Bu çalışma NSERC hibe tarafından desteklenmiştir 386634. Biz yararlı tartışmalar için Screaton Lab üyelerine teşekkür etmek istiyorum.

Reaktifler, Tabaklar ve Hücreleri 1. Hazırlık <ol><li> 25 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, 50 mM NaF, 0.5 mM EDTA, pH 8.0,% 0.5 Triton X-100, 5 mM p-gliserofosfat,% 5 gliserol, 500 ml lizis tamponu sağlayın. 4 ° C&#39;de saklayın. Kullanmak 1 mM ditiotreitol (DTT), 1mM fenilmetil sülfonil fluorür (PMSF) ve 1 mM sodyum vanadat eklemek için hemen önce. Bu aşamadan sonra, PMSF bir durulama tamponu içinde gerekli değildir. </li><li> 200 mM Tris pH 7,5, 50 mM beta-gliserofosfat (FW 216), 2 mM sodyum vanadat: 10x Kinaz Tamponu 20 ml sağlayın. -20 ° C&#39;de 1 ml&#39;lik tüplerde ml başına kısım ve mağaza. Kullanmak 5 mM DTT eklemek için hemen önce. </li><li> 300 uM adenosin trifosfat (ATP), 66 mM MgCl2, -20 ° C&#39;de 33 mM MnCl 2. 1 ml&#39;lik tüplerde ml başına kısım ve mağaza: 10x M-ATP tamponu 20 ml sağlayın. </li><li> 2x sodyum dodesil sülfat 100 ml Yap (SDS) lizis tamponu: 1,5 g Tris baz, 20 ml gliserol, 30 ml H2O Eritin ve HCI ile 6.8 pH&#39;a ayarlanır. 40 Ekleml% 10 SDS, 100 ml ses seviyesini ayarlamak. 25 mg bromofenol mavi ekleyin. </li><li> Noktası buna uygun olarak, 96 gözlü levhalar ve etiket plakaları setleri göz başına bir GST-kinaz kodlayan 14 25 ng / | il memeli ekspresyon plazmidi 4 ul. Kullanılana kadar -20 ° C&#39;de dondurularak mühür ve plakalar. </li><li> Transfeksiyondan 1-2 gün önce, CO2 (son% 5) ile desteklenmiş 37 ° C inkübatör içinde bir kültür HEK293T tamamlandı Dulbecco tadil edilmiş Eagle ortamı (DMEM) +% 10 cenin sığır serumu (FBS) hücreler ve antibiyotik. Ve tripsin ile Passage stok genişleme sırasında&gt;% 80 konfluent haline izin vermez. 6 x 10 7 hücrelerinin en az ekran (80% birleştiği noktada HEK293T hücrelerinin yaklaşık 3 x 15 cm yemekleri) için gereklidir. </li></ol> 2. Transfeksiyon Not: Tüm protokolün bir akış şeması için Şekil 1&#39;e bakınız. <ol><li> Kinaz plazmidler içeren plakalar donduruldu varsa, oda sıcaklığı a at çözülmend kuyu altındaki nemi toplamak için 3 dakika boyunca 1900 x g&#39;de santrifüjlenir. </li><li> Lipit bazlı transfeksiyon reaktifi 312,7 ul düşük serum ortamında (örneğin, OPTI-MEM) 8,6 ml karıştırın. 5 dakika bekletin. </li><li> Küçük hacimli bir kaset ile donatılmış bir otomatik sıvı dağıtıcı kullanılarak her bir kuyucuğa, düşük serum ortamı 10 ul ekle. </li><li> Küçük hacimli bir kaset ile donatılmış bir otomatik sıvı dağıtıcı kullanılarak adım 2.2 düşük serum ortamı / transfeksiyon reaktifi karışımı oyuk başına 10 ul ekle. 20 ila 45 dakika bekletin. </li><li> Tam DMEM, 80 ml ​​7.5 x 10 5 hücre / ml&#39;de yeniden süspanse 293T hücreleri. Ve bir standart birim kaset ile donatılmış bir otomatik sıvı dağıtıcı kullanılarak göz başına hücre süspansiyonu (yani, 7.5 x 10 4 hücre), 100 ul ekle. </li><li> Homojen hücre dağılımı için mikroskop altında kuyu kontrol edin ve 24 saat boyunca inkübatör dönmek. </li></ol> 3. GST-kinaz Düşürme <ol><li> F yapresh: H2O 540 ul 0.2 M sodyum vanadat 60 ul karıştırılarak 4 mM pervanadate çözeltisi Bir ikinci tüp karışımı 30% peroksit 2,7 ul PBS içinde 1.4 mi. Birlikte iki çözüm ekleyin ve kullanmadan önce 15 dakika bekletin. </li><li> (Bu oyuk çok fazla türbülans yaratır gibi bir otomatik sıvı dağıtıcı kullanmayın) Aşama 3.1&#39;de elde pervanadate 2.5 ul ve ardından, her bir çukura 0.25 M CaCI2 2 ul dağıtmak çok kanallı pipet kullanarak. 10 dakika boyunca 37 ° C &#39;de, her plaka inkübe ve daha sonra buz üzerine yerleştirin. </li><li> Bölüm 1 (reaktiflerinin preparasvonu) &#39;de gösterildiği gibi DTT, PMSF ve sodyum vanadat eklenerek liziz tamponu 35 ml hazırlayın. </li><li> Buz üzerinde plakaları tutulması, her bir kuyunun bir vakum aspiratörü kullanarak orta çıkarın. Hemen standart kaset ile donatılmış bir otomatik sıvı dağıtıcı kullanılarak 50 ul / oyuk buz soğuğu lizis tamponu ilave edin. Parçalamak için buz üzerinde 30 dk bekletin (opsiyonel: plat sızdırmazlık burada gerekirse durdurabilirsinize ve -80 ° C&#39;de saklama. Buz üzerinde, çözülme plakaları) devam etmek. </li><li> 4 ° C&#39;de 3 dakika boyunca 1900 x g&#39;de Spin plakalar. </li><li> Her bir göze, bir çok kanallı pipet kullanılarak hücreler kazıyın ve içeriğini aktarmak uygun V-tabanlı 96 gözlü levhalar etiketli. 