Bu eser K12 HD068322 (SCM) tarafından desteklenen; R01 CA179921 ve P51 OD011092 (AVM); ve 14PRE20320014 Amerika Kalp Derneği (SB) Ödülü.

Not: Bu protokol için açıklanan tüm yordamları BSL-2 koşullar altında gerçekleştirilmelidir.
 1. KSHV hisse senedi hazırlık <ol><li>hazırlamak TNE arabellek: 292.24 mg EDTA GKD 2 O dağıtılması, 225 mL getirmek ve pH 8 ayarlayın. GKD 2 O 605.7 mg Tris dağıtılması, 225 mL getirmek ve pH 8 ayarlayın. EDTA ve Tris çözümleri birleştirmek, 4,38 g NaCl ekleyin, 500 ml nihai ses düzeyini ayarlama, filtre sterilize ve mağaza 4 ° C'de .</li>
	<li>Kültür KSHV pozitif, 37 ° C artı % 5 CO %2 10 ısı inaktive fetal sığır serum (FBS) ve yaklaşık 1 antimicrobials ile takıma RPMI oksijen bir kuluçka EBV negatif birincil efüzyon Lenfoma hücre kültürünü BCBL-1 1.2 mL başına 10 6 hücre x için.</li>
	KSHV üretim, ikna etmek için <li>kültürler 1:2 taze orta ile bölünmüş ve 20 ng/mL nihai bir konsantrasyon Phorbol 12-Myristate 13-asetat (PMA) ekleyin ve kültürler için 5 gün kuluçkaya. Alternatif olarak, sodyum bütrat (NaB; 0,1 mM) litik viral çoğaltma ikna etmek 3 gündür hücrelerle tedavi.</li>
	<li>İlk viral parçacıkların hasat için 300 x g hücreleri cips ve supernatants taze tüpler aktarmak için oda sıcaklığında 5 min için de süpernatant kültür santrifüj kapasitesi..</li>
	<li>Daha da böylece hücresel enkaz, transferini önlemek için süpernatant netleştirmek için santrifüj kapasitesi 2500 x g 10 min için de 4'te ° C. 
	Not: Alternatif olarak yüksek hızlı Santrifüjü için açıklama kültür supernatants, filtrasyon yoluyla bir steril 0.45 µm filtre gerçekleştirilebilir. Filtrasyon kullanarak titresi önemli bir düşüş gözlemledik; Bu nedenle, biz düzenli olarak ikinci Santrifüjü yerine adımıysa.</li>
	<li>Sonra 5 mL % 25 Sükroz çözeltisi TNE arabelleği ile yaklaşık 30 mL 6 ultracentrifuge tüplerde süpernatant açıklık kültürünün yerleşimi.</li>
	<li>Santrifüj tüpleri 75.000 x g vakum altında 4 ° C'de 2 h için de dengeli.</li>
	<li>Kültür süpernatant dikkatle boşaltmak ve mümkün olduğu kadar süpernatant ve sukroz çözümü kaldırmak için her tüpün kenarında leke, sonra TNE arabellek 150 µL içinde görünür olmayabilir virüs Pelet resuspend.</li>
	<li>Resuspended havuzu tüm virüs, karıştırın ve 25 µL aliquots .-80 ° C'de dondurmak</li>
</ol> 2. EC E6 ve E7 Papilloma virüsü genler ile iletim Not: Biz düzenli olarak birincil EC büyüyen için standart doku kültürü şişeler kullanın Ancak, EC yetersiz büyüme aldıysanız o zaman ticari kültür şişeler kullanımı düşünülmelidir.
<ol><li>Kültür birincil insan dermal mikrovasküler veya lenfatik EC 37 ° C artı %5 oksijen bir kuluçka CO 2 EC büyüme orta (EGM; EC Bazal orta EGM-2 [içeren FBS, BulletKit ile birlikte [EBM] içerir hidrokortizon, insan fibroblast büyüme faktörü-B, vasküler EC büyüme faktörü, insülin benzeri büyüme faktörü-1, askorbik asit, insan epitelyal büyüme faktörü, antibiyotik ve heparin]) içinde bir T75 hücre kültür şişesi için yaklaşık % 50 izdiham.</li>
	<li>İletim için kültür PA317 LXSN 16E6E7 24 , 35 37 ° C de oksijen bir kuluçka artı % 5 CO 2 ile %10 FBS ve içinde antimicrobials takıma DMEM hücreleri bir Yaklaşık % 90 birleşmesi onlar kadar T150 hücre kültür cep şişesi. Sonra bir gecede kuluçkaya orta 16 mL.</li>
	<li>300 x g oda sıcaklığında 5 min için de centrifuging tarafından PA317 orta netleştirmek.</li>
	<li>Açıklık PA317 Orta 12 mL EC kültür ve yerleşimi hücrelerle EGM kaldırmak ve 4 h için kuluçkaya 
	Not: 300 x g eritilmiş süpernatant 12 mL dikkatli sonraki kaldırma tarafından rahatsız değil kompakt bir Pelet sonuçlarında 5 min için de şartına orta 16 mL Centrifuging. Ancak, birincil EC kültür PA317 LXSN 16E6E7 hücrelerinin transferi (ambalaj hücre kültürünü EC hızla büyümek) bir endişe ise, o zaman filtrasyon şartına süpernatant transferi önce 0,45 µm filtre aracılığıyla gerçekleştirilebilir.</li>
	<li>PA317 orta 6 mL taze EGM ile değiştirip gecede kuluçkaya.</li>
	<li>Refeed EC ile 12 mL taze EGM ve bir daha da 48 h. kuluçkaya</li>
	<li>EC alt kültür için orta kaldırın ve PBS katyonlar, olmadan 12 mL yıkayın ve ticari enzimatik ayrılma çözüm (örneğin, TrypLE) tarafından 3 mL ekleyin ve 3 dk. 37 ° C'de kuluçkaya</li>
	<li>Hücre süspansiyon 15 mL konik tüp aktarmak ve 300 x g oda sıcaklığında 5 min için de santrifüj kapasitesi. Elde edilen hücre Pelet taze EGM resuspend ve 3 x T75 şişe şişe başına 12 mL EGM son hacmi ile eşit bölün.</li>
	<li>E6 ve E7 ile transduced EC için seçmek için G418 200 µg/mL sonra transduced EC olması enfeksiyon için kaplama veya sıvı azot içinde donmuş iki pasajlar için son bir konsantrasyon ekleyin.</li>
</ol> 3. Enfeksiyon Transduced EC KSHV ile <ol><li>gün önce enfeksiyon EC yukarıda açıklandığı gibi ticari enzimatik ayrılma çözüm kullanarak tekrar tekrar Enzimatik sindirim tarafından hasat. Hücre Pelet EGM 1 mL resuspend. Trypan mavi bir 1/10 seyreltme hazırlamak için 5 µL hücre kullanın. Saymak bir hemasitometre kullanarak canlı hücreleri ve 2. 5 x 10 5 canlı hücrelerde EGM 2 mL 6 iyi plakaları bir kuyu başına tohum.</li>
	<li>Enfeksiyon gününde, EGM kaldırmak ve iyi yıkama PBS 3 mL kalsiyum ve magnezyum içeren hücreleri ve 2 mL EBM ekleyin. 
	Not: EGM heparin bağlama için viral parçacıkların ve hedef EC sonraki enfeksiyon yapılmasını engeller EGM yerine EBM enfeksiyon sırasında kullanmak için gerekli gibi</li>
	<li>KSHV, hücrelerle bulaştırmak için her şey için 5 ila 20 µL virüs stok ekleyin ve karıştırmak için plaka girdap. Sahte enfekte hücreleri TNE arabelleği eşit bir birim için her şey eklemek için.</li>
	<li>Plakalar, 400 x g için oda sıcaklığında 30 dk santrifüj kapasitesi ve sonra 90 dk. 37 ° C'de plakaları kuluçkaya</li>
	Çalışmanın amacı bir zaman uyumlu viral enfeksiyon, örneğin, erken de novo enfeksiyon, olaylarda gerektiren erken olayları araştırmak için ise <li>Bu noktada viral inoculum kaldırın. Durulama ve 2 mL hücrelerle refeed taze EGM. Aksi takdirde, 2 mL EGM ekleyin ve kültürler gecede kuluçkaya.</li>
	<li>2 mL EGM hücrelerle gün enfeksiyon ve sonra her gün sonra refeed.</li>
	Hücreleri yaklaşık % 90 birleşmesi, ne zaman <li>yukarıda açıklandığı gibi ticari enzimatik ayrılma çözüm kullanarak tekrar tekrar Enzimatik sindirim tarafından hasat, daha sonra toplam geçiş sayısı ve geçit belirterek hücreleri bir T75 içine üç kuyulardan havuz sonrası enfeksiyon.</li>
	<li>Genişletmek sahte ve KSHV-enfekte EC 1:3 bölmeleri için hangi zamanda hücreleri olabilir deneylerde kullanılan veya sıvı azot içinde donmuş en az iki daha fazla geçişleri ile. 
	Not: EC E6 ve E7 ile transduced gibi bölme ile sahte ve KSHV enfekte hücreleri kültürleri bakım izdiham (~ 85-%90) ulaşmadan önce bölünmesi.</li></ol>
 4. teyit enfeksiyon KSHV ayirt tarafından ile Not: KSHV gecikme süresi ilişkili nükleer antijen (LANA-1/ORF73) olarak algılanmasını sağlar enfeksiyonu güvenilir niceliksel ölçüsüdür. Anti-LANA antikorlar piyasada.
<ol><li>Boyama, önceki gün her ile sahte veya KSHV-enfekte EC 1 x 10 5 24-şey tabakta hücreleri başı plaka iki kuyu iyi 1 mL EGM ve gecede kuluçkaya.</li>
	<li>Yıkama hücreleri iki kez 500 µL PBS artı kalsiyum ve magniseum. Yıkama 30 s sallanan bir platformda.</li>
	<li>Bir harici ventillated duman başlık, 500 µL % 4 paraformaldehyde oda sıcaklığında 15 dakika ile hücreleri saptamak.</li>
	<li>Yıkama hücreleri üç kez yıkama arabelleği (%0.1 Triton X-100 artı %0.02 keçi serum PBS artı Özellikler) 500 µL.</li>
	<li>Blok 500 µL % 2 keçi serum, oda sıcaklığında 30 dakika yıkama arabellekte hücrelerle.</li>
	<li>Yıkama hücreleri üç kez yıkama arabelleği 500 µL.</li>
	<li>Bir şey, sahte veya KSHV-1:10 EC 200 µL birincil antikor ile seyreltilmiş enfekte etiketbir rocker üzerinde oda sıcaklığında 30 dk için yıkama arabellek 0. Yıkama arabellek yalnızca 200 µL içinde kalan iki wells kuluçkaya.</li>
	<li>Yıkama hücreleri üç kez yıkama arabelleği 500 µL.</li>
	<li>Tüm dört wells 200 µL ikincil antikor seyreltilmiş 1: 100 yıkama arabellekte bir rocker üzerinde oda sıcaklığında 30 dakika ile etiketleyin.</li>
	<li>Yıkama hücreleri üç kez yıkama arabelleği 500 µL.</li>
	<li>Her şey için orta içeren DAPI ve bir coverslip montaj 20 µL uygulamak ve ters bir floresan mikroskop kullanarak boyama değerlendirmek.</li>
	<li>KSHV enfekte hücreleri yüzde enfeksiyon LANA-pozitif çekirdek en az 200 hücrelerdeki sayısını sayarak belirler. Rekombinant KSHV-Bac16 da izlenen GFP ifade kültürlerin gözlem yoluyla ile enfeksiyon.</li>
</ol>

