Name: quantification of endosome and lysosome motilities in cultured neurons using fluorescent probes
Uploaded: 2017-05-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes at JoVE.com

Bu analizin geliştirilmesine yardımcı olduğumuz Dr. Ricardo Dolmetsch&#39;e (Stanford Üniversitesi Tıp Fakültesi, bugünkü üyelik: Novartis Biyomedikal Araştırmalar Enstitüsü) ve makalenin eleştirel okumalarından dolayı Dr. Matthew Wood, Takuma Aihara ve Dongsook Kim&#39;e teşekkür ediyoruz.

Tüm hayvan işlemleri, Tsukuba Üniversitesi Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) onayı ile gerçekleştirildi. 1. Diseksiyon <ol><li> Embriyonik 13-14 ICR veya C57BL / 6 fetüslerini hazırlamak için servikal dislokasyonla hamile fareleri euthanize edin. Uterusu çıkarıp Hank&#39;in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) ile bir petri tabağına koyun. Kanı temizlemek için iyice durulayın. </li><li> Forseps kullanarak sterilize etmek için rahim% 70 etanol ile yeni bir petri kabına aktarın. </li><li> Uterusu HBSS ile yeni bir petri kabına aktarın. Fetusları sterilize edilmiş diseksiyon forsepsleri ve cerrahi makas kullanarak uterusdan alın. </li><li> Cerrahi makas kullanarak fötusları dekapetleyin. Bunları HBSS ile yeni bir petri kabına koyun. </li><li> Deriyi ve kafatayı çıkarın ve sterilize edilmiş diseksiyon forsepsini kullanarak beyinlerini çıkarın. HBSS ile bir petri tablasına koyun. NOT: Bu adımdan itibaren, işlemi temizlemek için en iyisidirBank. </li><li> Stero mikroskop altında sterilize edilmiş diseksiyon forseps kullanarak meninksleri çıkarın. Forseps kullanarak bazal gangliyon, hipokampus ve serebellumu kesin. Kıvrımlı uçlu forseps kullanarak, korteksleri HBSS ile yeni bir petri kabına aktarın. </li><li> Tek kullanımlık bir damlalık veya 25 mL&#39;lik bir pipet kullanarak tüm korteksleri toplayın. Onları 15 mL&#39;lik bir tüp içine koyun ve daha sonra pipetle HBSS&#39;yi çıkarın. </li><li> Korteksleri içeren tüp üzerine 3 mL serebral kortikal enzim çözeltisi ekleyin. Bu tüp bir su banyosu içine koyun ve 37 ° C&#39;de 5 dakika inkübe edin. NOT:% 0.25 tripsin ve 1 mM EDTA ile Fosfat Tamponlu Tuz (PBS) içeren bir serebral kortikal kültür enzimi hazırlayın. 0.22 μm&#39;lik bir filtreyle sterilize edin. </li><li> Korteks içeren tüp içine serebral kortikal enzim solüsyonu ilave 3 mL ekleyin ve ilave bir 5 dakika boyunca bir su banyosu 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> 5 mL&#39;lik bir pipet kullanarak serebral kortikal enzim solüsyonunu çıkarın ve 5 mL Dulbe&#39;yi ekleyin% 10 Fetal Sığır Serumu (FBS) içeren cco&#39;nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM). </li><li> Steril bir P1000 ucu olan 5 mL&#39;lik bir pipet kullanarak hafifçe pipetleme yaparak korteklikleri çözün. P200 ucu olan 5 mL pipet kullanarak tekrar pipetleyin. </li><li> 50 mL&#39;lik bir tüp üzerine 40 μm&#39;lik bir naylon hücre süzgeci koyun ve enkazı çıkarmak için süspansiyonu filtreleyin. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 420 xg&#39;de santrifüjleyin ve daha sonra DMEM ortamını çıkarın. </li><li> Serebral kortikal kültür ortamı 5 mL ekleyin ve yavaşça hücre peletini tekrar süspansiyon haline getirin. NOT: 1x B-27 takviyeleri, 2 mM L-glutamin ve 100 U / mL penisilin streptomis ile desteklenmiş nöron bazal ortamdan oluşan serebral bir kortikal kültür ortamı hazırlayın. </li><li> Hemocytometer kullanarak hücreleri sayın ve serebral kortikal kültür ortamı kullanarak hücre konsantrasyonunu (arzu edildiği gibi) ayarlayın. </li><li> Tabak başına 3.0 x 10 6 cortical nöron, kaplanmış 35 mm cam tabaka kaplarında 2.0 mL&#39;dir. NOT: Kaplamadan önce,0.1 mg / mL Poli-D-Lizin hidrobromid (PDL) veya% 0.01 Poli-L-Ornitin (PLO) ile 35 mm.lik cam tabanlı tabaklar. 3 saat süreyle inkübe edin - O / N, 37 ° C&#39;de ve PBS ile en az 3 kez yıkayın. </li></ol> 2. Görüntüleme Vesikül Hareketi <ol><li> Her vezikül türünü etiketleyecek plazmidleri hazırlayın. Örneğin, erken endozomlar için EGFP-Rab5, geç endozomlar için EGFP-Rab7, lizozomlar için LAMP-EGFP ve otofagozomlar 8 , 13 için EGFP-LC3 kullanın. NOT: Bu plasmidler tsuruta.fuminori.fn@u.tsukuba.ac.jp adresinden talep edilebilir. Tipik olarak, 3 ila 5 gün in vitro (DIV) nöronlar bu plazmidlerle transfeksiyon reaktifleri kullanılarak transfekte edilebilir. </li><li> Pipetleme ile 4.0 μg plazmid 200 μL serum barındırmayan ortam ile karıştırılır. Ayrı bir tüpte, 200 μL serum serbest ortamda 8 μL transfeksiyon reaktifini (bkz . Malzeme Tablosu ) seyreltin . Oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. </li><li> Plazmid çözeltisini ve transfeksiyon rejent solüsyonunu pipetleme ile adım 2.2&#39;de karıştırın. Oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. </li><li> Her kaplanmış cam alt tabağa saf olmayan ortam ve adım 2.3&#39;ten 400 μL plazmid çözeltisi ilave edin. Nöronları 37 ° C&#39;de 30 dakika boyunca% 5 CO2 inkübatörde inkübe edin. Ortamı 2 mL serebral kortikal kültür ortamı ile değiştirin. Nöronları 37 ° C&#39;de% 5 CO2 inkübatöre 1-2 gün inkübe edin. </li><li> 1 - 2 d transfeksiyondan sonra, transfekte edilen hücreleri görüntü alımı için seçin. NOT: 7 DIV&#39;den küçük erken sinir hücreleri, dinamik vezikül hareketliliğini gösterme eğilimindedir. Floresans probunu orta derecede ifade eden nöronları seçin, çünkü oldukça ifade eden bir nöron seçildiğinde net görüntüler elde edilemez. Ayrıca, akson ve dendritlerin tanımlanmasını kolaylaştırmak için uzun aksonları ve karmaşık dendritleri olan piramidal nöronlar gibi tipik bir nöronal şekli seçin (bakınız Şekil 1A). </li><li> Bir zaman atlamalı görüntüleme sistemi kullanarak görüntü elde etme: Görüntüleme için, 40X Plan Apo 0.95NA veya 100X Plan Apo VC NA1.4 objektif mercekleri bulunan bir Charge-Coupled Device (CCD) kamera ile donatılmış bir fluoresans mikroskop kullanın. Bir inkübasyon sistemi kullanılarak sıcaklığı 37 ° C&#39;de kontrol edin. Görüntü edinme yazılımı tarafından kontrol edilen 100 saniyelik bir periyot boyunca bir çerçeve / 5 sn&#39;de nöron görüntüleri elde edin. Alternatif olarak, görüntüleri daha kısa aralıklarla ve 300 saniyelik bir süre boyunca 2 s&#39;de bir karede olduğu gibi daha uzun zaman periyotlarında elde edebilirsiniz. NOT: Ardışık resimler çekmek için çeşitli uygulamalar kullanılabilir, bunların çoğu bu yöntem için uygundur. Bu nedenle, özel bir uygulama önerilmemektedir; Bunun yerine, her araştırmacı mevcut olan her hangi bir uygulamayı kullanmalıdır. </li></ol> 3. Görüntü Analizi <ol><li> Manifest İzleme 14 ile ImageJ yazılımındaki ardışık görüntüleri açın. NOT: Bugüne kadar, Manuel TakipDeneyleri 15 , 16 , 17 , 18 , 19&#39;da kullanılan dely. Elle İzleme Dr. Fabrice Cordelières tarafından geliştirildi. Ayrıntılı yazılı talimatlar çevrimiçi 20&#39;de mevcuttur. Analiz için görüntüleme verisinin kalitesi yeterli sayıda görüntü ile geliştirilir. 20&#39;den fazla resim kullanmanız önerilir. </li><li> Sıralı resimleri birleştirmek için &lt;Görüntü&gt; → &lt;Yığınlar&gt; → &lt;Yığın Görüntüler&gt; seçimini yapın. &lt;Tamam&gt; &#39;ı tıklayın. </li><li> &lt;Eklentiler&gt; → &lt;Manuel İzleme&gt; seçimini yapın; Bir izleme penceresi açılacaktır. </li><li> &lt;Göster Parametreleri?&gt; Onay kutusunu tıklayın ve parametreler bölümünde izleme parametrelerini tanımlayın. NOT: Zaman aralığı, x / y kalibrasyonu, z kalibrasyonu, merkez için arama kare boyutu dahil olmak üzere birçok parametre ayarlanabilirIng, nokta boyutu, çizgi genişliği ve yazı tipi boyutu. Bu basitleştirilmiş analizde hem zaman aralığı hem de x / y kalibrasyonu tanımlandı. Diğer deneysel koşullar altında, diğer parametreleri de tanımlamak gerekebilir. Burada kullanılan parametreler aşağıdaki gibidir: &lt;Zaman aralığı&gt; 5 s&#39;dir ve &lt;x / y ayarı&gt; 40X Plan Apo 0.95NA objektif lensi için 0.26642 μm veya 100X Plan Apo VC NA1.4 için 0.10657 μm&#39;dir objektif lens. </li><li> Parametreler tanımlandıktan sonra, yeni bir parça başlatmak için &lt;Parça Ekle&gt; &#39;ye tıklayın. </li><li> İlgili salyangozları belirledikten sonra ( örneğin, Şekil 1A&#39;daki mavi ve kırmızı ok uçlarıyla gösterilen veziküller (sağ panel)), xy koordinatlarını kaydetmek için ardışık görüntülerdeki sinyallerin ortasına tıklayın. Kaydedilen XY koordinatlarının, mesafenin ve hızın sonuçları yeni bir pencerede gösterilir. NOT: Lizozom durumunda, büyük parlak floresan sinyalleri ( ör. Fig.Ür 1A (sağ panel), turuncu ok başı) nöronlarda sıklıkla görülür. Bu sinyaller bazen ya biriken veziküller ya da patolojik varikoziteler sergilediğinden, motiliteyi nicelleştirmek için bu sinyallerden kaçınılmalıdır. </li><li> Tüm ardışık görüntülerden veziküllerin xy koordinatlarını toplamak için 3.6 adımını tekrarlayın; Her görüntü, referans noktası seçildikten sonra otomatik olarak ardışık görüntüye geçer. </li><li> Bu verileri yeni bir tabloya ( örneğin, bir e-tablo) dışa aktarın. Uygun bir grafik oluşturmak için uygun bir yazılım kullanın (bkz . Malzeme Listesi ). NOT: Verileri analiz etmek için &lt;Uzaklık&gt; sütununu seçin, bu sütunun tüm değerlerini özetleyin ve bir hareketlilik mesafesini çubuk grafik olarak gösterin (ör. Şekil 1B) . Ek olarak, bu adımı tekrarlayın, toplam hareketlilik mesafesinin ortalamasını hesaplayın ve Şekil 1C&#39;deki gibi bir çubuk grafiği olarak gösterin. Çubuk grafik ve dalga formu verileri oluşturmak için yazılımMalzeme Tablosu. </li></ol>