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 1900 x g&#39;de Spin plakalar. </li><li> Spin sırasında, bir durulama maddesi olarak 100 ul / oyuk (PMSF) olmadan, buz sıcaklığında lizis tamponu ile glutatiyon kaplı plakalar (her biri 96-delikli plaka için bir adet) doldurun. Buz üzerinde tabak tutun. </li><li> Santrifüj V-tabanlı plakalar çıkarın. Bir kerede bir, bir kağıt havlu üzerine lizis tamponu ve leke dışarı sallamak için bir lavabonun üzerinde glutatyon plakları ters çevirin. Alt pelet rahatsız değil dikkatli olmak, plaka devirme ve çok kanallı pipet kullanarak glutatyon plakalarına V-tabanlı plakalardan lizis tamponu aktarın. Kapak plakaları ve bağlama en az 2 saat süreyle buz üzerinde bırakın. </li><li> 2 saat bağlama aşamasında sonuna yakın, t sağlanması, bir radyoaktivite iş istasyonunu hazırlamakO gerekli güvenlik önlemleri radyoaktif çalışmalar için yerdesiniz. 30 ° C olarak ayarlayın hibridizasyon fırın. </li><li> Bu aşamada gerekli değildir Bölüm 1. PMSF belirtildiği gibi ilave DTT ve sodyum vanadat ile liziz tamponu 200 ml hazırlayın. </li><li> Lizis tamponu silkelemek ve bir kağıt havlu üzerine örtecek bir lavabonun üzerinde glutatyon plakları ters çevirin. Durulayın kuyular (PMSF olmadan) 100 ul lizis tamponu ile 3x. Devam etmek için hazır olana kadar durulama saklayın - kuyular kuru oturup izin vermeyin. </li><li> 10x stok seyreltilmesi ve standart bir ses kaseti ile donatılmış bir otomatik sıvı dağıtıcı kullanılarak 1x KB 50 ul 1. Durulama plakalar bir kere daha bölümünde belirtildiği gibi DTT ekleyerek 1x kinaz tamponu (KB) içinde 55 ml hazırlayın. Çözelti A hazır olana kadar kuyularda 1x KB bırakın: <ol><li> 15,9 ml kadar 530 ilgi substratın ug, miyelin bazik protein, 500 ug (MBP), 10x 2,65 ml KB, 1 M DTT 13.25 ul, ve H2O için 500 eklenerek çözelti bir hazırlayın. </li></ol></li&gt; <li> Bir kerede bir, 1x KB durulama kaldırmak kağıt havlu üzerine leke ve hemen bir küçük hacimli kaseti ile donatılmış otomatik bir sıvı dağıtıcı kullanarak Çözüm A 30 ul eklemek için lavabonun üzerinde plakları ters çevirin. Buz üzerinde tabak tutun. </li><li> 2,5 ml 10x M-ATP, 500 uCi gama 32P ATP, ve H2O ile 10 ml ilave etmek suretiyle radyoaktivite çalışma alanında Çözelti B hazırlayın. <ol><li> Iyi İtme kuvveti nedeniyle karıştırma yardımcı olan bir tekrarlayıcı pipet kullanarak başına Çözüm B 20 ul ekleyin. Kapak ve 30 dakika boyunca 30 ° C hibridizasyon fırında inkübe edin. </li></ol></li><li> 30 dakika sonra, buz geri plakaları aktarın. Her bir göze, bir çok kanallı pipet kullanarak 2x SDS lizis tamponu 50 ul ekle. Bir sonraki adımda, bu noktada gerçekleştirilebilir, ya da uygun kadar -20 ° C de, alüminyum folyo ve mağaza ile plakaları sızdırmaz olabilir. </li></ol> 4. Koşu, Boyama ve Kurutma Jeller Not: Tüm çalışmalar bir alan DESIGNA&#39;da yapılmalıdırradyoaktivite ted. <ol><li> Hibridizasyon fırında açın ve 85 ° C&#39;ye ayarlayın. Oda sıcaklığında Plakaları eritin. Bir kez fırın fırın ve 10 dk numune denatüre etmek için inkübe sıcaklık, devir plakaları ulaşmıştır. </li><li> Bir çok kanallı pipet kullanarak her reaksiyonun 15 ul yükleyin 26-iyi prekast jeller aynı anda birden fazla kuyu doldurun. Bakım Bütün ipuçlarını mukabil önce iyice örnekleri ekleyerek uyum dikkat edilmelidir. Bu unincorporated ATP içerdiği izleme boya (mavi çizgi) jel alt kaçıp izin vermeyin, 150 V&#39;de jel çalıştırın. </li><li> Jeller sökün ve bir neşter veya filmleri overexpose gibi cetvel kullanarak tüzel kişiliği olmayan ATP (mavi çizgi) kesti. Etiketli kaplar içinde jeller yerleştirin ve 15 dakika için Coomassie boyası ile kaplayın. </li><li> Kısaca, Coomassie leke çıkarmak suyla durulayın jeller ve çözüm destain ekleyin. Jeller destain proteinler açıkça görünür olana kadar. MBP için bir bant ve alt tabaka için bir grup olmalıdırHer numune için görünür. </li><li> Jeller kurutulması için: <ol><li> Filtre kağıdı büyük kesin, kurutma üzerine yerleştirin. </li><li> Bu pürüzsüz olana kadar damıtılmış su içinde, bir selofan bir plaka ıslatın ve ücretsiz kırışıklık ve kağıdın üstüne yerleştirin. </li><li> Jellerin düzen not ederek, selofan levha üstünde jeller yatırın. İkinci selofan sayfasını ıslatın ve jeller üstüne yerleştirin. </li><li> Güzel bir üniforma yüzey tüm kabarcıklar (bir tabak sızdırmazlık silindir bunun için iyi çalışır) dışarı rulo. , Kapağını kapatın vakum açın ve 80 ° C&#39;de 3 saat boyunca jeller kurulayın. </li></ol></li><li> Jeller kuru olduğunda, sinyal yoğunlaştırmak için bir ekran kullanılarak XAR filmi bunları ortaya çıkarmak. Saran wrap veya plastik torba ile kaseti sarın ve don dışında tutmak için bant ile mühür. -80 ° C sıcaklıkta gece boyunca kaseti saklayın. </li></ol> 5. XAR Filmleri Geliştirme <ol><li> Ertesi gün, dondurucudan kaseti çıkarmak ve oda sıcaklığında çözülme sağlar. Filmi geliştirinkaranlık oda üreticinin talimatlarına göre bir film işlemcisi kullanılarak. Not: kinaz substrat çiftlerinin kanıt filmleri inceleyin. İkinci uzun pozlama da zayıf fosforilasyon olaylarını tespit etmek için yararlı olabilir. </li></ol>