Oncogenesis bir organizma36içinde önemli güvenlik önlemlerinin circumvents multistep bir süreçtir. KS lezyonlar kronik inflamasyon gerçek eklem dokusu Uru için bir spektrum boyunca var gibi aydınlatma KSHV tarafından aracılı belirli patofizyolojik süreçlerin bazı çalışmalar dönüşümü9çekmek için hücre kültür modellerinde yürütülmelidir gerektirir. Bu kaybı temas inhibisyonu ve anchorage bağlı büyüme, fenotipleri hücresel dönüşümü, gösterge kolayca geliştirmek mi unutulmamalıdır birincil EC veya EC Revers eksojen ifade tarafından ölümsüzleştirilmiş enfeksiyonu takip. Burada açıklanan KS vitro modelinin explanted KS hücreleri davranışını veya KS tümör microenvironment tüm yönleriyle özetlemek değil iken, bu nedenle, bu konak hücre gen ekspresyonu ile enfeksiyon tarafından indüklenen değişimler eğitimi için benzersiz olarak uygundur KS tumorigenesis için katkıda KSHV.
İlk burada açıklanan kültür sistemi kullanarak çalışma profil oluşturma gen ekspresyonu KSHV enfekte hücreleri25dönüştürülmüş fenotip katkıda bir reseptör tirozin kinaz c-Kit tanımlanan bildirdi. C-Kit ifade siRNA veya inhibisyon bir baskın olumsuz yapı veya tirozin kinaz inhibitörü STI 571 (Imatinib) KSHV bildirimi dönüştürme yeteneği ile uzun süredir devam eden sonra foci oluşumu kaybı tarafından müdahale c-Kit sinyal kullanarak kullanarak yıkmak enfekte hücreleri kültür. Imatinib sonraki klinik değerlendirilmesi bu ilaç salgın KS47,48,49olan hastalarda etkinliğini göstermiştir. Diğer olası tedavi hedefleri de, hem Siklooksijenaz-126,50, CXCR727ve beta adrenergic reseptörleri28tüm bunların büyüme ya da dönüştürme bir rol oynamaktadır, dahil olmak üzere tespit edilmiştir EC tüp bebek. Onay birincil EC KS biyopsi doku bu sistem fizyolojik uygunluğunu onaylıyor ve KS therapeutics25,26için önceden klinik bir model olarak değerini vurgular yanı sıra bu gen ifade kalıplarının 51,52,53,54,55.
Uzun ömrü ile karşılaştırıldığında birincil EC sağlar yaş ve sahte enfekte denetim geçiş eşlemeli hücreleri KSHV sonucu karşılaştırmalı değerlendirme için uzun vadeli bakım ölümsüzleştirilmiş E6/E7 iletim sisteminin başka bir güç olduğunu enfeksiyon. E6 ve E7 kültürlerin kesiştiği yerde (~ 85-%90) ulaşmadan önce bölmek için önemlidir transduced EC geçişleri sayısını en üst düzeye çıkarmak için unutmamak önemlidir. Ayrıca, bu hücreleri uzun bir süre için serum-Alerjik koşullar tahammül. Birincil EC hızla büyüme faktörü çekilmesi üzerine programlanmış hücre ölümü geçmesi ve bu nedenle serum veya rekombinant büyüme faktörleri56,57olmadan uzun süre kültürlü olamaz. Önce tam dönüşüm KSHV enfekte hücreleri de programlı hücre ölümü (yayınlanmamış büyüme faktörü çekilmesi üzerine geçirecek gibi enfeksiyon KSHV belirlemek ve çalışma, zor ile indüklenen yolları sinyal otokrin bu bağımlılık yapar gözlem). Bu modelde, ancak, E6 ve E7 proteinleri varlığı büyüme faktörü çekilme takip programlı hücre ölümü önlemek ve uzun süreli (örneğiniçin 48 h) izin kültür düşük serum veya serum ücretsiz orta25,26 , 28.
KS kronik inflamasyon ve hücresel dönüştürme özellikleri ile karmaşık ve sıradışı bir hastalıktır. Büyük roman tedavi stratejileri için klinik ihtiyacıdır ve burada açıklanan hücre kültür model aday değerlendirilmesi uyuşturucu hedefler izin vermesi eşsiz özellikleri vardır.