<ol>
	<li>Nicot, A. S., Laporte, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endosomal+phosphoinositides+and+human+diseases.">Endosomal phosphoinositides and human diseases.</a> Traffic. 9 (8), 1240-1249 (2008).</li><li>De Matteis, M. A., Luini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mendelian+disorders+of+membrane+trafficking.">Mendelian disorders of membrane trafficking.</a> N Engl J Med. 365 (10), 927-938 (2011).</li><li>Lebrand, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Late+endosome+motility+depends+on+lipids+via+the+small+GTPase+Rab7.">Late endosome motility depends on lipids via the small GTPase Rab7.</a> EMBO J. 21 (6), 1289-1300 (2002).</li><li>Chen, C. S., Bach, G., Pagano, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+transport+along+the+lysosomal+pathway+in+mucolipidosis,+type+IV+disease.">Abnormal transport along the lysosomal pathway in mucolipidosis, type IV disease.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (11), 6373-6378 (1998).</li><li>Venugopal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurologic,+gastric,+and+opthalmologic+pathologies+in+a+murine+model+of+mucolipidosis+type+IV.">Neurologic, gastric, and opthalmologic pathologies in a murine model of mucolipidosis type IV.</a> Am J Hum Genet. 81 (5), 1070-1083 (2007).</li><li>Li, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+mechanism+to+regulate+lysosome+motility+for+lysosome+positioning+and+tubulation.">A molecular mechanism to regulate lysosome motility for lysosome positioning and tubulation.</a> Nat Cell Biol. 18 (4), 404-417 (2016).</li><li>Tsuruta, F., Green, E. M., Rousset, M., Dolmetsch, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PIKfyve+regulates+CaV1.2+degradation+and+prevents+excitotoxic+cell+death.">PIKfyve regulates CaV1.2 degradation and prevents excitotoxic cell death.</a> J Cell Biol. 187 (2), 279-294 (2009).</li><li>Tsuruta, F., Dolmetsch, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PIKfyve+mediates+the+motility+of+late+endosomes+and+lysosomes+in+neuronal+dendrites.">PIKfyve mediates the motility of late endosomes and lysosomes in neuronal dendrites.</a> Neurosci Lett. 605, 18-23 (2015).</li><li>McCartney, A. J., Zhang, Y., Weisman, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatidylinositol+3,5-bisphosphate:+low+abundance,+high+significance.">Phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate: low abundance, high significance.</a> Bioessays. 36 (1), 52-64 (2014).</li><li>Shisheva, A., Sbrissa, D., Ikonomov, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plentiful+PtdIns5P+from+scanty+PtdIns(3,5)P2+or+from+ample+PtdIns?+PIKfyve-dependent+models:+Evidence+and+speculation+(response+to:+DOI+10.1002/bies.201300012).">Plentiful PtdIns5P from scanty PtdIns(3,5)P2 or from ample PtdIns? PIKfyve-dependent models: Evidence and speculation (response to: DOI 10.1002/bies.201300012).</a> Bioessays. 37 (3), 267-277 (2015).</li><li>Chow, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+of+FIG4+causes+neurodegeneration+in+the+pale+tremor+mouse+and+patients+with+CMT4J.">Mutation of FIG4 causes neurodegeneration in the pale tremor mouse and patients with CMT4J.</a> Nature. 448 (7149), 68-72 (2007).</li><li>Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+Vac14,+a+regulator+of+the+signaling+lipid+phosphatidylinositol+3,5-bisphosphate,+results+in+neurodegeneration+in+mice.">Loss of Vac14, a regulator of the signaling lipid phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate, results in neurodegeneration in mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (44), 17518-17523 (2007).</li><li>Mizushima, N., Yamamoto, A., Matsui, M., Yoshimori, T., Ohsumi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+analysis+of+autophagy+in+response+to+nutrient+starvation+using+transgenic+mice+expressing+a+fluorescent+autophagosome+marker.">In vivo analysis of autophagy in response to nutrient starvation using transgenic mice expressing a fluorescent autophagosome marker.</a> Mol Biol Cell. 15 (3), 1101-1111 (2004).</li><li>. Manual Tracking, a plug-in for ImageJ software [Internet] Available from: <a target="_blank" href="https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/track.html">https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/track.html</a> (2017)</li><li>Hu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exopolysaccharide-independent+social+motility+of+Myxococcus+xanthus.">Exopolysaccharide-independent social motility of Myxococcus xanthus.</a> PLoS One. 6 (1), e16102 (2011).</li><li>Tan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+four+type+IV+pilin+homologues+in+Stigmatella+aurantiaca+DSM17044+by+heterologous+expression+in+Myxococcus+xanthus.">Characterization of four type IV pilin homologues in Stigmatella aurantiaca DSM17044 by heterologous expression in Myxococcus xanthus.</a> PLoS One. 8 (9), e75105 (2013).</li><li>Choi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+variant+of+cortactin+linked+to+acute+lung+injury+impairs+lamellipodia+dynamics+and+endothelial+wound+healing.">A genetic variant of cortactin linked to acute lung injury impairs lamellipodia dynamics and endothelial wound healing.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 309 (9), L983-L994 (2015).</li><li>Dahirel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Movement+propensity+and+ability+correlate+with+ecological+specialization+in+European+land+snails:+comparative+analysis+of+a+dispersal+syndrome.">Movement propensity and ability correlate with ecological specialization in European land snails: comparative analysis of a dispersal syndrome.</a> J Anim Ecol. 84 (1), 228-238 (2015).</li><li>Hu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+between+type+IV+pili+activity+and+exopolysaccharides+secretion+controls+motility+patterns+in+single+cells+of+Myxococcus+xanthus.">Interplay between type IV pili activity and exopolysaccharides secretion controls motility patterns in single cells of Myxococcus xanthus.</a> Sci Rep. 6, 17790 (2016).</li><li>. Manual Tracking [Internet] Available from: <a target="_blank" href="https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/Manual">https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/Manual</a> (2017)</li><li>. ImageJ Tracking plug-in [Internet] Available from: <a target="_blank" href="https://imagej.net/Category:Tracking">https://imagej.net/Category:Tracking</a> (2017)</li><li>Tinevez, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TrackMate:+An+open+and+extensible+platform+for+single-particle+tracking.">TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking.</a> Methods. , (2016).</li><li>Ekvall, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+tracking+of+small+aquatic+organisms+using+fluorescent+nanoparticles.">Three-dimensional tracking of small aquatic organisms using fluorescent nanoparticles.</a> PLoS One. 8 (11), e78498 (2013).</li><li>Jeyakumar, M., Dwek, R. A., Butters, T. D., Platt, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Storage+solutions:+treating+lysosomal+disorders+of+the+brain.">Storage solutions: treating lysosomal disorders of the brain.</a> Nat Rev Neurosci. 6 (9), 713-725 (2005).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Bu protokol vezikül hareketliliğini ölçmek için prosedür tanıtır. Primer nöronlarda, endozomlar ve lizozomlar, genç nöronlarda yüksek motilite gösterme eğilimindedir (4-6 DIV). Sinirsel süreçleri uzatmak için nöronların öncü kısımlara bazı bileşenler vermesi gerektiği göz önüne alındığında, bu aşamada zar ticareti dinamik bir şekilde gerçekleşmelidir. Bu nedenle, genç nöronları nöronal dendritlerde dinamik motilite gözlemlemek için kullanmak önemlidir. Buna ek olarak, daha büyük veziküller, daha genç sinir hücrelerinde bile yüksek motilite gösterme eğiliminde değildirler. Vesikül boyutunun düzenlenmesi muhtemelen füzyon-fisyon adımlarının frekansı ile ilgilidir. Dinamik olarak hareket etmeyen spesifik veziküller, diğer vezikülleri kolayca kabul edebilir ve hareketlerini sona erdirebilir. Böylece, veziküllerin seçilmesi bu analiz için önemli bir işlemdir. Nesneleri izlemek için birkaç ücretsiz eklenti yazılım paketi mevcuttur 21 . Örneğin, İzMate paketi nesneleri 22 izleyebilir ve bir dizi matematiksel bilgi sağlayarak sayısal yazılımla değiştirilebilir. Öte yandan, bu protokolde nispeten basit bir görüntü analizi için kullanımı biraz karmaşıktır. Mtrack2 başka bir eklentidir ve MultiTracker eklentisine 23 dayalıdır. Mtrack2, hedefleri belirleyebildiğinden ve takip eden karelerde hangi hedeflerin en yakın olduğunu belirleyebildiği için de yararlıdır. Bu yaklaşım, muazzam miktarda veriyi ölçmek için kullanışlıdır; Bununla birlikte, manuel izleme daha küçük hacimlerde görüntü verilerinde daha güvenilir olabilir. Bu nedenle, daha küçük veri kümelerini belirlemek için Manuel İzleme&#39;yi öneriyoruz ve daha büyük hacimleri izlemek için diğer yazılımları kullanmanın daha iyi olabileceğini kabul ediyoruz. Bu yaklaşımda çeşitli önlemler alınmalıdır. İlk olarak, sıkı veriler elde etmek için örnekleme oranı yüksek olmalıdır. Bunun nedeni, bazı veziküller hızlı hareket sergilemek veFüzyon fisyonu ve görünüm-kaybolma olayları gibi ani değişiklikler gözlemlenmekte ve sık görülen görüntülemenin herhangi bir değişikliğin işaretini kaçırmamak için çok önemli olduğunu göstermektedir. Bir başka nokta, tarama-diskli konfokal mikroskoplar ve toplam iç yansıma flüoresan mikroskopları gibi yüksek-sonlu mikroskopların kullanılması, yüksek çözünürlüklü, ilginç veriler elde etmek için anahtar olabileceğidir. Donanımsal sınırlamalardan ötürü her 5 saniyede görüntüler alınmasına rağmen, üst düzey bir mikroskop kullanılarak daha kısa aralıklarla görüntüler almanız önerilir. Büyük araştırmalar zar travmatiği ve nöronal bozukluklar arasında biyolojik bir bağ olduğunu ileri sürmüştür 2 . Örneğin, lizozomal defektlerin, Niemann-Pick hastalığı ve Gaucher hastalığı 24 gibi ağır nöronal bozukluklarda yer aldığı gösterilmiştir. İlginç olarak, birçok çalışma, lizozomal hareketin ve lokalizasyonun,Lizozomal depolama bozukluğunun başlangıcı 6 . Vesikül hareketliliğinin bu bozuklukların bir biyolojik belirteçi olarak kullanılabilmesi mümkündür. İnsan kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerin (iPSC&#39;lerin) varlığı ilginç bir yaklaşım ortaya çıkabilir. IPSC&#39;lerden türetilmiş nöronlar kullanarak vezikül hareketliliğini araştırmak, lizozomal depolama bozuklukları için bir biyolojik belirteç ortaya koyabilir. Bu yaklaşım, hastalık riskinin altında yatan süreçlere bazı ipuçları sağlar. Bu tahlil basit olduğu için hareketlilik verisi elde etmek kolaydır. Ayrıca, göç ve morfolojik değişiklikler de dahil olmak üzere diğer hücresel olayların analizi için de geçerlidir. Bu yaklaşımın basitliği nedeniyle çeşitli sınırlamaları olduğunu unutmamak önemlidir. Bu nedenle, nöronal trafik işleminin kesin fizyolojik önemini anlamak için elektrofizyoloji, biyokimya ve elektron mikroskop analizi gibi diğer yaklaşımları kullanmak gereklidir. Bununla birlikte, bu yaklaşım değerli bir yöntemdirBu, trafik işlemlerini doğrudan ve zaman etkili bir şekilde analiz etmek isteyen araştırmacılar için uygundur.

