptic plasticity and can be disrupted in neurological disease. However, prevalent approaches for quantifying receptor trafficking ignore entire receptor pools, are overly time- and labor-intensive, or potentially disrupt normal trafficking mechanisms and therefore complicate the interpretation of resulting data. We present a high-content assay for the quantification of both surface and internal AMPA receptor populations in cultured primary hippocampal neurons using dual fluorescent immunolabeling and a near-infrared fluorescent 96-well microplate scanner. This approach facilitates the rapid screening of bulk internalized and surface receptor densities while minimizing sample material. However, our method has limitations in obtaining single-cell resolution or conducting live cell imaging. Finally, this protocol may be amenable to other receptors and different cell types, provided proper adjustments and optimization.

Neuronal excitability can be modulated through a dynamic process of endo- and exocytosis of excitatory ionotropic glutamate receptors. Described here is an accessible, high-content assay for quantifying surface and internal receptor population pools.

וזמינותו גבוהים-תוכן עבור ניטור אמפא קולטן סחר

Postsynaptic trafficking of receptors to and from the cell surface is an important mechanism by which neurons modulate their responsiveness to different ...

Imaging and Analysis of Neurofilament Transport in Excised Mouse Tibial Nerve

Neurofilament protein polymers move along axons in the slow component of axonal transport at average speeds of ~0.35-3.5 mm/day. Until recently the study of this movement in situ was only possible using radioisotopic pulse-labeling, which permits analysis of axonal transport in whole nerves with a temporal resolution of days and a spatial resolution of millimeters. To study neurofilament transport in situ with higher temporal and spatial resolution, we developed a hThy1-paGFP-NFM transgenic mouse that expresses neurofilament protein M tagged with photoactivatable GFP in neurons. Here we describe fluorescence photoactivation pulse-escape and pulse-spread methods to analyze neurofilament transport in single myelinated axons of tibial nerves from these mice ex vivo. Isolated nerve segments are maintained on the microscope stage by perfusion with oxygenated saline and imaged by spinning disk confocal fluorescence microscopy. Violet light is used to activate the fluorescence in a short axonal window. The fluorescence in the activated and flanking regions is analyzed over time, permitting the study of neurofilament transport with temporal and spatial resolution on the order of minutes&#160;and microns, respectively. Mathematical modeling can be used to extract kinetic parameters of neurofilament transport including the velocity, directional bias and pausing behavior from the resulting data. The pulse-escape and pulse-spread methods can also be adapted to visualize neurofilament transport in other nerves. With the development of additional transgenic mice, these methods could also be used to image and analyze the axonal transport of other cytoskeletal and cytosolic proteins in axons.

We describe fluorescence photoactivation methods to analyze the axonal transport of neurofilaments in single myelinated axons of peripheral nerves from transgenic mice that express a photoactivatable neurofilament protein.

הדמיה וניתוח של תעבורת Neurofilament בעצב שוקה עכבר excised

Neurofilament protein polymers move along axons in the slow component of axonal transport at average speeds of ~0.35-3.5 mm/day. Until recently the study ...

Nuclear Transport Assays in Permeabilized Mouse Cortical Neurons

Disruption of nucleocytoplasmic transport is increasingly implicated in the pathogenesis of neurodegenerative diseases. Moreover, there is a growing recognition of cell-specific differences in nuclear pore complex structure, prompting a need to adapt nuclear transport methods for use in neurons. Permeabilized cell assays, in which the plasma membrane is selectively perforated by digitonin, are widely used to study passive and active nuclear transport in immortalized cell lines but have not been applied to neuronal cultures. In our initial attempts, we observed the rapid loss of nuclear membrane integrity in primary mouse cortical neurons exposed to even low concentrations of digitonin. We hypothesized that neuronal nuclear membranes may be uniquely vulnerable to the loss of cytoplasmic support. After testing multiple approaches to improve nuclear stability, we observed optimal nuclear integrity following hypotonic lysis in the presence of a concentrated bovine serum albumin cushion. Neuronal nuclei prepared by this approach reliably import recombinant fluorescent cargo in an energy-dependent manner, facilitating analysis of nuclear import by high content microscopy with automated analysis. We anticipate that this method will be broadly applicable to studies of passive and active nuclear transport in primary neurons.

We have developed a reliable method of selective plasma membrane permeabilization of primary mouse cortical neurons for high content automated analysis of neuronal nucleocytoplasmic transport.

Disruption of nucleocytoplasmic transport is increasingly implicated in the pathogenesis of neurodegenerative diseases. Moreover, there is a growing ...