<ol>
	<li>Meisenhelder, J., Hunter, T., van der Geer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphopeptide+mapping+and+identification+of+phosphorylation+sites.">Phosphopeptide mapping and identification of phosphorylation sites.</a> Curr Protoc Mol Biol. 18, Unit 18 19 (2001).</li><li>Doll, S., Burlingame, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry-based+detection+and+assignment+of+protein+posttranslational+modifications.">Mass spectrometry-based detection and assignment of protein posttranslational modifications.</a> ACS chem. 10, 63-71 (2015).</li><li>Sharma, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultradeep+human+phosphoproteome+reveals+a+distinct+regulatory+nature+of+Tyr+and+Ser/Thr-based+signaling.">Ultradeep human phosphoproteome reveals a distinct regulatory nature of Tyr and Ser/Thr-based signaling.</a> Cell rep. 8, 1583-1594 (2014).</li><li>Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+protein+function+by+multisite+phosphorylation--a+25+year+update.">The regulation of protein function by multisite phosphorylation--a 25 year update.</a> Trends Biochem Sci. 25, 596-601 (2000).</li><li>Walsh, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Posttranslation Modification of Proteins: Expanding Nature's Inventory. , (2006).</li><li>Boersema, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-depth+qualitative+and+quantitative+profiling+of+tyrosine+phosphorylation+using+a+combination+of+phosphopeptide+immunoaffinity+purification+and+stable+isotope+dimethyl+labeling.">In-depth qualitative and quantitative profiling of tyrosine phosphorylation using a combination of phosphopeptide immunoaffinity purification and stable isotope dimethyl labeling.</a> Mol Cell Proteomics. 9, 84-99 (2010).</li><li>Hutti, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+method+for+determining+protein+kinase+phosphorylation+specificity.">A rapid method for determining protein kinase phosphorylation specificity.</a> Nat Methods. 1, 27-29 (2004).</li><li>Johnson, S. A., Hunter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinomics:+methods+for+deciphering+the+kinome.">Kinomics: methods for deciphering the kinome.</a> Nat Methods. 2, 17-25 (2005).</li><li>Pawson, T., Nash, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+cell+regulatory+systems+through+protein+interaction+domains.">Assembly of cell regulatory systems through protein interaction domains.</a> Science. 300, 445-452 (2003).</li><li>Zhu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+yeast+protein+kinases+using+protein+chips.">Analysis of yeast protein kinases using protein chips.</a> Nat Genet. 26, 283-289 (2000).</li><li>Shah, K., Shokat, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+genetic+approach+for+the+identification+of+direct+substrates+of+protein+kinases.">A chemical genetic approach for the identification of direct substrates of protein kinases.</a> Methods Mol Biol. 233, 253-271 (2003).</li><li>Zou, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKIS:+computational+identification+of+protein+kinases+for+experimentally+discovered+protein+phosphorylation+sites.">PKIS: computational identification of protein kinases for experimentally discovered protein phosphorylation sites.</a> BMC bioinform. 14, 247 (2013).</li><li>Varjosalo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+active+and+kinase-deficient+kinome+collection+for+identification+of+kinases+regulating+hedgehog+signaling.">Application of active and kinase-deficient kinome collection for identification of kinases regulating hedgehog signaling.</a> Cell. 133, 537-548 (2008).</li><li>Jansson, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+controls+CREB+activity+in+islet+cells+via+regulated+phosphorylation+of+TORC2.">Glucose controls CREB activity in islet cells via regulated phosphorylation of TORC2.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 10161-10166 (2008).</li><li>Fu, A., Screaton, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+kinomics+to+delineate+signaling+pathways:+control+of+CRTC2/TORC2+by+the+AMPK+family.">Using kinomics to delineate signaling pathways: control of CRTC2/TORC2 by the AMPK family.</a> Cell Cycle. 7, 3823-3828 (2008).</li><li>Abu-Thuraia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axl+phosphorylates+elmo+scaffold+proteins+to+promote+rac+activation+and+cell+invasion.">Axl phosphorylates elmo scaffold proteins to promote rac activation and cell invasion.</a> Mol Cell Biol. 35, 76-87 (2015).</li><li>Manning, G., Whyte, D. B., Martinez, R., Hunter, T., Sudarsanam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protein+kinase+complement+of+the+human+genome.">The protein kinase complement of the human genome.</a> Science. 298, 1912-1934 (2002).