Endozom-lizozom ticaretinin hassas kontrolü, nöronal fonksiyonu düzenlemek için vazgeçilmezdir. Özellikle, bu veziküllerin dinamik hareketi, nöronal morfolojinin, gelişimin ve hayatta kalmanın düzenlenmesinde temel faktördür. Bu sistemdeki kusurlar ciddi nöronal bozukluklara neden olur 1 , 2 . Vezikül ticaretini nöronal hastalıklarla ilişkilendiren moleküler mekanizmalar karmaşık kabul edilir ve birçok grup bu önemi incelemeye çalıştı. Örneğin, tedirgin geç endozom motilitesinin, lizozom defektlerinin yol açtığı kalıtsal bir nörodejeneratif bozukluk olan Niemann-Pick C hastalığı 3 ile önemli derecede ilişkili olduğu bildirilmiştir. Başka bir örnek, lizozomal Ca 2+ kanalındaki trpml 1&#39;deki mutasyon olup, lizozomal hareketliliği bozarak lizozomal depolama hastalıkları 4 , 5 , </Sup&gt; 6 . Grubumuz PtdIns&#39;in (3,5) P 2 devresinin düzenlenmesinin nöronlarda endozom ve lizozom motilitesini baskıladığını ve bunun da stres tepkisine karşı savunmasızlıktan 7 , 8 arttığını bildirmiştir. Çoğunlukla geç endozomlar ve lizozomlarda lokalize olan PtdIns (3,5) P2&#39;nin metabolik düzenlenmesi, vezikül ticareti ve füzyon-fisyon işlemleri gibi çok çeşitli hücresel işlevlerde önemli bir rol oynamaktadır 9,10. Zayıflamış PtdIns (3,5) P 2 ciro şiddetli nörodejenerasyon 11,12&#39;ye neden olduğu için, endozom-lizozom motilitesinin sapması regülasyonu, nörodejenerasyon patogenezini anlamak için önemli bir faktör olabilir. Vesikül hareketliliğinin altında yatan moleküler mekanizmaların araştırılması, bu nedenle, bizim vefizimizi derinleştiren umut verici ipuçları sağlayabilirBirkaç nöronal rahatsızlığın kavranması. Bu yazıda, Manuel İzleme adlı özgür yazılım paketini kullanarak nöronlarda vezikül hareketliliğini ölçmek için değerli bir yöntem sunuyoruz. Amaç, vezikül hareketliliğini analiz etmek için hızlı bir kantifikasyon yöntemi geliştirmekti. Bu niceleme, zaman atlamalı filmin her karesinde bir referans noktasına tıklayarak standart bir yaklaşımla yönlendirilir. Manuel İzleme yazılımının kullanılması, bu yaklaşımı diğer uygulamalardan farklı olarak oldukça basit ve geniş yarar sağlar. Dahası, bu yaklaşım glial hücreler gibi diğer hücrelere de uygulanabilir. Bu yöntem ilkel olmasına rağmen, hücresel motilite ve morfolojik değişim de dahil olmak üzere çeşitli analizlere uygulanabilir. Örneğin, bir görüntü dizisi boyunca bir referans noktası tanımladıktan sonra, referans noktalarının konumları ve her bir konumdaki zamana ilişkin bilgiler, veri analizi ve görüntü işleme yumuşaklığı kullanılarak ardışık görüntülerden çıkarılabilirmaldır. Birlikte ele alındığında, bu yöntem basit ama güçlüdür ve endosome-lizozom fonksiyonunu inceleyenler gibi membran ticaretine dayalı çalışmaların geliştirilmiş etkinliğinin geliştirilmesine katkıda bulunur.