Kaposi sarkomu (KS) en çok geliştiren gelişmiş bağışıklık suppression1ayarı dermal, Mukozal ve visseral sitelerini etkileyen bir multifokal angioproliferative tümördür. Dört epidemiyolojik formu tarif edilmiştir: Klasik, genellikle Akdeniz ve Orta Doğu mirası; büyük insanı etkileyen bir tembel formu iyatrojenik, organ nakli takip immünsupresif ilaçlar ile tedavi sonucunda; salgın, bir AIDS tanımlama kanser; ve endemik, Afrika endemik bölgelerde çocuklarda yaygın bir HIV bağımsız formu. HIV tedavisinde etkili kombinasyonu anti-retroviral uyuşturucu rejimleri gelişiyle, salgın KS gelişmekte olan ülkelerde daha az yaygın olarak teşhis edilir. Ancak, klinik olarak agresif endemik ve salgın formları arasında en sık tanı kanser birçok Afrika ülkeleri2,3,4kalır. Bu nedenle, kimlik KS tedavisi için Patogenez hedefli etkili ilaçların bir araştırma önceliktir.
Histolojik olarak, KS lezyonlar geniş ama anormal neovaskülarizasyon sayede iğ hücreleri EC kökenli kesintili damar ağları5formu karakterizedir. Bu anormal gemiler ("vasküler yırtmaçlı") lezyonlar onların karakteristik renk ver eritrositler ekstravazasyonu izin. Ayrıca, lezyonlar kronik inflamasyon (yani, lenfosit, makrofaj ve plazma hücreleri) karakterize çok sayıda lökosit içerir. KS proliferatif hiper lezyon ve bir gerçek tümör6,7,8,9özelliklere sahiptir düşündüren regresyon bağışıklık sulandırma takip KS lezyonların tanımlanmıştır.
KS herpesvirus (KSHV), KS, hastalığının 199410dakika sonra tespit edilmiştir. Modeller geliştirilmiştir sonra birçok vitro hücre kültürü beri Patogenez çalışmalar etkinleştirmek için hücreleri de dahil olmak üzere tümör biyopsi malzeme ve ilköğretim explanted veya EC Revers ifade KSHV vitro11 ile enfekte , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18. mevcut modelleri hiçbiri tam olarak KS tümör microenvironment tablodur, ama tüm değerli bilgi KSHV enfeksiyon pathobiology anlayışımız için bulunmuştur. Diğer bilinen tumorigenic insan herpesvirus Epstein - Barr virüsü (EBV), KSHV kolayca hücre kültüründe de novo enfeksiyon19,20,21, takip dönüştürmek değil 22. ancak, bu sınırlama birincil insan EC ya mikrovasküler veya lenfatik kökenli E6 ile karışık transducing tarafından üstesinden ve HPV E7 genler 16 KSHV23,24 mantar enfeksiyonu önce yazın . Bu eksojen oncogenes ifade önemli ölçüde KSHV vitro dönüşüm potansiyelini kısmen daha fazla Retinoblastom protein ve p5323,24inhibisyonu sağlayarak artırır. Bu EC iletim yöntemi ev sahibi anahtar değişiklikleri tanımlamak için birden çok laboratuvarlar bu KSHV enfeksiyon tarafından indüklenir ve KS hücre hayatta kalma ve nükleer silahların yayılmasına karşı25,26 kolaylaştırmak için görünen hücre gen ekspresyonu izin verdi , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32. burada açıklanan protokoller basit ve son derece tekrarlanabilir ve üretimi Primer hücre daha çok uzun süre kültürlü ve sahte enfekte kontrol eder ve yaş ve geçiş Bahisler KSHV enfekte EC neden olur oncogenic mekanizmaları KSHV tarafından istihdam incelenmesi için izin verir. Protokol vahşi KSHV satırından birincil efüzyon Lenfoma hücre BCBL-1, E6/E7-ölümsüzleştirilmiş EC de son derece duyarlı türü üretim için bir yöntem bulunmasına karşın rekombinant BACmid ile enfeksiyon KSHV-BAC1630türetilmiş. İletişim kuralları BAC16 hazırlanması için başka bir yerde açıklanan33,34.