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Yaklaşımı 14,15 tanımlayan özgün yayınlar bu yana, 180 GST-kinazlar orijinal kütüphanesi insan proteini kinome 420 üye, ya da ~% 80 genişletilmiştir. Genişletilmiş kütüphanesi ile, açıklanan protokol (gerekli görüldüğünde gibi) fosforlu ve dijital sinyal iyileştirme kullanılarak kısaltılmış olabilir, hangi filmleri geliştirmek için 4-5 gün sonra 1-4 gün sürer. Dikkat edilmesi gereken birkaç önemli adımlar (protokol bakış için Bkz: Şekil 1) vardır. İlk olarak, hücre için stoklar sağlığı (mikoplazma serbest, genişleme sırasında konfluansa ulaşmalarına imkan veren hiçbir ve her geçiş için tripsin ile muamele edilmiş) bir toplu genişletme aşamasında ve transfeksiyon zamanı 96 oyuklu plakalarda plakalandı. Transfeksiyon yer (Aşama 1.5) aldığı zaman hücreler eşit tohumlanır olabilir ve% 80 konfluent olmalıdır. İkincisi, bu hacim transf en aza indirmek için bir otomatik sıvı dağıtıcı kullanmak için transfeksiyon sırasında idealdirer hataları, böylece kuyuların arasındaki varyasyon katsayısı (&quot;cvs&quot;) sınırlayıcı. Azalan ölü hacimleri ve doğruluğu dağıtım artar küçük hacimli kaset sınırları reaktif kaybı ile dağıtıcı uydurma küçük hacimleri için. Sodyum pervanadate, bir tava tirosin fosfataz inhibitörü ile muamele aşaması, bir hedef kinazlann fosforilasyon durumunu geliştirmek için genel bir uyarıcı olarak kullanılır. Bu aşamada kalsiyum eklenmesi nedeniyle uzun süreli pervanadate tedavi ile ortaya yuvarlama hücre kaybını önleyerek, hücre-matriks yapışmasını arttırır. Bu adım 10 dakikalık inkübasyon süresi ödün vermeden yapılmalıdır. Tüm kullanılabilecek 120 kDa gibi büyük peptidler, protein alanları, ya da sağlam proteinler: Üçüncü, kinaz deneyi kendisi için birkaç rekombinant substrat seçerken dikkat edilmesi gereken noktalar vardır. Belirli bir fosforilleme alanı biliniyorsa, bir peptit substratı en düz İleri bir yaklaşım olmakla birlikte, tespit etmek için yeterince büyük olması gerekirBir SDS-PAGE jeli üzerinde. Bu durumda, alt-tabakalar peptid&gt; 25 bir MW elde bakterilerden GST&#39;ye birleştirilmiş ve saflaştırılabilir. Büyük proteinler büyük olasılıkla katlanmış ve bunlar hücrede olmak, ama onlar fosforile olması ve deneyde sinyal verebilir ek kalıntılarını içerecektir dezavantaj ile geleceğini onların phosphorylatable kalıntıları ortaya avantajı var. Bizim tercih Bu iki ekrandan aday kinazların doğrulama işler gibi, in vivo olarak fosforile olduğu bilinen ve biyolojik etkinlik düzenleyen bilinen bir çökeltisini çevreleyen 15-20 amino asitten oluşan bir peptit substratı kullanılarak bir ekran çalıştırmaktır in vitro ve in vivo olarak daha hızlı. Son protein yaklaşımları ideal miktarı ve oyuk başına 1 ug aştığı; Elbette bu substratın MW ile değişir. Kuyu başına daha az protein anlamlı hit verebilir, ancak bu sinyali arttıkça kuralın uygulandığı &#39;daha iyidir&#39;: noise. Degrade jeller kurutma sırasında çok sık çatlak gibi standart olmayan gradyan jeller tavsiye edilir. Jeller kurutulduktan sonra bir Geiger sayacı ile arka plan üzerinde, bir radyoaktif sinyalin tarama deneyinde başarı mükemmel bir göstergesini verir. Ekran, in vitro olarak ve karmaşıklık ilave seviyeleri, in vivo olarak mevcut olduğu gibi, belirli bir alt-tabaka için bir aday kinaz (ler) hücrelerinde doğrulanması gerekir. Spesifik olarak, ekran ama aynı hücre tipinde ya da alt-tabaka ile aynı hücre altı bölme ifade edilmez, in vitro olarak alt-tabakanın fosforile biyokimyasal kapasiteye sahip bir aile üyesi, tespit edebilir. MARK2 ve MARK3 iki isabet Ser275 ilgili CRTC2 fosforile olabilir kinaz için olan bir şablon ile ise, örneğin, sadece MARK2 hücreleri 14 alt-tabaka ile bir kompleks oluşturulur. Aday kinazın fizyolojik önemi teyit etmek için kullanılabilecek ek bir dizi deney aşağıda verilmiştir. Köknarst aday kinaz birlikte sentezlenmesiyle, aşağıdaki SDS-PAGE üzerinde alt-tabakanın hareket kaymaları bir onay kontrol olarak da kullanılabilir. Uygun kontroller katalitik inaktif kinaz gibi kotransfeksiyon özgüllüğünü teyit edebilirsiniz. İkinci olarak, alt-tabaka, bir katalitik olarak aktif olmayan kinaz vahşi tipli mevcudiyetinde alt-tabaka içine fosfat katılmasını teyit etmek için 32 P-ortofosfat ile inkübe olup edilmiştir ile hücre özütlerinden imüno edilebilir. Üçüncü olarak, bir fosfospesifık antikor, phosphoacceptor sekansına karşı oluşturulan (biliniyorsa) ve kinaz aşırı eksprese edildiği zaman alt-tabaka fosforilasyon bir artış teyit etmek için kullanılabilir. Hedef bölgede olmayan bir phosphorylatable tortu taşıyan mutant bir substrat kullanılarak ikinci bir ekran öncesinde phosphoantibody, daha büyük bir etki ve tam boyda bir protein alt-tabakalar ile, özellikle önemli bir kontrol nesil özgünlüğünü teyit edebilir. Farmakolojik inhibisyonu candi inhibe etmek için yaklaşımlarTarih kinaz da kullanılabilir, ancak dikkatli ilgili kinazlann inhibisyonu olarak icra gereken bir underappreciated gerçektir. Son yapılabilir hücreleri aday kinaz (ler) in susturulması izlenen ve batı lekeleme fosfospesifık bir antikor ile hedef site fosforilasyon kaybı izlemek için RNAi aracılı.