<table><tbody><tr><td>Neurobasal medium</td><td>Thermo Fisher</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s modified eagle medium (DMEM)</td><td>Wako</td><td>044-29765</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Thermo Fisher</td><td>31985070</td><td>Serum free medium</td></tr><tr><td>Hank&#039;s balanced salt solution (HBSS)</td><td>Thermo Fisher</td><td>14170112</td><td></td></tr><tr><td>Penicilin Streptmycin</td><td>Thermo Fisher</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Thermo Fisher</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Supplements</td><td>Thermo Fisher</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>2.5% Trypsine</td><td>Thermo Fisher</td><td>15090046</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine hydrobromide (PDL)</td><td>Sigma</td><td>P7280</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Ornithine (PLO)</td><td>Sigma</td><td>P4957</td><td></td></tr><tr><td>Nylon cell strainer</td><td>Corning</td><td>431750</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Thermo Fisher</td><td>11668027</td><td>Transfection reagent</td></tr><tr><td>Polyethyleneimine &quot;Max&quot; (PEI)</td><td>polysciences</td><td>24765</td><td>Transfection reagent. As an alternative to Lipofectamine2000, 0.1mg/mL Polyethyleneimine dissolved in sterilized water is available. But it is low efficiency and high toxicity.</td></tr><tr><td>BIOREVO BZ-9000</td><td>Keyence</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Incubation system INUG2-K13</td><td>Tokay Hit</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism version 6.0</td><td>GraphPad Software</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Excel version 15</td><td>Microsoft</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ verion 1.47</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