Real-Time Fluorescent Measurement of Synaptic Functions in Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis

Before neuronal degeneration, the cause of motor and cognitive deficits in patients with amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and/or frontotemporal lobe dementia (FTLD) is dysfunction of communication between neurons and motor neurons and muscle. The underlying process of synaptic transmission involves membrane depolarization-dependent synaptic vesicle fusion and the release of neurotransmitters into the synapse. This process occurs through localized calcium influx into the presynaptic terminals where synaptic vesicles reside. Here, the protocol describes fluorescence-based live-imaging methodologies that reliably report depolarization-mediated synaptic vesicle exocytosis and presynaptic terminal calcium influx dynamics in cultured neurons.
Using a styryl dye that is incorporated into synaptic vesicle membranes, the synaptic vesicle release is elucidated. On the other hand, to study calcium entry, Gcamp6m is used, a genetically encoded fluorescent reporter. We employ high potassium chloride-mediated depolarization to mimic neuronal activity. To quantify synaptic vesicle exocytosis unambiguously, we measure the loss of normalized styryl dye fluorescence as a function of time. Under similar stimulation conditions, in the case of calcium influx, Gcamp6m fluorescence increases. Normalization and quantification of this fluorescence change are performed in a similar manner to the styryl dye protocol. These methods can be multiplexed with transfection-based overexpression of fluorescently tagged mutant proteins. These protocols have been extensively used to study synaptic dysfunction in models of FUS-ALS and C9ORF72-ALS, utilizing primary rodent cortical and motor neurons. These protocols easily allow for rapid screening of compounds that may improve neuronal communication. As such, these methods are valuable not only for the study of ALS but for all areas of neurodegenerative and developmental neuroscience research.

Two related methods are described to visualize subcellular events required for synaptic transmission. These protocols enable the real-time monitoring of the dynamics of presynaptic calcium influx and synaptic vesicle membrane fusion using live-cell imaging of in vitro cultured neurons.

מדידה פלואורסצנטית בזמן אמת של פונקציות סינפטיות במודלים של טרשת אמיוטרופית לרוחב

Before neuronal degeneration, the cause of motor and cognitive deficits in patients with amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and/or frontotemporal lobe ...

Expanding the Toolkit for In Vivo Imaging of Axonal Transport

Axonal transport maintains neuronal homeostasis by enabling the bidirectional trafficking of diverse organelles and cargoes. Disruptions in axonal transport have devastating consequences for individual neurons and their networks, and contribute to a plethora of neurological disorders. As many of these conditions involve both cell autonomous and non-autonomous mechanisms, and often display a spectrum of pathology across neuronal subtypes, methods to accurately identify and analyze neuronal subsets are imperative.
This paper details protocols to assess in vivo axonal transport of signaling endosomes and mitochondria in sciatic nerves of anesthetized mice. Stepwise instructions are provided to 1) distinguish motor from sensory neurons in vivo, in situ, and ex vivo by using mice that selectively express fluorescent proteins within cholinergic motor neurons; and 2) separately or concurrently assess in vivo axonal transport of signaling endosomes and mitochondria. These complementary intravital approaches facilitate the simultaneous imaging of different cargoes in distinct peripheral nerve axons to quantitatively monitor axonal transport in health and disease.

Expanding the Toolkit for In Vivo Imaging of Axonal Transport

Using transgenic fluorescent mice, detailed protocols are described to assess in vivo axonal transport of signaling endosomes and mitochondria within motor and sensory axons of the intact sciatic nerve in live animals.

הרחבת ערכת הכלים להדמיית In Vivo של תחבורה אקסונלית

Axonal transport maintains neuronal homeostasis by enabling the bidirectional trafficking of diverse organelles and cargoes. Disruptions in axonal ...

Measuring Axonal Cargo Transport in Mouse Primary Cortical Cultured Neurons

Neuronal cells are highly polarized cells that stereotypically harbor several dendrites and an axon. The length of an axon necessitates efficient bidirectional transport by motor proteins. Various reports have suggested that defects in axonal transport are associated with neurodegenerative diseases. Also, the mechanism of the coordination of multiple motor proteins has been an attractive topic. Since the axon has uni-directional microtubules, it is easier to determine which motor proteins are involved in the movement. Therefore, understanding the mechanisms underlying the transport of axonal cargo is crucial for uncovering the molecular mechanism of neurodegenerative diseases and the regulation of motor proteins. Here, we introduce the entire process of axonal transport analysis, including the culturing of mouse primary cortical neurons, transfection of plasmids encoding cargo proteins, and directional and velocity analyses without the effect of pauses. Furthermore, the open-access software "KYMOMAKER" is introduced, which enables the generation of a kymograph to highlight transport traces according to their direction and allow easier visualization of axonal transport.

The present protocol describes the whole procedure of analysis for axonal transport. In particular, the calculation of transport velocity, not including the pausing, and the visualization method using open-access software "KYMOMAKER" are shown here.