Protein post-translasyonel modifikasyonlar (PTMS) hücre içi iletişim için gereklidir. Belki de en iyi incelenen PTMS hücre altı konumlanması, konformasyon ve kararlılık, biyokimyasal aktivitesi de dahil olmak üzere protein fonksiyonları, bir sayısız düzenleyen protein kinazlar tarafından katalize fosforilasyon vardır. Hedef proteinler üzerinde fosforilasyon tanımlanması triptik fosfopeptıt haritalaması ile fosforile peptidler 1,2 zenginleştirilmiş örnekler kullanılarak artık standart proteomik tekniklerle gerçekleştirilebilir. Ifade proteomun dörtte üçü 3 fosforile olması beklenen ve 1.000.000 6 kadar tahminleri ile 200,000 fosforilasyon siteleri 5 tespit edilir olsa da, bunların çoğu bir yol ya da protein kinazı sinyal, herhangi bir verilen biyoloji sahiptir. Fosforile sitelerin tespiti nispeten büyük bir meydan okuma olduğunu, görece kolay olmasına karşınAlt tabaka çiftleri: bu siteleri hedefliyor soydaş kinaz (ler), biz haritalama kinaz olarak adlandırdığımız bir süreci tanımlamak. Alt tabaka çiftleri tarif edilmiştir, ya ilgi kinaz ile başlayan ve yüzeylerde arıyor veya ilgi bir alt tabaka ile başlayan ve bir modifiye kinaz deneysel 7-11 veya hesaplama 12 bulmaya çalışırken: kinaz tanımlamak için çeşitli yaklaşımlar. Bilinen bir fosforile edilmiş substrat için kinazlar tespit etmek için, alt-tabaka biyoinformatik ile çökeltilebilir kompleks oluşturmak kinazlar fosforilatlanmış bir tortu (konsensüs sitesi) yan, hem de tespit amino asitlerin kısa korunmuş dizisini içeren proteinleri tespit etmek için kullanılabilir. Bununla birlikte, bu yaklaşımlar, zaman alıcı ve genellikle başarı ile uymayan. Biz hızla belirli bir alt tabaka 13 fosforile edebilir kinazlar belirlemek için sistematik bir işlevsel yaklaşım geliştirdi. Ekran tahlil mükemmel spesifik üretirPotansiyel soydaş kinazlar için çok net bir seçim ile Sığ. Biyolojik sinyalleşme fosforilasyon merkezi konumu göz önüne alındığında, ekran hemen hemen tüm hücre sinyal yollarının 14-16&#39;da keşfi için yararlıdır. Ekran, insan protein kinazlann bir kütüphane ile geniş çaplı bir kinaz tahlili yerine getirilmesini kapsamaktadır. Kinazlar bakteriyel glutation S-transferaz (GST) proteini ile etiketlenmiş ve rekombinant enzimlerin, yani memeli hücre özütlerinden saflaştırıldı - bakterilerden hazırlanmış olan farklı - genellikle için gerekli yukarı akış protein kinazların varlığında oluşturulur Rekombinant enzimlerin in vitro aktiviteye sahip oldukları. Serin, treonin ve tirosin kinaz aktivitesi alt kinaz aktivasyonu için gereken Nitekim, maya 10 içinde mevcut olan, maya genomu 500 gen üzerinde 17 memeli kinome, için önemli ölçüde daha karmaşık hale gelmiştir belirten 122 protein kinazlan kodlar regulayüksek mertebeden organizmalara özgü süreçleri te. Ayrıca, hücre biyolojisi ve (örneğin, vb küçük moleküller, büyüme faktörleri, hormonlar, gibi), insan hastalığı ile ilgili çeşitli farklı uyarıcı etkisi, uygun bir çerçevede 14,15 modüle kinaz aktivitesi için kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td>Lysis buffer</td><td>Made in house</td><td></td><td>See Protocol step 1.1</td></tr><tr><td>10x kinase buffer</td><td>Made in house</td><td></td><td>See Protocol step 1.2</td></tr><tr><td>10x M-ATP</td><td>Made in house</td><td></td><td>See Protocol step 1.3</td></tr><tr><td>Human kinase plasmids</td><td>Orfeome, Invitrogen, Origene</td><td></td><td>GST-tagged in house</td></tr><tr><td>96 well plates</td><td>Fisher Scientific</td><td>CS003595</td><td></td></tr><tr><td>293T cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3002201</td><td>supplement with 100&amp;nbsp;U/ml penicillin, 100&amp;nbsp;&amp;#956;g/ml streptomycin, 10% fetal calf serum.</td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; incubator</td><td>Sanyo</td><td>MCO-17AIC</td><td></td></tr><tr><td>15 cm cell culture dishes</td><td>Fisher Scientific</td><td>877224</td><td></td></tr><tr><td>Reduced serum medium</td><td>Invitrogen</td><td>22600-050</td><td></td></tr><tr><td>Lipid-based transfection reagent</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>Automated liquid dispenser</td><td>Thermo Scientific</td><td>5840300</td><td></td></tr><tr><td>Small cassette attachment</td><td>Thermo Scientific</td><td>24073295</td><td></td></tr><tr><td>Standard cassette attachment</td><td>Thermo Scientific</td><td>14072670</td><td></td></tr><tr><td>4 mM pervanadate</td><td>Made in house</td><td></td><td>See Protocol step 3.1</td></tr><tr><td>0.25 M CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Made in house</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multichannel pipette (20-200 &amp;#956;l)</td><td>Labnet</td><td>p4812-200</td><td></td></tr><tr><td>Multichannel pipette (1-10 &amp;#956;l)</td><td>Thermo Scientific</td><td>4661040</td><td></td></tr><tr><td>V-bottom 6-well plates</td><td>Evergreen Scientific</td><td>290-8116-01V</td><td></td></tr><tr><td>Glutathione coated 96-well plates</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI-15240</td><td></td></tr><tr><td>Hybridization oven</td><td>Biostad</td><td>350355</td><td></td></tr><tr><td>GST tagged substrate</td><td>Made in house</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Myelin Basic Protein (MBP)</td><td>Sigma</td><td>M1891</td><td></td></tr><tr><td>Repeater pipette (1 ml)</td><td>Eppendorf</td><td>22266209</td><td></td></tr><tr><td>&lt;sup&gt;32&lt;/sup&gt;P gamma-ATP</td><td>Perkin Elmer</td><td>BLU502Z500UC</td><td></td></tr><tr><td>2x SDS lysis buffer (100&amp;nbsp;ml)</td><td>Made in house</td><td></td><td>See Protocol step 1.4</td></tr><tr><td>26-well precast TGX gels</td><td>BioRad</td><td>567-1045</td><td>gel percentage required is dependent on the molecular weight of the substrate of interest</td></tr><tr><td>Coomassie stain</td><td>Made in house</td><td></td><td>0.1% Coomassie R250, 10% acetic acid, 40% methanol</td></tr><tr><td>Coomassie destain</td><td>Made in house</td><td></td><td>10% acetic acid, 20% methanol</td></tr><tr><td>Labeled gel containers</td><td>Made in house</td><td></td><td>Used plastic lids from empty tip boxes, just big enough to contain one gel</td></tr><tr><td>Whatman filter paper</td><td>Fisher Scientific</td><td>57144</td><td></td></tr><tr><td>Cellophane sheets (2)</td><td>BioRad</td><td>165-0963</td><td></td></tr><tr><td>Gel dryer</td><td>Labconco</td><td>4330150</td><td></td></tr><tr><td>Double emulsion autoradiography film</td><td>VWR</td><td>IB1651454</td><td></td></tr><tr><td>Film cassette</td><td>Fisher Scientific</td><td>FBAC-1417</td><td></td></tr><tr><td>Intensifying screen</td><td>Fisher Scientific</td><td>FBIS-1417</td><td></td></tr><tr><td>Plate sealing rubber roller</td><td>Sigma</td><td>R1275</td><td></td></tr></tbody></table>