quantification of endosome and lysosome motilities in cultured neurons using fluorescent probes

Beyinde, zar ticaret sistemi, nöronal morfoloji, sinaptik esneklik, hayatta kalma ve glial iletişim gibi nöronal fonksiyonların düzenlenmesinde önemli roller oynar. Bugüne kadar çok sayıda çalışma, bu sistemlerin kusurlarının çeşitli nöronal hastalıklara neden olduğunu bildirmiştir. Böylece vezikül dinamiklerinin altında yatan mekanizmaları anlamak, çeşitli nöronal bozuklukların tedavisinde yardımcı olabilecek etkili ipuçları sağlayabilir. Burada, hareket noktası mesafesi ve hareket hızı gibi vezikül hareketlerini ImageJ platformu için bir yazılım eklentisi kullanarak ölçmek için bir yöntem açıklıyoruz. Niceleme için görüntü elde etmek için, EGFP ile etiketlenmiş vezikül işaretleyici proteinleri olan nöronal endozom-lizozom yapılarını etiketledik ve veziküllerin bir zaman atlamalı mikroskobi ile hareketi gözlemledik. Bu yöntem son derece yararlıdır ve aksonlar ve dendritler gibi nöritlerin ve hem nöronların hem de glial hücrelerin soma&#39;sındaki vezikül hareketliliğinin ölçülmesini basitleştirir. FurthermoYeniden, bu yöntem fibroblastlar ve endotel hücreleri gibi diğer hücre hatlarına da uygulanabilir. Bu yaklaşım, zar ticareti anlayışımızı değerli bir ilerleme sağlayabilir.

Bu deney, in vitro kültürde vezikül dinamiklerini ölçmek için tasarlandı. Bu tahlil, nöronal morfoloji ve hayatta kalma ile ilişkili vezikül hareketliliğini saptamak için kullanılmıştır. Şekil 1A ve B, nöronlarda lizozom motilitesini gösteren temsili verileri göstermektedir. Kortikal nöronlar, lizozom işaretleyici LAMP-EGFP ile transfekte edildi ve standart bir fluoresans mikroskopu kullanılarak gözlendi. Daha önce, spesifik endozom-lizozom veziküllerin dinlenme nöronlarında bile oldukça hareketli olduğu bildirilmiştir ( 8) . Gerçekten de, bu sonuçlar, aynı dendrite ait hem dinlenme hem de hareketli kesecikleri göstermektedir ( Şekil 1A ve B ). Normal olarak, dinlenme veziküller, nöronal dendritlerde Brown hareketleri gibi titreşim hareketi gösterir. Aksine, hareketli veziküller düzensiz hareketlilik göstermektedir. Her bir vezikülün farklı olduğunu düşünüyoruzLizozom veziküllerde bile fonksiyonun belirlenmesinin altında yatan kompozisyon. 8 . Böylece, veziküllerin bu yaklaşımla sınıflandırılması faydalı bilgiler sağlayabilir. Bu sistemi kullanarak, bu veziküller ( Şekil 1C ) ortalama hareketliliğini ölçmek kolaydır ( Şekil 1C ) ve etkili bir şekilde bu sistemi kullanarak vezikül özelliklerini analiz etmek. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/55488/55488fig1.jpg" /> Şekil 1: Nöronal Dendritlerde Lizozom Hareketliliği. ( A ) Fare korteks nöronları (4 DIV) LAMP-EGFP plazmiti ile 2 gün boyunca transfekte edildi. Bu görüntü, dendritlerdeki LAMP-EGFP içeren veziküllerin hareketliliğini gösterir. Giriş, LAMP-EGFP pozitif veziküllerinin zaman atlamalı görüntüsünü gösterir. Kırmızı ok başında hareket eden bir vezikül, mavi ok başı dinlendirici bir vezikülü gösterir. Turuncu ok uçları, daha büyük flüoresan sinyallerine işaret ederYukarıya. Ölçek çubuğu = 20 μm. ( B ) Şekil A&#39;daki LAMP-EGFP pozitif veziküllerinin zaman bağımlı x ekseni konumu. (B) etiketli kırmızı daire içindeki vezikül hareket ediyor ve (a) etiketli mavi daire içindeki vezikül dinleniyor. Ölçek çubuğu: 5 μm (solda). Çubuk grafik, LAMP-EGFP hareketinin toplam mesafesini (sağ) gösterir. ( C ) Çubuk grafik LAMP-EGFP içeren veziküllerin ortalama hareketlilik mesafesini göstermektedir. (N = 5, ortalama ± standart hata [SEM], ** p &lt;0.01 Student&#39;s t- testi). <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55488/55488fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes at JoVE.com

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

Membran kaçakçılığının araştırılması, nöronal işlevleri anlamada çok önemlidir. Burada, nöronlarda vezikül hareketliliğini ölçmek için bir yöntem sunuyoruz. Bu, sinir sistemindeki zar ticaretinin miktarına uyarlanabilen uygun bir yöntemdir.

Floresan Probları Kullanan Kültürlü Nöronlarda Endozom ve Lizozom Hareketlerinin Nicelendirilmesi

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...

quantification-endosome-lysosome-motilities-cultured-neurons-using

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.0K Görüntüleme.  University of Tsukuba.  Membran kaçakçılığının araştırılması, nöronal işlevleri anlamada çok önemlidir. Burada, nöronlarda vezikül hareketliliğini ölçmek için bir yöntem sunuyoruz. Bu, sinir sistemindeki zar ticaretinin miktarına uyarlanabilen uygun bir yöntemdir. 