<table><tbody><tr><td>BCBL-1 cells</td><td>NIH AIDS Reagent Program</td><td>3233</td><td></td></tr><tr><td>PA317 cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-2203</td><td></td></tr><tr><td>Neonatal dermal microvascular endothelial cells</td><td>Lonza</td><td>CC-2505</td><td></td></tr><tr><td>EBM-2 Basal Medium</td><td>Lonza</td><td>CC-3156</td><td></td></tr><tr><td>EGM-2 BulletKit</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td></td></tr><tr><td>anti-KSHV LANA/ORF 73</td><td>Advanced Biotechnologies</td><td>13-210-100</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt;Express, no phenol red</td><td>ThermoFisher</td><td>12604013</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS with calcium and magnesium</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

an in vitro model for studying cellular transformation by kaposi sarcoma herpesvirus

Kaposi sarkomu (KS) enfeksiyon KSHV ile endotel hücrelerinin (EC) tarafından başlatılan ve en sık immünosupresyon ayarında geliştirir Proliferasyona iğ hücreleri oluşur alışılmadık bir tümör var. Onlarca yıllık araştırma rağmen KS en uygun tedavi kötü tanımlanmış kalır ve klinik sonuçlar kaynak sınırlı ayarları özellikle olumsuz. KS lezyonlar patolojik anjiogenezi, kronik inflamasyon ve oncogenesis tarafından tahrik edilmektedir ve bu süreçlerin çalışmaya çeşitli vitro hücre kültür modelleri geliştirilmiştir. EC-lineage hücreleri Spindl Hücre habercisi en uygun vitro vekilleri sağlamak böylece KS endotel kökenli KSHV enfekte hücrelerden doğar. Ancak, AK bir sınırlı vitro ömrü olduğundan ve KSHV tarafından istihdam oncogenic mekanizmaları daha az bu tumorigenic diğer virüsler daha verimli olduğu gibi bu ilkokulda dönüştürme işlemleri değerlendirmek zor olmuştur ya da Revers ölümsüzleştirilmiş EC Bu nedenle, bir roman kültür EC tabanlı model kolayca KSHV mantar enfeksiyonu takip dönüşümü destekleyen geliştirilmiştir. HPV tip 16 E6 ve E7 genlerinin Ektopik ifade genişletilmiş kültür, yaş ve geçiş Bahisler sahte ve KSHV-enfekte EC için izin verir ve gerçekten dönüştürülmüş gelişimini destekleyen (yani tumorigenic) enfekte hücre kültürlerinde fenotip . KS bu uysal ve son derece tekrarlanabilir model klinik ayarları içine çeviri için yüksek potansiyele sahip birkaç temel sinyal yolları keşfi kolaylaştırdı.

Birincil EC morfolojisi klasik "Arnavut kaldırımı taşı" olarak tanımlanır ve bu Morfoloji Papilloma virüsü E6 ve E7 genlerinin (şekil 1A) ifade tarafından değiştirilmez. İfade yalnız E6 ve E7 genlerinin dönüştürülmüş bir fenotip neden değil; Böylece, hücreleri inhibisyon temas duyarlı ve izdiham kültür ulaşan üzerine bölen sona erecek. Hücreler ancak çoğalırlar ve trypsinization ve kültürlerin yaş ve geçiş Bahisler kullanmak için sahte enfekte denetimleri olarak bakım için izin veren bir daha düşük yoğunluk, replating üzerine izdiham regrow.
E6/E7-transduced EC KSHV ile enfeksiyon KS lezyonlar (şekil 1B) gözlenen "Spindl Hücre" fenotip anımsatan kültür dramatik morfolojik değişiklikler neden olur. Dönüştürülmüş bir fenotip Ayrıca KSHV, mantar enfeksiyonu üzerine hücreler kültürlü sonrası izdiham (Şekil 1 c) anchorage bağımsız büyüme yumuşak agar (Şekil 2) ne zaman ve hangi bildirimi kısmen temas inhibisyonu tarafından kayıptır indüklenen. Temas inhibisyonu ve ekstra hücresel matris etkileşimleri (ankraj) bağımlılığını oncogenesis sırasında kaybı hücresel dönüştürme36işaretlerinden ikisidir. Birincil EC de KSHV enfeksiyona duyarlı ve birincil EC sistemleri virüs ana bilgisayar etkileşimi ve sonuçları çeşitli yönlerini elucidating için son derece değerli olmuştur unutmamak gerekir. Bu tür çalışmalar literatürde temsil ve çeşitli örnekler burada işaret vardır37,38,39,40,41,42,43 ,44.
İmmünfloresan boyama KSHV enfekte hücreleri iğ morfolojisi viral protein LANA-1/ORF73 (şekil 3A ve 3B, kırmızı) ifadesi ile ilişkili olduğunu gösterir. Gibi virüs stokları konsantrasyonu hazırlıkları arasında değişir, böylece KSHV enfekte kültürler ulaşmak iyi eklendi virüs hacmi ayarlanması gereken &#62; % 90 enfeksiyon bir ya da iki pasajlar içinde. Seri geçiş ile enfeksiyon yüzdesi % 100 yaklaşım olacaktır ve kültür (yaklaşık 20 pasajlar) süresince muhafaza edilecektir. Virüs daha düşük miktarlarda parakrin etkiler incelenmesi amaçlanmıştır yoksa bitişik etkilenmemiş hücreleri arzu denetimler (örneğin, diğer proteinler ilgi içeren ayirt Etütleri) olarak kullanılabilir. Virüslü kültürler de ifade litik viral proteinlerin destekler ancak KS lezyonlarının gözlemlediği gibi sadece bir azınlık hücre kültüründe kendiliğinden litik yeniden etkinleştirme (şekil 3B, yeşil) geçirecek. KSHV-hangi GFP ile etiketlenir, BAC16 ile enfekte hücreleri de bir Milli Morfoloji (şekil 3 c ve 3D) geliştirmek. KSHV-BAC16 kullanıldığında, viral titreleri konsantre virüs seri olarak seyreltilmiş hisse senedi içeren hücreleri bulaşmasını ve hücreleri kullanarak Akış Sitometresi3048 saat sonrası enfeksiyon, GFP ifade değerlendirme tarafından elde edilebilir.
Rekombinant ve WT virüs için hisse senedi müstahzarları viral genomları da enfekte hücreleri KSHV DNA düzeyleri PCR miktar tarafından takip DNA'dan arındırıcı tarafından ölçülebilir; Ancak, bir bütün genleri bulaşıcı45olduğunu varsayalım değil. KSHV litik döngüsü çalışması isteniyorsa, virüs yeniden etkinleştirme elde edilebilir EC reaktivasyonu verimliliğini alt23olmasına rağmen ajanlar BCBL-1 hücreler için yukarıda açıklandığı gibi inducing ile uyarıcı. Litik döngüsü de EC iletim KSHV transactivator protein ORF5046tarafından bağlı olmak. Diğer hücre kültür modellerinin KS, spontan ifade hem de bir istikrarlı latent enfeksiyon11,16 bakım rağmen zaman içinde E6/E7-ifade EC azalır KSHV litik genlerin kimyasal indüksiyon bulguları ile uyumlu .
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/54828/54828fig1.jpg"> 
Şekil 1: sahte - morfoloji ve KSHV enfekte EC (A) sahte enfekte EC monolayers sergi klasik Arnavut kaldırımı faz kontrast hayati mikroskobu tarafından taş görünümü. KSHV genler eylemleri olmadan bu hücreleri değil dönüştürülür bu nedenle bölen ateşkes ve kişi izdiham kültür ulaşan üzerine inhibisyon sergilemek. (B) KSHV enfekte hücreleri, buna ek olarak, bir uzun "Spindl Hücre" Morfoloji KS iğ hücrelerinin anımsatan geliştirmek. Bu panel KSHV enfekte hücre morfolojisi gün 5 gösterir PI kesiştiği yerde ulaşan üzerine. (C) içinde KSHV enfekte hücreleri, hangi belli olur KSHV enfekte hücreleri geçiş kültürlü zaman hücresel dönüşüm, konak hücre gen ifadesinde kapsamlı değişiklikler neden. Bu koşullar altında bile çok katmanlı foci Hücre gelişimine lider izdiham ulaştıktan sonra Proliferasyona KSHV enfekte hücreleri devam. Bu panel KSHV enfekte hücre morfolojisi gün 14 saat gösterir PI, 9 gün sonrası izdiham için kültürlü. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54828/54828fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/54828/54828fig2.jpg"> 
Şekil 2: Anchorage bağımsız büyüme. Dönüştürülmemiş hücrelere genellikle bir substrat, anoikis adı verilen bir işlem ile temas kaybı takip apoptotik hücre ölümü tabi. Değil dönüştürülür, yumuşak agar askıya ve iki hafta boyunca onlar koloniler oluşturmaz kültürlü(a)ne zaman E6/E7 transduced sahte enfekte EC. Virüs dönüştürülmüş olan (B) KSHV enfekte EC ve anoikis için dayanıklı yumuşak agar kolonilerde oluşturacak. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54828/54828fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/54828/54828fig3.jpg"> 
Şekil 3: viral protein ifade gösteri. (A) Milli Morfoloji, KSHV ile enfeksiyon sonrasında belirgindir (40 X büyütme). (B), (A) gösterilen aynı alanın immünfloresan boyama iğ Morfoloji viral gecikme süresi protein ORF73 ifade (kırmızı) ile ilişkili olduğunu gösterir. Enfekte hücreleri de, viral pro ifade hücreleri küçük bir yüzdesi oranında gösterildiği litik viral çoğaltma desteğicessivity faktörü ORF59 (yeşil). (A ve B başvuru26değiştirilme.) İğ Morfoloji KSHV-BAC16 virüsü (C) hücre ifade GFP (D) ile ilişkilidir (20 X büyütme). <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54828/54828fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus at JoVE.com