identification of kinase-substrate pairs using high throughput screening

Bu yeni sinyal transdüksiyon yollar aydınlatmak için kullanılabilir fosforile edilmiş alt tabakalar için özel bir insan protein kinazlar tespit için bir tarama platformu geliştirdik. Yaklaşımımız saflaştınldı GST-etiketli insan protein kinazların bir kütüphane ve ilgi konusu bir rekombinant protein alt-tabakanın kullanımı ile ilgilidir. Biz, CREB Düzenlenmiş kopyalayıcı ortak aktifleştirici 2 (CRTC2) bir glükoz ayarlı bir site için kinaz MAP / mikrotübül afinite düzenleyici kinaz 2 (MARK2) tanımlamak için bir beta hücre çoğalması için gerekli olan bir proteini, hem de bu teknolojiyi kullanmıştır tirozin Axl ailesi adaptör protein ELMO fosforilasyonu, hücre metastazı düzenleyicileri olarak kinazlar. Biz bu teknolojiyi tanımlamak ve hücrelerin çevresel uyaranlara tepki nasıl kapsamlı bir haritasını oluşturmak için nasıl yardımcı olabileceğini tartışmak.

Bir ekranda Örnek sonuçlar Şekil 2&#39;de gösterilmektedir. 180 kinazlar CRTC2 gibi klasik kinaz deneyi alt-tabaka miyelin bazik proteini (MBP) ile ilgili aa 268-283 tekabül eden bir GST-etiketli peptid alt-tabakası kullanılarak taranmıştır. Sadece iki kinazlar MARK2 ve yüksek ölçüde ilişkili kinaz MARK3 CRTC2 peptidi fosforile. Birçok fosforlaştınlabilen kalıntısı içerir ve jelin alt kısmına doğru, 18 kDa&#39;da çalışan olarak MBP, tüm deneylerde bir iç kontrol olarak dahil edilir. Bu özgüllük bir yorumlanması için izin verir: Bazı kinaz sağlam bir alt tabaka ve MBP fosforile olur. Burada dikkat edilmesi böylece her zaman tahlilde arka fosforilasyonu, orada (hiçbir kinaz kontrolleri yani) yalnız GST içeren kuyu her zaman bazı endojen kinaz aktivitesini arındırmak olduğunu. Bu alt tabakanın fosforilasyonu gerçek olduğunu ekarte etmez iken, daha az seçici olabilir kinaz ayarı in vitro düşündürmektedir.Bu kinaz substrat özgüllüğü ilgili sonuçlara ulaşmak için MW farklı birden fazla alt tabakaları dahil özellikle bilgilendirici. <img alt="Figür 1" src="/files/ftp_upload/53152/53152fig1.jpg" /> Şekil protokolünde önemli adımları gösteren 1. Akış Şeması. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53152/53152fig1highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/53152/53152fig2.jpg" /> Kitaplığı (180 insan protein kinazlar) Sürüm 1 bir ekranın Şekil ekranı sonucu 2. Örnek. Otoradyografileri (Jansson çoğaltılmıştır ve diğ., 2008), fare CRTC2 aa 268-283 tekabül GST peptit substratı kullanılarak yapılan. MBP, miyelin bazik proteini gösterilir. S yüksek derecedeİlgili kinazlar tarafından ubstrate seçim ekranına bir özelliğidir. Her şerit, ayrı bir kinaz deneyi reaksiyon ürünlerini temsil etmektedir. MARK3 (Jel 1) ve MARK2 (Jel 16), tek kinazlar TORC2 268-283 peptit fosforile için belirtilmiştir. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53152/53152fig2highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening at JoVE.com

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.

Yüksek Verimli Tarama kullanma Kinaz-substrat Çiftlerinin Kimlik


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...

identification-kinase-substrate-pairs-using-high-throughput

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

8.1K Görüntüleme.  Children's Hospital of Eastern Ontario Research Institute. Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.

Video: Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

Oligopeptide Competition Assay for Phosphorylation Site Determination

Protein phosphorylation at specific sites determines its conformation and interaction with other molecules. Thus, protein phosphorylation affects biological functions and characteristics of the cell. Currently, the most common method for discovering phosphorylation sites is by liquid chromatography/mass spectrometry (LC/MS) analysis, a rapid and sensitive method. However, relatively labile phosphate moieties are often released from phosphopeptides during the fragmentation step, which often yields false-negative signals. In such cases, a traditional in vitro kinase assay using site-directed mutants would be more accurate, but this method is laborious and time-consuming. Therefore, an alternative method using peptide competition may be advantageous. The consensus recognition motif of 5&#39; adenosine monophosphate-activated protein kinase (AMPK) has been established1 and was validated using a positional scanning peptide library assay2. Thus, AMPK phosphorylation sites for a novel substrate could be predicted and confirmed by the peptide competition assays. In this report, we describe the detailed steps and procedures for the in vitro oligopeptide-competing kinase assay by illustrating AMPK-mediated nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (Nrf2) phosphorylation. To authenticate the phosphorylation site, we carried out a sequential in vitro kinase assay using a site-specific mutant. Overall, the peptide competition assay provides a method to screen multiple potential phosphorylation sites and to identify sites for validation by the phosphorylation site mutants.

Peptide competition assays are widely used in a variety of molecular and immunological experiments. This paper describes a detailed method for an in vitro oligopeptide-competing kinase assay and the associated validation procedures, which may be useful to find specific phosphorylation sites.

Fosforilasyon Saha Tespiti İçin Oligopeptide Rekabet Testi

Protein phosphorylation at specific sites determines its conformation and interaction with other molecules. Thus, protein phosphorylation affects ...

Biyokimya

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; however, the number of identified targets for Cdk1, particularly in human cells is still low. The identification of Cdk1-specific phosphorylation sites is important, as they provide mechanistic insights into how Cdk1 controls the cell cycle. Cell cycle regulation is critical for faithful chromosome segregation, and defects in this complicated process lead to chromosomal aberrations and cancer.
Here, we describe an in vitro kinase assay that is used to identify Cdk1-specific phosphorylation sites. In this assay, a purified protein is phosphorylated in vitro by commercially available human Cdk1/cyclin B. Successful phosphorylation is confirmed by SDS-PAGE, and phosphorylation sites are subsequently identified by mass spectrometry. We also describe purification protocols that yield highly pure and homogeneous protein preparations suitable for the kinase assay, and a binding assay for the functional verification of the identified phosphorylation sites, which probes the interaction between a classical nuclear localization signal (cNLS) and its nuclear transport receptor karyopherin &#945;. To aid with experimental design, we review approaches for the prediction of Cdk1-specific phosphorylation sites from protein sequences. Together these protocols present a very powerful approach that yields Cdk1-specific phosphorylation sites and enables mechanistic studies into how Cdk1 controls the cell cycle. Since this method relies on purified proteins, it can be applied to any model organism and yields reliable results, especially when combined with cell functional studies.

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is activated in the G2 phase of the cell cycle and regulates many cellular pathways. Here, we present a protocol for an in vitro kinase assay with Cdk1, which allows the identification of Cdk1-specific phosphorylation sites for establishing cellular targets of this important kinase.

Siklin bağımlı kinaz 1 tanımlaması belirli fosforilasyon siteleri bir Vitro kinaz tarafından tahlil

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

A Simple Method to Identify Kinases That Regulate Embryonic Stem Cell Pluripotency by High-throughput Inhibitor Screening

Embryonic stem cells (ESCs) can self-renew or differentiate into all cell types, a phenomenon known as pluripotency. Distinct pluripotent states have been described, termed &#34;na&#239;ve&#34; and &#34;primed&#34; pluripotency. The mechanisms that control na&#239;ve-primed transition are poorly understood. In particular, we remain poorly informed about protein kinases that specify na&#239;ve and primed pluripotent states, despite increasing availability of high-quality tool compounds to probe kinase function. Here, we describe a scalable platform to perform targeted small molecule screens for kinase regulators of the na&#239;ve-primed pluripotent transition in mouse ESCs. This approach utilizes simple cell culture conditions and standard reagents, materials and equipment to uncover and validate kinase inhibitors with hitherto unappreciated effects on pluripotency. We discuss potential applications for this technology, including screening of other small molecule collections such as increasingly sophisticated kinase inhibitors and emerging libraries of epigenetic tool compounds.