Video: Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis. Retrieved SVs are then refilled with neurotransmitter and rejoin the recycling pool, defined as SVs that are available for exocytosis1,2. The recycling pool can generally be subdivided into two distinct pools - the readily releasable pool (RRP) and the reserve pool (RP). As their names imply, the RRP consists of SVs that are immediately available for fusion while RP SVs are released only during intense stimulation1,2. It is important to have a reliable assay that reports the differential replenishment of these SV pools in order to understand 1) how SVs traffic after different modes of endocytosis (such as clathrin-dependent endocytosis and activity-dependent bulk endocytosis) and 2) the mechanisms controlling the mobilisation of both the RRP and RP in response to different stimuli.
FM dyes are routinely employed to quantitatively report SV turnover in central nerve terminals3-8. They have a hydrophobic hydrocarbon tail that allows reversible partitioning in the lipid bilayer, and a hydrophilic head group that blocks passage across membranes. The dyes have little fluorescence in aqueous solution, but their quantum yield increases dramatically when partitioned in membrane9. Thus FM dyes are ideal fluorescent probes for tracking actively recycling SVs. The standard protocol for use of FM dye is as follows. First they are applied to neurons and are taken up during endocytosis (Figure 1). After non-internalised dye is washed away from the plasma membrane, recycled SVs redistribute within the recycling pool. These SVs are then depleted using unloading stimuli (Figure 1). Since FM dye labelling of SVs is quantal10, the resulting fluorescence drop is proportional to the amount of vesicles released. Thus, the recycling and fusion of SVs generated from the previous round of endocytosis can be reliably quantified.
Here, we present a protocol that has been modified to obtain two additional elements of information. Firstly, sequential unloading stimuli are used to differentially unload the RRP and the RP, to allow quantification of the replenishment of specific SV pools. Secondly, each nerve terminal undergoes the protocol twice. Thus, the response of the same nerve terminal at S1 can be compared against the presence of a test substance at phase S2 (Figure 2), providing an internal control. This is important, since the extent of SV recycling across different nerve terminals is highly variable11.
Any adherent primary neuronal cultures may be used for this protocol, however the plating density, solutions and stimulation conditions are optimised for cerebellar granule neurons (CGNs)12,13.

A live fluorescence imaging technique to quantify the replenishment and mobilisation of specific synaptic vesicle (SV) pools in central nerve terminals is described. Two rounds of SV recycling are monitored in the same nerve terminals providing an internal control.

FM Boyalar Kültür Serebellar Granül Nöronlar Synaptic veziküllü Havuzu Yenileme Kantitatif Analiz

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Nörobilim

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This directed trafficking is of fundamental importance to deliver, maintain or remove synaptic proteins.
Super-ecliptic pHluorin (SEP) is a pH-sensitive derivative of eGFP that has been extensively used for live cell imaging of plasma membrane proteins1-2. At low pH, protonation of SEP decreases photon absorption and eliminates fluorescence emission. As most intracellular trafficking events occur in compartments with low pH, where SEP fluorescence is eclipsed, the fluorescence signal from SEP-tagged proteins is predominantly from the plasma membrane where the SEP is exposed to a neutral pH extracellular environment. When illuminated at high intensity SEP, like every fluorescent dye, is irreversibly photodamaged (photobleached)3-5. Importantly, because low pH quenches photon absorption, only surface expressed SEP can be photobleached whereas intracellular SEP is unaffected by the high intensity illumination6-10. 
FRAP (fluorescence recovery after photobleaching) of SEP-tagged proteins is a convenient and powerful technique for assessing protein dynamics at the plasma membrane. When fluorescently tagged proteins are photobleached in a region of interest (ROI) the recovery in fluorescence occurs due to the movement of unbleached SEP-tagged proteins into the bleached region. This can occur via lateral diffusion and/or from exocytosis of non-photobleached receptors supplied either by de novo synthesis or recycling (see Fig. 1). The fraction of immobile and mobile protein can be determined and the mobility and kinetics of the diffusible fraction can be interrogated under basal and stimulated conditions such as agonist application or neuronal activation stimuli such as NMDA or KCl application8,10. 
We describe photobleaching techniques designed to selectively visualize the recovery of fluorescence attributable to exocytosis. Briefly, an ROI is photobleached once as with standard FRAP protocols, followed, after a brief recovery, by repetitive bleaching of the flanking regions. This 'FRAP-FLIP' protocol, developed in our lab, has been used to characterize AMPA receptor trafficking at dendritic spines10, and is applicable to a wide range of trafficking studies to evaluate the intracellular trafficking and exocytosis.

This report describes the use of live cell imaging and photobleach techniques to determine the surface expression, transport pathways and trafficking kinetics of exogenously expressed, pH-sensitive GFP-tagged proteins at the plasma membrane of neurons.

Kültür Nöronlar Membran Proteinlerin Yanal Difüzyon ve ekzositoz Floresans Kurtarma ve Floresans kaybı Photobleaching kullanarak Değerlendirilen

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall neural circuit function. Synapse strength critically depends on the abundance of neurotransmitter receptors clustered at synaptic sites on the postsynaptic membrane. Receptor levels are established developmentally, and can be altered by receptor trafficking between surface-localized, subsynaptic, and intracellular pools, representing important mechanisms of synaptic plasticity and neuromodulation. Rigorous methods to quantify synaptically-localized neurotransmitter receptor abundance are essential to study synaptic development and plasticity. Fluorescence microscopy is an optimal approach because it preserves spatial information, distinguishing synaptic from non-synaptic pools, and discriminating among receptor populations localized to different types of synapses. The genetic model organism Caenorhabditis elegans is particularly well suited for these studies due to the small size and relative simplicity of its nervous system, its transparency, and the availability of powerful genetic techniques, allowing examination of native synapses in intact animals.
Here we present a method for quantifying fluorescently-labeled synaptic neurotransmitter receptors in C. elegans. Its key feature is the automated identification and analysis of individual synapses in three dimensions in multi-plane confocal microscope output files, tabulating position, volume, fluorescence intensity, and total fluorescence for each synapse. This approach has two principal advantages over manual analysis of z-plane projections of confocal data. First, because every plane of the confocal data set is included, no data are lost through z-plane projection, typically based on pixel intensity averages or maxima. Second, identification of synapses is automated, but can be inspected by the experimenter as the data analysis proceeds, allowing fast and accurate extraction of data from large numbers of synapses. Hundreds to thousands of synapses per sample can easily be obtained, producing large data sets to maximize statistical power. Considerations for preparing C. elegans for analysis, and performing confocal imaging to minimize variability between animals within treatment groups are also discussed. Although developed to analyze C. elegans postsynaptic receptors, this method is generally useful for any type of synaptically-localized protein, or indeed, any fluorescence signal that is localized to discrete clusters, puncta, or organelles.
The procedure is performed in three steps: 1) preparation of samples, 2) confocal imaging, and 3) image analysis. Steps 1 and 2 are specific to C. elegans, while step 3 is generally applicable to any punctate fluorescence signal in confocal micrographs.

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

The abundance of neurotransmitter receptors clustered at synapses strongly influences synaptic strength. This method quantifies fluorescently-labeled neurotransmitter receptors in three dimensions with single-synapse resolution in C. elegans, allowing hundreds of synapses to be rapidly characterized within a single sample without distortions introduced by z-plane projection.