An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus

Kaposi sarkomu (KS) enfeksiyon oncogenic virüs insan herpesvirus-8/KS herpesvirus (HHV-8/KSHV) ile indüklenen bir tümördür. Burada açıklanan endotel hücre kültür model benzersiz olarak hangi konak hücreleri KSHV dönüşümleri mekanizmaları eğitim için uygundur.

Hücresel dönüştürme Kaposi sarkomu Herpesvirus tarafından eğitim için bir Vitro modeli

Kaposi sarcoma (KS) is an unusual tumor composed of proliferating spindle cells that is initiated by infection of endothelial cells (EC) with KSHV, and ...

an-vitro-model-for-studying-cellular-transformation-kaposi-sarcoma

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus

8.2K Görüntüleme.  University of Minnesota Medical School. Kaposi sarkomu (KS) enfeksiyon oncogenic virüs insan herpesvirus-8/KS herpesvirus (HHV-8/KSHV) ile indüklenen bir tümördür. Burada açıklanan endotel hücre kültür model benzersiz olarak hangi konak hücreleri KSHV dönüşümleri mekanizmaları eğitim için uygundur.

Video: An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus

Identifying Dysregulated Genes Induced by Kaposi's Sarcoma-associated Herpesvirus (KSHV)

Currently KS is the most predominant HIV/AIDS related malignancy in Southern Africa and hence the world.1,2 It is characterized as an angioproliferative tumor of vascular endothelial cells and produces rare B cell lymphoproliferative diseases in the form of pleural effusion lymphomas (PEL) and some forms of multicentric Castleman's disease.3-5 Only 1-5% of cells in KS lesions actively support lytic replication of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV), the etiological agent associated with KS, and it is clear that cellular factors must interact with viral factors in the process of oncogenesis and tumor progression.6,7 Identifying novel host-factor determinants which contribute to KS pathology is essential for developing prognostic markers for tumor progression and metastasis as well as for developing novel therapeutics for the treatment of KS.8 The accompanying video details the methods we use to identify host cell gene expression programs altered in dermal microvascular endothelial cells (DMVEC) after KSHV infection and in KS tumor tissue.9 Once dysregulated genes are identified by microarray analysis, changes in protein expression are confirmed by immunoblot and dual labeled immunofluorescence. Changes in transcriptional expression of dysregulated genes are confirmed in vitro by quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR). Validation of in vitro findings using archival KS tumor tissue is also performed by dual labeled immunochemistry and tissue microarrays.8,10 Our approach to identifying dysregulated genes in the KS tumor tissue microenvironment will allow the development of in vitro and subsequently in vivo model systems for discovery and evaluation of potential novel therapeutic for the treatment of KS.

Identifying Dysregulated Genes Induced by Kaposi's Sarcoma-associated Herpesvirus KSHV

Host cell factors play a critical role in the establishment and maintenance of Kaposi's sarcoma (KS). We outline methods to identify host cell factors altered in KSHV-infected DMVEC cells, and in KS tumor tissue. Cellular genes altered by virus will serve as potential target(s) for novel therapeutics.