Here, we present a quantitative and scalable protocol to perform targeted small molecule screens for kinase regulators of the na&#239;ve-primed pluripotent transition.

Embriyonik Kök Hücre Pluripotansını Yüksek Verimli İnhibitör Taramayla Düzenleyen Kinazları Tanımlamak İçin Basit Bir Yöntem

Embryonic stem cells (ESCs) can self-renew or differentiate into all cell types, a phenomenon known as pluripotency. Distinct pluripotent states have been ...

Gelişim Biyolojisi

Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets in both physiological and pathological states. CK2 is an evolutionarily conserved serine/threonine kinase with a growing list of hundreds of substrates involved in multiple cellular processes. Due to its pleiotropic properties, identifying and characterizing a comprehensive set of CK2 substrates has been particularly challenging and remains a hurdle in the study of this important enzyme. To address this challenge, we have devised a versatile experimental strategy that enables the targeted enrichment and identification of putative CK2 substrates. This protocol takes advantage of the unique dual co-substrate specificity of CK2 allowing for specific thiophosphorylation of its substrates in a cell or tissue lysate. These substrate proteins are subsequently alkylated, immunoprecipitated, and identified by liquid chromatography/tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). We have previously used this approach to successfully identify CK2 substrates from Drosophila ovaries and here we extend the application of this protocol to human glioblastoma cells, illustrating the adaptability of this method to investigate the biological roles of this kinase in various model organisms and experimental systems.

The objective of this protocol is to label, enrich, and identify substrates of protein kinase CK2 from a complex biological sample such as a cell lysate or tissue homogenate. This method leverages unique aspects of CK2 biology for this purpose.

Kimliği roman CK2 kinaz yüzeylerde çok yönlü bir biyokimyasal yaklaşım kullanarak

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets ...

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important roles for the cell and may unravel new cellular processes. Among proteins, kinases are major actors as they belong to cell signaling pathways and have the ability to switch on or off many processes crucial to the fate of the cell, such as cell growth, division, differentiation, motility, and death.
In this study, we focused on a new potential kinase protein, LIMK2-1. We demonstrated its existence by Western Blot using a specific antibody. We evaluated its interaction with an upstream regulating protein using coimmunoprecipitation experiments. Coimmunoprecipitation is a very powerful technique able to detect the interaction between two target proteins. It may also be used to detect new partners of a bait protein. The bait protein may be purified either via a tag engineered to its sequence or via an antibody specifically targeting it. These protein complexes may then be separated by SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamide Gel) and identified using mass spectrometry. Immunoprecipitated LIMK2-1 was also used to test its kinase activity in vitro by &#947;[32P] ATP labeling. This well-established assay may use many different substrates, and mutated versions of the bait may be used to assess the role of specific residues. The effects of pharmacological agents may also be evaluated since this technique is both highly sensitive and quantitative. Nonetheless, radioactivity handling requires particular caution. Kinase activity may also be assessed with specific antibodies targeting the phospho group of the modified amino acid. These kinds of antibodies are not commercially available for all the phospho modified residues.

We characterized a new kinase protein using robust biochemical approaches: Western Blot analysis with a dedicated specific antibody on different cell lines and tissues, interactions by coimmunoprecipitation experiments, kinase activity detected by Western Blot using a phospho-specific antibody and by &#947;[32P] ATP labeling.

Yeni kinaz proteinin sağlam biyokimyasal yaklaşımlar kullanılarak moleküler düzeyde karakterize edilmesi

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with clinical implications. Several methodologies have been reported to accomplish such screening. However, each has its own limitations (e.g., the screening of only ATP analogues, restriction to using purified kinase domains, significant costs associated with testing more than a few kinases at a time, and lack of flexibility in screening protein kinases with novel mutations). Here, a new protocol that overcomes some of these limitations and can be used for the unbiased screening of kinase inhibitors is presented. A strength of this method is its ability to compare the activity of kinase inhibitors across multiple proteins, either between different kinases or different variants of the same kinase. Self-assembled protein microarrays generated through the expression of protein kinases by a human-based in vitro transcription and translation system (IVTT) are employed. The proteins displayed on the microarray are active, allowing for measurement of the effects of kinase inhibitors. The following procedure describes the protocol steps in detail, from the microarray generation and screening to the data analysis.

A detailed protocol for the generation of self-assembled human protein microarrays for the screening of kinase inhibitors is presented.

Kendi kendine monte Edilen İnsan Protein Mikrodizilerinde Kiaz Inhibitörü Taraması

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) is a 2527 amino acid member of the ROCO family of proteins, possessing a complex, multidomain structure including a GTPase domain (termed ROC, for Ras of Complex proteins) and a kinase domain1. The discovery in 2004 of mutations in LRRK2 that cause Parkinson's disease (PD) resulted in LRRK2 being the focus of a huge volume of research into its normal function and how the protein goes awry in the disease state2,3. Initial investigations into the function of LRRK2 focused on its enzymatic activities4-6. Although a clear picture has yet to emerge of a consistent alteration in these due to mutations, data from a number of groups has highlighted the importance of the kinase activity of LRRK2 in cell death linked to mutations7,8. Recent publications have reported inhibitors targeting the kinase activity of LRRK2, providing a key experimental tool9-11. In light of these data, it is likely that the enzymatic properties of LRRK2 afford us an important window into the biology of this protein, although whether they are potential drug targets for Parkinson's is open to debate.
A number of different approaches have been used to assay the kinase activity of LRRK2. Initially, assays were carried out using epitope tagged protein overexpressed in mammalian cell lines and immunoprecipitated, with the assays carried out using this protein immobilised on agarose beads4,5,7. Subsequently, purified recombinant fragments of LRRK2 in solution have also been used, for example a GST tagged fragment purified from insect cells containing residues 970 to 2527 of LRRK212. Recently, Dani&euml;ls et al. reported the isolation of full length LRRK2 in solution from human embryonic kidney cells, however this protein is not widely available13. In contrast, the GST fusion truncated form of LRRK2 is commercially available (from Invitrogen, see table 1 for details), and provides a convenient tool for demonstrating an assay for LRRK2 kinase activity. Several different outputs for LRRK2 kinase activity have been reported. Autophosphorylation of LRRK2 itself, phosphorylation of Myelin Basic Protein (MBP) as a generic kinase substrate and phosphorylation of an artificial substrate - dubbed LRRKtide, based upon phosphorylation of threonine 558 in Moesin - have all been used, as have a series of putative physiological substrates including &alpha;-synuclein, Moesin and 4-EBP14-17. The status of these proteins as substrates for LRRK2 remains unclear, and as such the protocol described below will focus on using MBP as a generic substrate, noting the utility of this system to assay LRRK2 kinase activity directed against a range of potential substrates.

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Leucine Rich Repeat Kinase 2 is a large multidomain kinase, mutations in which are the most common genetic cause of Parkinson's disease. Analysis of the kinase activity of this protein has proven to be a crucial tool in understanding the biology and dysfunction of this protein. In this paper, in vitro assaying of the kinase activity of LRRK2 and a selection of its mutants is described, providing an experimental system to examine phosphorylation of putative substrates and potential dysfunction of LRRK2 in disease.

LRRK2 Kinaz Aktivitesi Assaying In vitro</em

Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) is a 2527 amino acid member of the ROCO family of proteins, possessing a complex, multidomain structure including a ...

Biyoloji

Biosensor-based High Throughput Biopanning and Bioinformatics Analysis Strategy for the Global Validation of Drug-protein Interactions

Receptors and enzyme proteins are important biomolecules that act as binding targets for bioactive small molecules. Thus, the rapid and global validation of the drug-protein interactions is highly desirable for not only understanding the molecular mechanisms underlying therapeutic efficacy but also for assessing drug characteristics, such as adsorption, distribution, metabolism, excretion, and toxicity (ADMET) for clinical use. Here, we present a biosensor-based high throughput strategy for the biopanning of T7 phage-displayed short peptides that can be easily displayed on the phage capsid. Subsequent analysis of the amino acid sequences of peptides containing short segments, as &#34;broken relics&#34;, of the drug-binding sites using bioinformatics programs in receptor ligand contact (RELIC) suite, is also shown. By applying this method to two clinically approved drugs, an anti-tumor irinotecan, and an anti-flu oseltamivir, the detailed process for collecting the drug-recognizing peptide sequences and highlighting the drug-binding sites of the target proteins are explained in this paper. The strategy described herein can be applied for any small molecules of interest.

This study aimed to present a strategy for identifying drug-peptide interactions. The strategy involves the biopanning of drug-recognizing short peptides based on a quartz-crystal microbalance (QCM) biosensor, followed by bioinformatics analysis for quantitatively assessing the information obtained for the drug recognition and annotation of the drug-binding sites on proteins.

İlaç-protein Etkileşimlerinin Küresel Doğrulanması için Biyosensör Tabanlı Yüksek Verimli Biyopanning ve Biyoinformatik Analiz Stratejisi

Receptors and enzyme proteins are important biomolecules that act as binding targets for bioactive small molecules. Thus, the rapid and global validation ...

Biyomühendislik

High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels

Specific members of the inward rectifier potassium (Kir) channel family are postulated drug targets for a variety of disorders, including hypertension, atrial fibrillation, and pain1,2. For the most part, however, progress toward understanding their therapeutic potential or even basic physiological functions has been slowed by the lack of good pharmacological tools. Indeed, the molecular pharmacology of the inward rectifier family has lagged far behind that of the S4 superfamily of voltage-gated potassium (Kv) channels, for which a number of nanomolar-affinity and highly selective peptide toxin modulators have been discovered3. The bee venom toxin tertiapin and its derivatives are potent inhibitors of Kir1.1 and Kir3 channels4,5, but peptides are of limited use therapeutically as well as experimentally due to their antigenic properties and poor bioavailability, metabolic stability and tissue penetrance. The development of potent and selective small-molecule probes with improved pharmacological properties will be a key to fully understanding the physiology and therapeutic potential of Kir channels.
The Molecular Libraries Probes Production Center Network (MLPCN) supported by the National Institutes of Health (NIH) Common Fund has created opportunities for academic scientists to initiate probe discovery campaigns for molecular targets and signaling pathways in need of better pharmacology6. The MLPCN provides researchers access to industry-scale screening centers and medicinal chemistry and informatics support to develop small-molecule probes to elucidate the function of genes and gene networks. The critical step in gaining entry to the MLPCN is the development of a robust target- or pathway-specific assay that is amenable for high-throughput screening (HTS).
Here, we describe how to develop a fluorescence-based thallium (Tl+) flux assay of Kir channel function for high-throughput compound screening7,8,9,10.The assay is based on the permeability of the K+ channel pore to the K+ congener Tl+. A commercially available fluorescent Tl+ reporter dye is used to detect transmembrane flux of Tl+ through the pore. There are at least three commercially available dyes that are suitable for Tl+ flux assays: BTC, FluoZin-2, and FluxOR7,8. This protocol describes assay development using FluoZin-2. Although originally developed and marketed as a zinc indicator, FluoZin-2 exhibits a robust and dose-dependent increase in fluorescence emission upon Tl+ binding. We began working with FluoZin-2 before FluxOR was available7,8 and have continued to do so9,10. However, the steps in assay development are essentially identical for all three dyes, and users should determine which dye is most appropriate for their specific needs. We also discuss the assay's performance benchmarks that must be reached to be considered for entry to the MLPCN. Since Tl+ readily permeates most K+ channels, the assay should be adaptable to most K+ channel targets.

Methods for developing and validating a quantitative fluorescence assay for measuring the activity of inward rectifier potassium (Kir) channels for high-throughput compound screening is presented.

İçte düzeltici Potasyum Kanallarının Küçük moleküllü Modülatörler için Yüksek throughput Eleme

Specific members of the inward rectifier potassium (Kir) channel family are postulated drug targets for a variety of disorders, including hypertension, ...

Probing High-density Functional Protein Microarrays to Detect Protein-protein Interactions

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an affinity purified yeast kinase fusion protein containing a V5-epitope tag for read-out. Purified kinase is obtained through culture of a yeast strain optimized for high copy protein production harboring a plasmid containing a Kinase-V5 fusion construct under a GAL inducible promoter. The yeast is grown in restrictive media with a neutral carbon source for 6 hr followed by induction with 2% galactose. Next, the culture is harvested and kinase is purified using standard affinity chromatographic techniques to obtain a highly purified protein kinase for use in the assay. The purified kinase is diluted with kinase buffer to an appropriate range for the assay and the protein microarrays are blocked prior to hybridization with the protein microarray. After the hybridization, the arrays are probed with monoclonal V5 antibody to identify proteins bound by the kinase-V5 protein. Finally, the arrays are scanned using a standard microarray scanner, and data is extracted for downstream informatics analysis1,2 to determine a high confidence set of protein interactions for downstream validation in vivo.

Using protein microarrays containing nearly the entire S. cerevisiae proteome is probed for rapid unbiased interrogation of thousands of protein-protein interactions in parallel. This method can be utilized for protein-small molecule, posttranslational modification, and other assays in high-throughput.

Yüksek yoğunluklu Fonksiyonel Protein mikrodizileri Probing Protein-protein Etkileşimleri Algılama

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an ...