Içinde Synaptic florasan Otomatik Sayısallaştırma<em&gt; C. elegans</em

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall ...

Characterizing the Composition of Molecular Motors on Moving Axonal Cargo Using "Cargo Mapping" Analysis

Understanding the mechanisms by which molecular motors coordinate their activities to transport vesicular cargoes within neurons requires the quantitative analysis of motor/cargo associations at the single vesicle level. The goal of this protocol is to use quantitative fluorescence microscopy to correlate (&#8220;map&#8221;) the position and directionality of movement of live cargo to the composition and relative amounts of motors associated with the same cargo. &#8220;Cargo mapping&#8221; consists of live imaging of fluorescently labeled cargoes moving in axons cultured on microfluidic devices, followed by chemical fixation during recording of live movement, and subsequent immunofluorescence (IF) staining of the exact same axonal regions with antibodies against motors. Colocalization between cargoes and their associated motors is assessed by assigning sub-pixel position coordinates to motor and cargo channels, by fitting Gaussian functions to the diffraction-limited point spread functions representing individual fluorescent point sources. Fixed cargo and motor images are subsequently superimposed to plots of cargo movement, to &#8220;map&#8221; them to their tracked trajectories. The strength of this protocol is the combination of live and IF data to record both the transport of vesicular cargoes in live cells and to determine the motors associated to these exact same vesicles. This technique overcomes previous challenges that use biochemical methods to determine the average motor composition of purified heterogeneous bulk vesicle populations, as these methods do not reveal compositions on single moving cargoes. Furthermore, this protocol can be adapted for the analysis of other transport and/or trafficking pathways in other cell types to correlate the movement of individual intracellular structures with their protein composition. Limitations of this protocol are the relatively low throughput due to low transfection efficiencies of cultured primary neurons and a limited field of view available for high-resolution imaging. Future applications could include methods to increase the number of neurons expressing fluorescently labeled cargoes.

Intracellular transport of cargoes, such as vesicles or organelles, is carried out by molecular motor proteins that track on polarized microtubules. This protocol describes the correlation of the directionality of transport of individual cargo particles moving inside neurons, to the relative amount and type of associated motor proteins.

Kullanımı Akson Kargo Hareketli Moleküler Motors Kompozisyon karakterize &quot;Kargo Haritalama&quot; Analizi

Understanding the mechanisms by which molecular motors coordinate their activities to transport vesicular cargoes within neurons requires the quantitative ...

TIRFM and pH-sensitive GFP-probes to Evaluate Neurotransmitter Vesicle Dynamics in SH-SY5Y Neuroblastoma Cells: Cell Imaging and Data Analysis

Synaptic vesicles release neurotransmitters at chemical synapses through a dynamic cycle of fusion and retrieval. Monitoring synaptic activity in real time and dissecting the different steps of exo-endocytosis at the single-vesicle level are crucial for understanding synaptic functions in health and disease.
Genetically-encoded pH-sensitive probes directly targeted to synaptic vesicles and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (TIRFM) provide the spatio-temporal resolution necessary to follow vesicle dynamics. The evanescent field generated by total internal reflection can only excite fluorophores placed in a thin layer (&#60;150 nm) above the glass cover on which cells adhere, exactly where the processes of exo-endocytosis take place. The resulting high-contrast images are ideally suited for vesicles tracking and quantitative analysis of fusion events.
In this protocol, SH-SY5Y human neuroblastoma cells are proposed as a valuable model for studying neurotransmitter release at the single-vesicle level by TIRFM, because of their flat surface and the presence of dispersed vesicles. The methods for growing SH-SY5Y as adherent cells and for transfecting them with synapto-pHluorin are provided, as well as the technique&#160;to perform TIRFM and imaging. Finally, a strategy aiming to select, count, and analyze fusion events at whole-cell and single-vesicle levels is presented.
To validate the imaging procedure and data analysis approach, the dynamics of pHluorin-tagged vesicles are&#160;analyzed under resting and stimulated (depolarizing potassium concentrations) conditions. Membrane depolarization increases the frequency of fusion events and causes a parallel raise of the net fluorescence signal recorded in whole cell. Single-vesicle analysis reveals modifications of fusion-event behavior (increased peak height and width). These data suggest that potassium depolarization not only induces a massive neurotransmitter release but also modifies the mechanism of vesicle fusion and recycling.
With the appropriate fluorescent probe, this technique can be employed in different cellular systems to dissect the mechanisms of constitutive and stimulated secretion.

This paper provides a method for investigating neurotransmitter vesicle dynamics in neuroblastoma cells, using a synaptobrevin2-pHluorin construct and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. The strategy developed for image processing and data analysis is also reported.

TIRFM ve pH-duyarlı GFP-sondalar SH-SY5Y Nöroblastom Hücrelerinde nörotransmitter Vesikül Dynamics değerlendirin: Hücre Görüntüleme ve Veri Analizi

Synaptic vesicles release neurotransmitters at chemical synapses through a dynamic cycle of fusion and retrieval. Monitoring synaptic activity in real ...

Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons

During endocytosis, fused synaptic vesicles are retrieved at nerve terminals, allowing for vesicle recycling and thus the maintenance of synaptic transmission during repetitive nerve firing. Impaired endocytosis in pathological conditions leads to decreases in synaptic strength and brain functions. Here, we describe methods used to measure synaptic vesicle endocytosis at the mammalian hippocampal synapse in neuronal culture. We monitored synaptic vesicle protein endocytosis by fusing a synaptic vesicular membrane protein, including synaptophysin and VAMP2/synaptobrevin, at the vesicular lumenal side, with pHluorin, a pH-sensitive green fluorescent protein that increases its fluorescence intensity as the pH increases. During exocytosis, vesicular lumen pH increases, whereas during endocytosis vesicular lumen pH is re-acidified. Thus, an increase of pHluorin fluorescence intensity indicates fusion, whereas a decrease indicates endocytosis of the labelled synaptic vesicle protein. In addition to using the pHluorin imaging method to record endocytosis, we monitored vesicular membrane endocytosis by electron microscopy (EM) measurements of Horseradish peroxidase (HRP) uptake by vesicles. Finally, we monitored the formation of nerve terminal membrane pits at various times after high potassium-induced depolarization. The time course of HRP uptake and membrane pit formation indicates the time course of endocytosis.

Synaptic vesicle endocytosis is detected by light microscopy of pHluorin fused with synaptic vesicle protein and by electron microscopy of vesicle uptake.

Sinaptik vezikül endositoz kültürlü Hipokampal nöronlar içinde ölçme

During endocytosis, fused synaptic vesicles are retrieved at nerve terminals, allowing for vesicle recycling and thus the maintenance of synaptic ...

Organelle Transport in Cultured Drosophila Cells: S2 Cell Line and Primary Neurons.