Kaposi sarkomu ile ilişkili Herpes (KSHV) Yol Açtığı düzensiz Genler belirlenmesi

Currently KS is the most predominant HIV/AIDS related malignancy in Southern Africa and hence the world.1,2 It is characterized as an angioproliferative ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Dissecting Host-virus Interaction in Lytic Replication of a Model Herpesvirus

In response to viral infection, a host develops various defensive responses, such as activating innate immune signaling pathways that lead to antiviral cytokine production1,2. In order to colonize the host, viruses are obligate to evade host antiviral responses and manipulate signaling pathways. Unraveling the host-virus interaction will shed light on the development of novel therapeutic strategies against viral infection.
Murine &gamma;HV68 is closely related to human oncogenic Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus and Epsten-Barr virus3,4. &gamma;HV68 infection in laboratory mice provides a tractable small animal model to examine the entire course of host responses and viral infection in vivo, which are not available for human herpesviruses. In this protocol, we present a panel of methods for phenotypic characterization and molecular dissection of host signaling components in &gamma;HV68 lytic replication both in vivo and ex vivo. The availability of genetically modified mouse strains permits the interrogation of the roles of host signaling pathways during &gamma;HV68 acute infection in vivo. Additionally, mouse embryonic fibroblasts (MEFs) isolated from these deficient mouse strains can be used to further dissect roles of these molecules during &gamma;HV68 lytic replication ex vivo.
Using virological and molecular biology assays, we can pinpoint the molecular mechanism of host-virus interactions and identify host and viral genes essential for viral lytic replication. Finally, a bacterial artificial chromosome (BAC) system facilitates the introduction of mutations into the viral factor(s) that specifically interrupt the host-virus interaction. Recombinant &gamma;HV68 carrying these mutations can be used to recapitulate the phenotypes of &gamma;HV68 lytic replication in MEFs deficient in key host signaling components. This protocol offers an excellent strategy to interrogate host-pathogen interaction at multiple levels of intervention in vivo and ex vivo.
Recently, we have discovered that &gamma;HV68 usurps an innate immune signaling pathway to promote viral lytic replication5. Specifically, &gamma;HV68 de novo infection activates the immune kinase IKK&beta; and activated IKK&beta; phosphorylates the master viral transcription factor, replication and transactivator (RTA), to promote viral transcriptional activation. In doing so, &gamma;HV68 efficiently couples its transcriptional activation to host innate immune activation, thereby facilitating viral transcription and lytic replication. This study provides an excellent example that can be applied to other viruses to interrogate host-virus interaction.

We describe a protocol to identify key roles of host signaling molecules in lytic replication of a model herpesvirus, gamma herpesvirus 68 (&gamma;HV68). Utilizing genetically modified mouse strains and embryonic fibroblasts for &gamma;HV68 lytic replication, the protocol permits both phenotypic characterization and molecular interrogation of virus-host interactions in viral lytic replication.

Model Herpesvirüs Litik çoğaltma Diseksiyon Host-virüs Etkileşim

In response to viral infection, a host develops various defensive responses, such as activating innate immune signaling pathways that lead to antiviral ...

Production of Replication-Defective Retrovirus by Transient Transfection of 293T cells

Our lab studies human myeloproliferative diseases induced by such oncogenes as Bcr-Abl or growth factor receptor-derived oncogenes (ZNF198-FGFR1, Bcr-PDGFR&#945;, etc.). We are able to model and study a human-like disease in our mouse model, by transplanting bone marrow cells previously infected with a retrovirus expressing the oncogene of interest. Replication-defective retrovirus encoding a human oncogene and a marker (GFP, RFP, antibiotic resistance gene, etc.) is produced by a transient transfection protocol using 293T cells, a human renal epithelial cell line transformed by the adenovirus E1A gene product. 293 cells have the unusual property of being highly transfectable by calcium phosphate (CaPO4), with up to 50-80% transfection efficiency readily attainable. Here, we co-transfect 293 cells with a retroviral vector expressing the oncogene of interest and a plasmid that expresses the gag-pol-env packaging functions, such as the single-genome packaging constructs kat or pCL, in this case the EcoPak plasmid. The initial transfection is further improved by use of chloroquine. Stocks of ecotropic virus, collected as culture supernatant 48 hrs. post-transfection, can be stored at -80&deg;C and used for infection of cell-lines in view of transformation and in vitro studies, or primary cells such as mouse bone marrow cells, that can then be used for transplant in our mouse model.

This technique demonstrates an efficient way to prepare replication-defective retroviral stocks encoding a human oncogene, and subsequently used for induction of myeloproliferative disease in the mouse model.

293T hücreleri geçici Transfeksiyon Çoğaltma-Arızalı Retrovirus Üretimi

Our lab studies human myeloproliferative diseases induced by such oncogenes as Bcr-Abl or growth factor receptor-derived oncogenes (ZNF198-FGFR1, ...

Biyoloji

Ex Vivo Organotypic Corneal Model of Acute Epithelial Herpes Simplex Virus Type I Infection

Herpes keratitis is one of the most severe pathologies associated with the herpes simplex virus-type 1 (HSV-1). Herpes keratitis is currently the leading cause of both cornea-derived and infection-associated blindness in the developed world. Typical presentation of herpes keratitis includes infection of the corneal epithelium and sometimes the deeper corneal stroma and endothelium, leading to such permanent corneal pathologies as scarring, thinning, and opacity 1.
Corneal HSV-1 infection is traditionally studied in two types of experimental models. The in vitro model, in which cultured monolayers of corneal epithelial cells are infected in a Petri dish, offers simplicity, high level of replicability, fast experiments, and relatively low costs. On the other hand, the in vivo model, in which animals such as rabbits or mice are inoculated directly in the cornea, offers a highly sophisticated physiological system, but has higher costs, longer experiments, necessary animal care, and a greater degree of variability. 
In this video article, we provide a detailed demonstration of a new ex vivo model of corneal epithelial HSV-1 infection, which combines the strengths of both the in vitro and the in vivo models. The ex vivo model utilizes intact corneas organotypically maintained in culture and infected with HSV-1. The use of the ex vivo model allows for highly physiologically-based conclusions, yet it is rather inexpensive and requires time commitment comparable to that of the in vitro model.

Ex Vivo Organotypic Corneal Model of Acute Epithelial Herpes Simplex Virus Type I Infection

In this video article we describe the use of a new ex vivo model of acute herpes simplex virus type I corneal epithelial infection.

Akut Epitel Herpes Ex Vivo Organotipik Kornea Model Virüs Tip I Enfeksiyon Simplex

Herpes keratitis is one of the most severe pathologies associated with the herpes simplex virus-type 1 (HSV-1).  Herpes keratitis is currently the leading ...

Nörobilim

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile conditions. Different tests seek to identify and quantify these hallmarks of cancerous cells; however, they often focus on a single aspect of cellular transformation and, in fact, multiple tests are required for their proper characterization. The purpose of this work is to provide researchers with a set of tools to assess cellular transformation in vitro from a broad perspective, thereby making it possible to draw sound conclusions.
A sustained proliferative signaling activation is the major feature of tumoral tissues and can be easily monitored under in vitro conditions by calculating the number of population doublings achieved over time. Besides, the growth of cells in 3D cultures allows their interaction with surrounding cells, resembling what occurs in vivo. This enables the evaluation of cellular aggregation and, together with immunofluorescent labeling of distinctive cellular markers, to obtain information on another relevant feature of tumoral transformation: the loss of proper organization. Another remarkable characteristic of transformed cells is their capacity to grow without attachment to other cells and to the extracellular matrix, which can be evaluated with the anchorage assay.
Detailed experimental procedures to evaluate cell growth rate, to perform immunofluorescent labeling of cell lineage markers in 3D cultures, and to test anchorage-independent cell growth in soft agar are provided. These methodologies are optimized for Breast Primary Epithelial Cells (BPEC) due to its relevance in breast cancer; however, procedures can be applied to other cell types after some adjustments.

This protocol provides experimental in vitro tools to evaluate the transformation of human mammary cells. Detailed steps to follow-up cell proliferation rate, anchorage-independent growth capacity, and distribution of cell lineages in 3D cultures with basement membrane matrix are described.

İnsan Meme Epitel Hücrelerinde Onkojenik Dönüşümün İn Vitro Değerlendirilmesi

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

Kanser Araştırmaları

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

To enter its human host, herpes simplex virus type 1 (HSV-1) must overcome the barrier of mucosal surfaces, skin, or cornea. HSV-1 targets keratinocytes during initial entry and establishes a primary infection in the epithelium, which is followed by latent infection of neurons. After reactivation, viruses can become evident at mucocutaneous sites that appear as skin vesicles or mucosal ulcers. How HSV-1 invades skin or mucosa and reaches its receptors is poorly understood. To investigate the invasion route of HSV-1 into epidermal tissue at the cellular level, we established an ex vivo infection model of murine epidermis, which represents the site of primary and recurrent infection in skin. The assay includes the preparation of murine skin. The epidermis is separated from the dermis by dispase II treatment. After floating the epidermal sheets on virus-containing medium, the tissue is fixed and infection can be visualized at various times postinfection by staining infected cells with an antibody against the HSV-1 immediate early protein ICP0. ICP0-expressing cells can be observed in the basal keratinocyte layer already at 1.5 hr postinfection. With longer infection times, infected cells are detected in suprabasal layers, indicating that infection is not restricted to the basal keratinocytes, but the virus spreads to other layers in the tissue. Using epidermal sheets of various mouse models, the infection protocol allows determining the involvement of cellular components that contribute to HSV-1 invasion into tissue. In addition, the assay is suitable to test inhibitors in tissue that interfere with the initial entry steps, cell-to-cell spread and virus production. Here, we describe the ex vivo infection protocol in detail and present our results using nectin-1- or HVEM-deficient mice.

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

The skin is one target tissue of the human pathogen herpes simplex virus type 1 (HSV-1). To explore the invasion route of HSV-1 into tissue, we established an ex vivo infection model of murine epidermal sheets which represent the outermost layer of skin.

Herpes Simplex virüs tip 1 ile murin Epidermis Ex ​​vivo enfeksiyon

To enter its human host, herpes simplex virus type 1 (HSV-1) must overcome the barrier of mucosal surfaces, skin, or cornea. HSV-1 targets keratinocytes ...

Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice

Current astrocytoma models are limited in their ability to define the roles of oncogenic mutations in specific brain cell types during disease pathogenesis and their utility for preclinical drug development. In order to design a better model system for these applications, phenotypically wild-type cortical astrocytes and neural stem cells (NSC) from conditional, genetically engineered mice (GEM) that harbor various combinations of floxed oncogenic alleles were harvested and grown in culture. Genetic recombination was induced in vitro using adenoviral Cre-mediated recombination, resulting in expression of mutated oncogenes and deletion of tumor suppressor genes. The phenotypic consequences of these mutations were defined by measuring proliferation, transformation, and drug response in vitro. Orthotopic allograft models, whereby transformed cells are stereotactically injected into the brains of immune-competent, syngeneic littermates, were developed to define the role of oncogenic mutations and cell type on tumorigenesis in vivo. Unlike most established human glioblastoma cell line xenografts, injection of transformed GEM-derived cortical astrocytes into the brains of immune-competent littermates produced astrocytomas, including the most aggressive subtype, glioblastoma, that recapitulated the histopathological hallmarks of human astrocytomas, including diffuse invasion of normal brain parenchyma. Bioluminescence imaging of orthotopic allografts from transformed astrocytes engineered to express luciferase was utilized to monitor in vivo tumor growth over time. Thus, astrocytoma models using astrocytes and NSC harvested from GEM with conditional oncogenic alleles provide an integrated system to study the genetics and cell biology of astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo and may be useful in preclinical drug development for these devastating diseases.

Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice

Phenotypically wild-type astrocytes and neural stem cells harvested from mice engineered with floxed, conditional oncogenic alleles and transformed via viral Cre-mediated recombination can be used to model astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo by orthotopic injection of transformed cells into brains of syngeneic, immune-competent littermates.

Modelleme Astrositom Patogenez<em&gt; İn Vitro</em&gt; Ve<em&gt; In Vivo</em&gt; Kortikal Astrositler veya Şartlı, Genetiği fareler ile Nöral Kök Hücreler kullanma

Current astrocytoma models are limited in their ability to define the roles of oncogenic mutations in specific brain cell types during disease ...

Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) and Immunofluorescence (IF) of Specific Gene Products in KSHV-Infected Cells

Mechanistic insight arrives from careful study and quantification of specific RNAs and proteins. The relative locations of these biomolecules throughout the cell at specific times can be captured with fluorescence in situ hybridization (FISH) and immunofluorescence (IF). During lytic herpesvirus infection, the virus hijacks the host cell to preferentially express viral genes, causing changes in cell morphology and behavior of biomolecules. Lytic activities are centered in nuclear factories, termed viral replication compartments, which are discernable only with FISH and IF. Here we describe an adaptable protocol of RNA FISH and IF techniques for Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV)-infected cells, both adherent and in suspension. The method includes steps for the development of specific anti-sense oligonucleotides, double RNA FISH, RNA FISH with IF, and quantitative calculations of fluorescence intensities. This protocol has been successfully applied to multiple cell types, uninfected cells, latent cells, lytic cells, time-courses, and cells treated with inhibitors to analyze the spatiotemporal activities of specific RNAs and proteins from both the human host and KSHV.

Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization FISH and Immunofluorescence IF of Specific Gene Products in KSHV-Infected Cells

We describe a protocol utilizing fluorescence in situ hybridization (FISH) to visualize multiple herpesviral RNAs within lytically infected human cells, either in suspension or adherent. This protocol includes quantification of fluorescence producing a nucleocytoplasmic ratio and can be extended for simultaneous visualization of host and viral proteins with immunofluorescence (IF).

KSHV Enfekte Hücrelerde Spesifik Gen Ürünlerinin Situ Hibridizasyonunda (FISH) ve İmmünfloresansında (IF) Kantitatif Floresan

Mechanistic insight arrives from careful study and quantification of specific RNAs and proteins. The relative locations of these biomolecules throughout ...

Monitoring Plasmid Replication in Live Mammalian Cells over Multiple Generations by Fluorescence Microscopy

Few naturally-occurring plasmids are maintained in mammalian cells. Among these are genomes of gamma-herpesviruses, including Epstein-Barr virus (EBV) and Kaposi's Sarcoma-associated herpesvirus (KSHV), which cause multiple human malignancies 1-3. These two genomes are replicated in a licensed manner, each using a single viral protein and cellular replication machinery, and are passed to daughter cells during cell division despite their lacking traditional centromeres 4-8.
Much work has been done to characterize the replications of these plasmid genomes using methods such as Southern blotting and fluorescence in situ hybridization (FISH). These methods are limited, though. Quantitative PCR and Southern blots provide information about the average number of plasmids per cell in a population of cells. FISH is a single-cell assay that reveals both the average number and the distribution of plasmids per cell in the population of cells but is static, allowing no information about the parent or progeny of the examined cell.
Here, we describe a method for visualizing plasmids in live cells. This method is based on the binding of a fluorescently tagged lactose repressor protein to multiple sites in the plasmid of interest 9. The DNA of interest is engineered to include approximately 250 tandem repeats of the lactose operator (LacO) sequence. LacO is specifically bound by the lactose repressor protein (LacI), which can be fused to a fluorescent protein. The fusion protein can either be expressed from the engineered plasmid or introduced by a retroviral vector. In this way, the DNA molecules are fluorescently tagged and therefore become visible via fluorescence microscopy. The fusion protein is blocked from binding the plasmid DNA by culturing cells in the presence of IPTG until the plasmids are ready to be viewed.
This system allows the plasmids to be monitored in living cells through several generations, revealing properties of their synthesis and partitioning to daughter cells. Ideal cells are adherent, easily transfected, and have large nuclei. This technique has been used to determine that 84% of EBV-derived plasmids are synthesized each generation and 88% of the newly synthesized plasmids partition faithfully to daughter cells in HeLa cells. Pairs of these EBV plasmids were seen to be tethered to or associated with sister chromatids after their synthesis in S-phase until they were seen to separate as the sister chromatids separated in Anaphase10. The method is currently being used to study replication of KSHV genomes in HeLa cells and SLK cells. HeLa cells are immortalized human epithelial cells, and SLK cells are immortalized human endothelial cells. Though SLK cells were originally derived from a KSHV lesion, neither the HeLa nor SLK cell line naturally harbors KSHV genomes11. In addition to studying viral replication, this visualization technique can be used to investigate the effects of the addition, removal, or mutation of various DNA sequence elements on synthesis, localization, and partitioning of other recombinant plasmid DNAs.

A method of observing individual DNA molecules in live cells is described. The technique is based on the binding of a fluorescently tagged lac repressor protein to binding sites engineered into the DNA of interest. This method can be adapted to follow many recombinant DNAs in live cells over time.

Floresan Mikroskobu ile Çoklu Nesiller boyunca Canlı Memeli Hücrelerinde Plazmid Çoğaltma İzlenmesi

Few naturally-occurring plasmids are maintained in mammalian cells.  Among these are genomes of gamma-herpesviruses, including Epstein-Barr virus  (EBV) ...

Dual Bioluminescence Imaging of Tumor Progression and Angiogenesis

Angiogenesis, as a crucial process of tumor progression, has become a research hotspot and target of anti-tumor therapy. However, there is no reliable model for tracing tumor progression and angiogenesis simultaneously in a visual and sensitive manner. Bioluminescence imaging displays its unique superiority in living imaging due to its advantages of high sensitivity, strong specificity, and accurate measurement. Presented here is a protocol to establish a tumor-bearing mouse model by injecting a Renilla luciferase-labeled murine breast cancer cell line 4T1 into the transgenic mouse with angiogenesis-induced Firefly luciferase expression. This mouse model provides a valuable tool to simultaneously monitor tumor progression and angiogenesis in real-time by dual bioluminescence imaging in a single mouse. This model may be widely applied in anti-tumor drug screening and oncology research.

This protocol describes the establishment of a tumor-bearing mouse model to monitor tumor progression and angiogenesis in real-time by dual bioluminescence imaging.

Tümör Ilerlemesi ve anjiyogenezinin çift Bioluminescence görüntülenmesi

Angiogenesis, as a crucial process of tumor progression, has become a research hotspot and target of anti-tumor therapy. However, there is no reliable ...

Hücresel dönüştürme Kaposi sarkomu Herpesvirus tarafından eğitim için bir Vitro modeli

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Kaposi sarkomu ile ilişkili Herpes (KSHV) Yol Açtığı düzensiz Genler belirlenmesi

Model Herpesvirüs Litik çoğaltma Diseksiyon Host-virüs Etkileşim

293T hücreleri geçici Transfeksiyon Çoğaltma-Arızalı Retrovirus Üretimi

Akut Epitel Herpes Ex Vivo Organotipik Kornea Model Virüs Tip I Enfeksiyon Simplex

İnsan Meme Epitel Hücrelerinde Onkojenik Dönüşümün İn Vitro Değerlendirilmesi

Herpes Simplex virüs tip 1 ile murin Epidermis Ex vivo enfeksiyon

Modelleme Astrositom Patogenez

KSHV Enfekte Hücrelerde Spesifik Gen Ürünlerinin Situ Hibridizasyonunda (FISH) ve İmmünfloresansında (IF) Kantitatif Floresan

Floresan Mikroskobu ile Çoklu Nesiller boyunca Canlı Memeli Hücrelerinde Plazmid Çoğaltma İzlenmesi

Tümör Ilerlemesi ve anjiyogenezinin çift Bioluminescence görüntülenmesi

Hücresel dönüştürme Kaposi sarkomu Herpesvirus tarafından eğitim için bir Vitro modeli

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Kaposi sarkomu ile ilişkili Herpes (KSHV) Yol Açtığı düzensiz Genler belirlenmesi

Model Herpesvirüs Litik çoğaltma Diseksiyon Host-virüs Etkileşim

293T hücreleri geçici Transfeksiyon Çoğaltma-Arızalı Retrovirus Üretimi

Akut Epitel Herpes Ex Vivo Organotipik Kornea Model Virüs Tip I Enfeksiyon Simplex

İnsan Meme Epitel Hücrelerinde Onkojenik Dönüşümün İn Vitro Değerlendirilmesi

Herpes Simplex virüs tip 1 ile murin Epidermis Ex ​​vivo enfeksiyon

Modelleme Astrositom Patogenez

KSHV Enfekte Hücrelerde Spesifik Gen Ürünlerinin Situ Hibridizasyonunda (FISH) ve İmmünfloresansında (IF) Kantitatif Floresan

Floresan Mikroskobu ile Çoklu Nesiller boyunca Canlı Memeli Hücrelerinde Plazmid Çoğaltma İzlenmesi

Tümör Ilerlemesi ve anjiyogenezinin çift Bioluminescence görüntülenmesi

Herpes Simplex virüs tip 1 ile murin Epidermis Ex vivo enfeksiyon