Drosophila S2 cells plated on a coverslip in the presence of any actin-depolymerizing drug form long unbranched processes filled with uniformly polarized microtubules. Organelles move along these processes by microtubule motors. Easy maintenance, high sensitivity to RNAi-mediated protein knock-down and efficient procedure for creating stable cell lines make Drosophila S2 cells an ideal model system to study cargo transport by live imaging. The results obtained with S2 cells can be further applied to a more physiologically relevant system: axonal transport in primary neurons cultured from dissociated Drosophila embryos. Cultured neurons grow long neurites filled with bundled microtubules, very similar to S2 processes. Like in S2 cells, organelles in cultured neurons can be visualized by either organelle-specific fluorescent dyes or by using fluorescent organelle markers encoded by DNA injected into early embryos or expressed in transgenic flies. Therefore, organelle transport can be easily recorded in neurons cultured on glass coverslips using living imaging. Here we describe procedures for culturing and visualizing cargo transport in Drosophila S2 cells and primary neurons. We believe that these protocols make both systems accessible for labs studying cargo transport.

Organelle Transport in Cultured Drosophila Cells: S2 Cell Line and Primary Neurons.

Drosophila S2 cells and cultured neurons are great systems for imaging of motor-driven organelle transport in vivo. Here we describe detailed protocols for culturing both cell types, their imaging and analysis of transport.

Kültürlü organel Ulaşım<em&gt; Drosophila</em&gt; Hücreler: S2 Hücre Hattı ve İlköğretim Nöronlar.

Drosophila S2 cells plated on a coverslip in the presence of any actin-depolymerizing drug form long unbranched processes filled with uniformly polarized ...

Biyoloji

Real-Time Fluorescent Measurement of Synaptic Functions in Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis

Before neuronal degeneration, the cause of motor and cognitive deficits in patients with amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and/or frontotemporal lobe dementia (FTLD) is dysfunction of communication between neurons and motor neurons and muscle. The underlying process of synaptic transmission involves membrane depolarization-dependent synaptic vesicle fusion and the release of neurotransmitters into the synapse. This process occurs through localized calcium influx into the presynaptic terminals where synaptic vesicles reside. Here, the protocol describes fluorescence-based live-imaging methodologies that reliably report depolarization-mediated synaptic vesicle exocytosis and presynaptic terminal calcium influx dynamics in cultured neurons.
Using a styryl dye that is incorporated into synaptic vesicle membranes, the synaptic vesicle release is elucidated. On the other hand, to study calcium entry, Gcamp6m is used, a genetically encoded fluorescent reporter. We employ high potassium chloride-mediated depolarization to mimic neuronal activity. To quantify synaptic vesicle exocytosis unambiguously, we measure the loss of normalized styryl dye fluorescence as a function of time. Under similar stimulation conditions, in the case of calcium influx, Gcamp6m fluorescence increases. Normalization and quantification of this fluorescence change are performed in a similar manner to the styryl dye protocol. These methods can be multiplexed with transfection-based overexpression of fluorescently tagged mutant proteins. These protocols have been extensively used to study synaptic dysfunction in models of FUS-ALS and C9ORF72-ALS, utilizing primary rodent cortical and motor neurons. These protocols easily allow for rapid screening of compounds that may improve neuronal communication. As such, these methods are valuable not only for the study of ALS but for all areas of neurodegenerative and developmental neuroscience research.

Two related methods are described to visualize subcellular events required for synaptic transmission. These protocols enable the real-time monitoring of the dynamics of presynaptic calcium influx and synaptic vesicle membrane fusion using live-cell imaging of in vitro cultured neurons.

Amiyotrofik Lateral Skleroz Modellerinde Sinaptik Fonksiyonların Gerçek Zamanlı Floresan Ölçümü

Before neuronal degeneration, the cause of motor and cognitive deficits in patients with amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and/or frontotemporal lobe ...

Measuring Axonal Cargo Transport in Mouse Primary Cortical Cultured Neurons

Neuronal cells are highly polarized cells that stereotypically harbor several dendrites and an axon. The length of an axon necessitates efficient bidirectional transport by motor proteins. Various reports have suggested that defects in axonal transport are associated with neurodegenerative diseases. Also, the mechanism of the coordination of multiple motor proteins has been an attractive topic. Since the axon has uni-directional microtubules, it is easier to determine which motor proteins are involved in the movement. Therefore, understanding the mechanisms underlying the transport of axonal cargo is crucial for uncovering the molecular mechanism of neurodegenerative diseases and the regulation of motor proteins. Here, we introduce the entire process of axonal transport analysis, including the culturing of mouse primary cortical neurons, transfection of plasmids encoding cargo proteins, and directional and velocity analyses without the effect of pauses. Furthermore, the open-access software "KYMOMAKER" is introduced, which enables the generation of a kymograph to highlight transport traces according to their direction and allow easier visualization of axonal transport.

The present protocol describes the whole procedure of analysis for axonal transport. In particular, the calculation of transport velocity, not including the pausing, and the visualization method using open-access software "KYMOMAKER" are shown here.

Neuronal cells are highly polarized cells that stereotypically harbor several dendrites and an axon. The length of an axon necessitates efficient ...

<meta charset="utf8"></head><body>GFP Etiketli RAB-3 Kullanılarak Canlı C. elegans'ta Aksonal Taşıma Analizinin Geliştirilmesi

Optimizing Visualization of Axonal Transport of Endogenous Cargo by Fluorescence Microscopy in Living Caenorhabditis elegans

Axonal transport is a prerequisite to deliver axonal proteins from their site of synthesis in the neuronal cell body to their destination in the axon. Consequently, loss of axonal transport impairs neuronal growth and function. Studying axonal transport therefore improves our understanding of neuronal cell biology. With recent improvements in CRISPR Cas9 genome editing, endogenous labeling of axonal cargos has become accessible, enabling to move beyond ectopic expression-based visualization of transport. However, endogenous labeling often comes at the cost of low signal intensity and necessitates optimization strategies to obtain robust data. Here, we describe a protocol to optimize the visualization of axonal transport by discussing acquisition parameters and a bleaching approach to improve the signal of endogenous labeled cargo over diffuse cytoplasmic background. We apply our protocol to optimize the visualization of synaptic vesicle precursors (SVPs) labeled by green fluorescent protein (GFP)-tagged RAB-3 to highlight how fine-tuning acquisition parameters can improve the analysis of endogenously labeled axonal cargo in Caenorhabditis elegans (C. elegans).

<meta charset="utf8"></head><body>Yazar Spotlight: Endojen Aksonal Taşıma Dinamiklerini Görselleştirmek için İleri Teknikler

The paper describes the optimization of fluorescence microscopy acquisition parameters to visualize the axonal transport of endogenous labeled cargos at single-neuron resolution in a living nematode.

Canlı Caenorhabditis elegans'ta Floresan Mikroskobu ile Endojen Yükün Aksonal Taşınmasının Görüntülenmesinin Optimize Edilmesi

Axonal transport is a prerequisite to deliver axonal proteins from their site of synthesis in the neuronal cell body to their destination in the axon. ...

Floresan Probları Kullanan Kültürlü Nöronlarda Endozom ve Lizozom Hareketlerinin Nicelendirilmesi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler