Este trabalho foi financiado pelo HD068322 K12 (SCM); R01-CA179921 e OD011092 P51 (AVM); e o prêmio 14PRE20320014 de associação de coração da América (SB).

Nota: todos os procedimentos descritos no presente protocolo devem ser realizados sob condições de BSL-2.
 1. preparação de estoque KSHV <ol><li>buffer de TNE preparar: dissolver 292,24 mg EDTA em ddH 2 O, trazer a 225 mL e ajustar o pH 8. Dissolver 605,7 mg Tris em ddH 2 O, trazer a 225 mL e ajustar o pH 8. Combine as soluções de EDTA e Tris, adicionar 4,38 g NaCl, ajustar volume final de 500 mL, filtrar esterilizar e armazenar a 4 ° C .</li>
	<li>Cultura o KSHV-positivo, EBV-negativo efusão primária linfoma célula linha BCBL-1 numa incubadora umidificado em 37 ° C, mais 5% de CO 2 em RPMI suplementado com 10% inactivadas pelo calor fetal de soro bovino (FBS) e antimicrobianos para aproximadamente 1 a 1.2 x 10 6 células / mL.</li>
	<li>Para induzir a produção de KSHV, dividir culturas 1:2 com meio fresco e adicione Phorbol Myristate 12 13-acetato (PMA) a uma concentração final de 20 ng/mL e incubar as culturas por 5 dias. Como alternativa, tratar as células com butirato de sódio (NaB; 0,1 mM) por 3 dias para induzir a replicação viral lítica.</li>
	<li>Para coletar partículas virais, primeiro centrifugar a cultura sobrenadante a 300 x g durante 5 min à temperatura ambiente para as células de pelotas e transferir sobrenadantes para tubos frescos.</li>
	<li>Para esclarecer o sobrenadante por forma a evitar a transferência dos restos celulares, centrifugar a 2.500 x g durante 10 minutos a 4 ° C. 
	Observação: como alternativa para centrifugação de alta velocidade para esclarecimentos de sobrenadantes de cultura, filtração através de uma estéril 0,45 µm filtro pode ser executado. Temos observado uma queda significativa no título usando filtragem; Portanto, rotineiramente realizamos a segunda etapa de centrifugação em vez disso.</li>
	<li>Em seguida, sobreposição de 5 mL de solução de sacarose 25% em tampão TNE com cerca de 30 mL da cultura esclareceu sobrenadante em 6 tubos de se.</li>
	<li>Centrífuga equilibrado tubos a 75.000 x g, durante 2 h a 4 ° C, sob vácuo.</li>
	<li>Decante o sobrenadante de cultura e borre a borda de cada tubo para remover tanto solução sobrenadante e sacarose quanto possível e, em seguida, Ressuspender o vírus, que pode não ser visível, em 150 µ l de tampão TNE.</li>
	<li>Vírus da piscina todas resuspended, misture bem e congelar 25 alíquotas µ l a -80 ° C .</li>
</ol> 2. Transdução da CE com E6 e E7 Papillomavirus Genes Nota: rotineiramente utilizamos frascos de cultura de tecido padrão para o cultivo primário EC. No entanto, se crescimento insatisfatório da CE é obtido então o uso de frascos de cultura comercial deve ser considerado.
<ol><li>Cultura primária humana dérmica microvascular ou linfática CE numa incubadora umidificado em 37 ° C, acrescido de 5% de CO 2 em meio de crescimento do CE (EGM; contém CE basal suplementado [EBM] com EGM-2 BulletKit [FBS, que contém Hidrocortisona, fator de crescimento do fibroblasto humano-B, fator de crescimento vascular CE, fator de crescimento semelhante à insulina 1, ácido ascórbico, fator de crescimento epitelial humana, antibióticos e heparina]) num frasco de cultura celular T75 para aproximadamente 50% confluência.</li>
	<li>Para transdução, cultura PA317 LXSN 16E6E7 pilhas de 24 , 35 numa incubadora umidificado a 37 ° C mais 5% de CO 2 em DMEM suplementado com 10% FBS e antimicrobianos em um T150 celular cultura balão até que eles são cerca de 90% de Confluencia. Então incubar durante uma noite em 16 mL de meio.</li>
	<li>Esclarecer o meio PA317 por centrifugação a 300 x g durante 5 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Retirar as células de cultura e sobreposição de CE com 12 mL de meio de PA317 esclareceu a EGM e incubar durante 4 h. 
	Nota: Centrifugação 16 mL do meio condicionado a 300 x g, durante 5 min resultados em um sedimento compacto que não é perturbada pela cuidado posterior remoção de 12 mL de sobrenadante clarificado. No entanto, se a transferência de células de 16E6E7 de LXSN de PA317 de culturas primárias de CE é uma preocupação (a linha de celular embalagens rapidamente outgrow CE), em seguida filtração do líquido sobrenadante condicionado através de um filtro de 0,45 µm antes da transferência pode ser realizada.</li>
	<li>Substituir 6 mL do meio de PA317 com EGM fresco e incubar durante uma noite.</li>
	<li>CE refeed com 12ml EGM fresco e incubar um mais h. 48</li>
	<li>Para a subcultura do CE, remover médio e lave com 12 mL de PBS sem cações e adicionar 3 mL de solução de dissociação enzimática comercial (por exemplo, TrypLE) por e incubar a 37 ° C por 3 min.</li>
	<li>Transferência de suspensão de células para um tubo cônico de 15 mL e centrifugar a 300 x g durante 5 min à temperatura ambiente. Resuspenda o pellet de células resultante em EGM fresco e dividir uniformemente em 3 frascos de x T75 com um volume final de 12 mL EGM por balão.</li>
	<li>Para selecionar para CE transfectada com E6 e E7, adicionar G418 para uma concentração final de 200 µ g/mL para duas passagens, após o qual a CE transduzida pode ser chapeada para infecção ou congelada em nitrogênio líquido.</li>
</ol> 3. Infecção da CE Transduced com KSHV <ol><li>no dia antes da infecção, colher CE por digestão enzimática, usando a solução de dissociação enzimática comercial conforme descrito acima. Resuspenda o pellet de células em 1 mL de EGM. Use 5 µ l de células para preparar uma diluição 1/10 em Trypan azul. Contar as células ao vivo usando um hemocytometer e semente 2,5 x 10 5 células vivas em 2 mL de EGM por bem em 6 pratos bem.</li>
	<li>No dia de infecção, remover EGM lavar células com 3 mL de PBS com cálcio e magnésio por bem, e em seguida, adicione 2 mL EBM. 
	Nota: É essencial usar EBM, em vez de EGM durante a infecção, como a heparina na EGM inibirá a vinculação de partículas virais para e posterior infecção do destino EC.</li>
	<li>Para infectar as células com KSHV, adicione o caldo de vírus de 5 a 20 µ l de cada poço e agite o prato para misturar. Para células infectadas por simulação adicionem igual volume de tampão TNE a cada poço.</li>
	<li>Centrifugar as placas a 400 x g durante 30 min à temperatura ambiente e então incubar as placas a 37 ° C por 90 min.</li>
	<li>Se o objetivo do estudo é investigar os primeiros eventos que exigem uma síncrona infecção viral, por exemplo, eventos iniciais na infecção de novo, retire o inóculo viral neste ponto. Enxaguar e refeed as células com 2ml EGM fresco. Caso contrário, adicione 2 mL EGM e incubar as culturas durante a noite.</li>
	<li>Refeed células com 2ml EGM o dia após a infecção e depois todos os outros dias.</li>
	<li>Quando as células são aproximadamente 90% de confluencia, colheita por digestão enzimática, usando solução de dissociação enzimática comercial conforme descrito acima e, em seguida, as células de três poços em um T75, observando o número total de passagem e a passagem da piscina pós-infecção.</li>
	<li>Expandir mock e KSHV-infectados CE com divisões de 1:3 pelo menos duas passagens mais, momento em que as células podem ser utilizadas em experiências ou congeladas em nitrogênio líquido. 
	Nota: Tal como acontece com a divisão de CE transfectada com E6 e E7, culturas de manutenção de simulação e KSHV-células infectadas por devem ser divididas antes de chegar a confluência (~ 85 a 90%).</li></ol>
 4. confirmando infecção com KSHV por imunofluorescência Nota: deteção do KSHV associada a latência nuclear antígeno (LANA-1/ORF73) fornece uma medida quantitativa confiável da infecção. Anticorpos anti-LANA estão comercialmente disponíveis.
<ol><li>o dia antes da coloração, poços de placa dois, cada um com simulação ou KSHV-infectados CE sobre uma placa de 24 a 1 x 10 5 células por bem em 1 mL EGM e incubar durante uma noite.</li>
	<li>Células de lavar duas vezes com 500 µ l de PBS e mais cálcio e magniseum. Lave por 30 s, sobre uma plataforma oscilante.</li>
	<li>Em uma coifa externamente-ventillated, consertar as células com 500 µ l de paraformaldeído 4% por 15 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Lavar as células três vezes com 500 µ l de tampão de lavagem (0,1% Triton X-100 mais soro de cabra 0,02% em PBS mais cátions).</li>
	<li>Bloquear células com 500 µ l de soro de cabra 2% em tampão de lavagem durante 30 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Lavar as células três vezes com 500 µ l de tampão de lavagem.</li>
	<li>Etiqueta de um poço de simulação ou KSHV-infectados CE com 200 µ l de anticorpo primário diluído 01:100 em tampão de lavagem durante 30 min à temperatura ambiente em um roqueiro. Incubar os restantes dois poços em 200 µ l de tampão de lavagem apenas.</li>
	<li>Lavar as células três vezes com 500 µ l de tampão de lavagem.</li>
	<li>Rotular todos os quatro poços com 200 µ l de anticorpo secundário diluído 1: 100 em tampão de lavagem durante 30 min à temperatura ambiente em um balancim.</li>
	<li>Lavar as células três vezes com 500 µ l de tampão de lavagem.</li>
	<li>a cada poço aplicar 20 µ l de montagem DAPI contendo médio e uma lamela e avaliar a mancha usando um microscópio fluorescente invertido.</li>
	<li>Determinar a infecção por cento das células infectadas KSHV contando o número de núcleos de LANA-positivo pelo menos 200 células. Infecção com recombinante KSHV-Bac16 também pode ser monitorado através da observação de culturas para a expressão de GFP.</li>
</ol>

Mixomas é um processo de várias etapas que contorna precauções importantes dentro de um organismo de36. Como lesões do KS existem ao longo de um espectro de inflamação crônica a verdadeiras sarcomas, elucidação de determinados processos fisiopatológicos mediada por KSHV requer que ser realizados alguns estudos em modelos de cultura de células que suportam transformação9. Note-se que a perda da inibição de contato e crescimento dependente de ancoragem, fenótipos indicativos de transformação celular, não desenvolvem prontamente após a infecção primária CE ou CE imortalizado por exógeno expressão da telomerase. Portanto, enquanto o modelo em vitro de KS descrito aqui não recapitular todos os aspectos do microambiente do tumor KS ou comportamento de células de KS explantados, ele é especialmente adequado para estudar mudanças na expressão de gene de célula hospedeiro induzida por infecção com KSHV que contribuem para a tumorigênese KS.
O primeiro relatou estudo usando o sistema de cultura descrito neste documento de criação de perfil de expressão gênica identificou o c-Kit receptor tirosina quinase como contribuinte para o fenótipo transformado de células infectadas KSHV25. Derrubar de expressão de c-Kit usando siRNA ou inibição de c-Kit sinalização usando um dominante negativa construção ou tirosina quinase inibidor STI-571 (Imatinib) interferiu com a capacidade transformadora do manifesto KSHV pela perda da formação de focos, após uma prolongada cultura de células infectadas. Posterior avaliação clínica de imatinibe demonstrou a eficácia desta droga em pacientes com epidemia KS47,,48,49. Outros potenciais alvos de tratamento também foram identificados, incluindo heme oxigenase-126,50, CXCR727e a beta receptores adrenérgicos28, os quais desempenham um papel no crescimento ou transformação de CE in vitro. Confirmação desses padrões de expressão de gene na primária CE, bem como tecido de biópsia KS confirma a relevância fisiológica deste sistema e ressalta seu valor como um modelo pré-clínico para KS terapêutica25,26, 51,52,53,54,55.
Outra força do sistema de transdução E6/E7 é que o tempo de vida estendido do imortalizado em comparação com primário CE permite a manutenção a longo prazo da idade e células de passagem-combinados controle mock-infectados para avaliação comparativa dos resultados da KSHV infecção. É importante notar que, a fim de maximizar o número de passagens da CE transfectadas com E6 e E7 é crítico para dividir culturas antes de chegar a confluência (~ 85 a 90%). Além disso, estas células toleram condições isento de soro por longos períodos de tempo. CE primária rapidamente submetido a morte celular programada após retirada do fator de crescimento e, portanto, não pode ser cultivada por longos períodos sem soro ou fatores de crescimento recombinante56,57. Esta dependência torna autócrina vias induzidas por infecção com KSHV difíceis de identificar e estudar, como antes da transformação completa de células infectadas KSHV também passará por morte celular programada após retirada do fator de crescimento (inédita de sinalização Observação). A presença das proteínas E6 e E7 neste modelo, no entanto, impedir a morte celular programada após retirada do fator de crescimento e permitir a prolongada (por exemplo, 48 h) cultura em baixo soro ou soro livre médio25,26 , 28.
KS é uma doença complexa e incomum com características da inflamação crônica e transformação celular. A necessidade clínica de novas estratégias terapêuticas é grande, e o modelo de cultura celular aqui descrito tem propriedades únicas que permitem a avaliação do candidato alvos de drogas.

Sarcoma de Kaposi (KS) é um tumor de angioproliferativas multi focal afetando sites dérmicas, da mucosa e viscerais que se desenvolve mais comumente na configuração de imunossupressão avançada1. Quatro formas epidemiológicas têm sido descritas: clássico, uma forma indolente que normalmente afeta idosos do património do Mediterrâneo e do Médio Oriente; iatrogênica, resultantes de tratamento com imunossupressores após um transplante de órgão; epidemia, um câncer AIDS-definindo; e endêmicas, uma forma de HIV independente comum em crianças em regiões endêmicas na África. Com o advento dos regimes de drogas anti-retrovirais combinação eficaz para o tratamento do HIV, a epidemia KS é muito menos comumente diagnosticado nos países em desenvolvimento. No entanto, as formas endêmicas e epidêmicas clinicamente agressivas continuam entre os mais comumente diagnosticado câncer em muitos países africanos2,3,4. Portanto, identificação dos medicamentos eficazes patogênese-alvo para o tratamento de KS é uma prioridade de pesquisa.
Histologicamente, as lesões do KS caracterizam-se por neovascularização extensa mas anormal no qual células fusiformes de origem CE formam redes vasculares descontínuos5. Esses vasos anormais ("vasculares fendas") permitem o extravasamento de eritrócitos, que dão lesões sua cor característica. Além disso, lesões contêm numerosos leucócitos que caracterizam a inflamação crônica (ou seja, linfócitos, macrófagos e plasmócitos). Regressão das lesões do KS após reconstituição imunológica tem sido descrita, sugerindo que o KS tem características de uma lesão proliferativa-hiper e um tumor verdadeiro6,7,8,9.
Herpesvírus de KS (KSHV), o agente causador da KS, foi identificado em 199410. Desde então muitos em vitro cultura celular modelos foram desenvolvidos para permitir estudos de patogênese, incluindo células explantados do material de biópsia do tumor e primária ou telomerase-expressando CE infectado com KSHV em vitro11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18. nenhum dos modelos atualmente disponíveis totalmente recapitula o microambiente do tumor KS, mas todos contribuíram com valiosos conhecimentos para nosso entendimento sobre o Patobiológico de infecção KSHV. Ao contrário de outro conhecido oncogenicidade herpesvirus humano vírus Epstein - Barr (EBV), KSHV prontamente não transformar células em cultura, seguindo de novo infecção19,20,21, 22. no entanto, esta limitação foi superada pela transducing CE humano primário de um misto de origem linfática ou microvascular com o E6 e E7 genes do vírus do papiloma humano tipo 16 antes da infecção com KSHV23,24 . Expressão de oncogenes estes exógenas aumenta drasticamente o potencial transformador de KSHV em vitro em parte fornecendo mais inibição do retinoblastoma proteína e p5323,24. Este método de transdução CE permitiu vários laboratórios para identificar alterações chaves host de expressão gênica de células que são induzidas pela infecção KSHV e que aparecem para facilitar KS célula sobrevivência e proliferação25,26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32. os protocolos descritos neste documento são simples e altamente reprodutível e resultará na geração de idade - e passagem-combinada CE KSHV infectados e controles infectados por simulação que podem ser cultivadas por mais tempo que as células primárias e serão permitem a investigação de mecanismos oncogênicas empregado pelo KSHV. Embora o protocolo inclui um método para a produção de tipo selvagem KSHV da linha de celular de linfoma primário de efusão BCBL-1, CE E6/E7-imortalizado também são altamente suscetíveis à infecção com BACmid recombinante derivado KSHV-BAC1630. Protocolos para a preparação de BAC16 são descritos em outro lugar33,34.

<table><tbody><tr><td>BCBL-1 cells</td><td>NIH AIDS Reagent Program</td><td>3233</td><td></td></tr><tr><td>PA317 cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-2203</td><td></td></tr><tr><td>Neonatal dermal microvascular endothelial cells</td><td>Lonza</td><td>CC-2505</td><td></td></tr><tr><td>EBM-2 Basal Medium</td><td>Lonza</td><td>CC-3156</td><td></td></tr><tr><td>EGM-2 BulletKit</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td></td></tr><tr><td>anti-KSHV LANA/ORF 73</td><td>Advanced Biotechnologies</td><td>13-210-100</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt;Express, no phenol red</td><td>ThermoFisher</td><td>12604013</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS with calcium and magnesium</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

an in vitro model for studying cellular transformation by kaposi sarcoma herpesvirus

Sarcoma de Kaposi (KS) é um tumor incomum composto por proliferação de células fusiformes que é iniciado pela infecção das células endoteliais (CE) com KSHV e desenvolve-se mais frequentemente no cenário de imunossupressão. Apesar de décadas de pesquisa, tratamento ideal de KS permanece mal definido e os resultados clínicos são especialmente desfavoráveis em recursos limitados. Lesões do KS são conduzidas pela angiogênese patológica, inflamação crônica e mixomas, e vários em vitro celular cultura modelos foram desenvolvidos para estudar estes processos. KS surge a partir de células infectadas KSHV de origem endotelial, então CE-linhagem células fornecem os mais apropriado em vitro substitutos do precursor do fuso celular. No entanto, porque CE têm uma duração limitada em vitro , e que os mecanismos oncogênicos empregados pelo KSHV são menos eficientes do que aqueles de outros vírus oncogenicidade, tem sido difícil de avaliar os processos de transformação primária ou telomerase-imortalizada EC. Portanto, foi desenvolvido um modelo de romance cultura baseada em CE que suporta prontamente transformação após infecção com KSHV. Gravidez ectópica expressão dos genes E6 e E7 do vírus do papiloma humano tipo 16 permite a cultura prolongada de idade - e passagem-combinada mock e KSHV-infectados CE e apoia o desenvolvimento de um verdadeiramente transformado (i.e., oncogenicidade) fenótipo em culturas de células infectadas . Este modelo tractable e altamente reprodutível de KS tem facilitado a descoberta de várias vias de sinalização essenciais com elevado potencial para a tradução em ambientes clínicos.

A morfologia da CE primário é classicamente descrita como "pedra do godo", e esta morfologia não é alterada pela expressão do papilomavírus E6 e E7 genes (figura 1A). Expressão dos genes E6 e E7 sozinhos não induz um fenótipo transformado; assim, as células são suscetíveis a entrar em contato com a inibição e cessarão dividindo ao atingir a confluência na cultura. As células serão no entanto proliferam e regenerar a confluência tripsinização e replating em uma densidade mais baixa, permitindo a manutenção das culturas de idade - e passagem-combinada para uso como controles infectados por simulação.
Infecção da CE E6/E7-transfectadas com KSHV provoca alterações morfológicas dramáticas na cultura que lembram o fenótipo de "células" observado em lesões do KS (figura 1B). Um fenótipo transformado também é induzido ao ser infectado com KSHV, que se manifesta em parte pela perda da inibição de contato quando as células são cultivada pós-confluência (Figura 1) e o crescimento independente de ancoragem em ágar macio (Figura 2). Perda da inibição de contato e interações da matriz extra-celular (fixação) a dependência durante mixomas são duas das marcas registradas da transformação celular36. É importante notar que a CE primário também são suscetíveis à infecção com KSHV e sistemas primários de CE tem sido extremamente valiosos para elucidar diversos aspectos da interação vírus-hospedeiro e suas consequências. Tais estudos estão bem representados na literatura e vários exemplos são citados neste documento37,38,39,40,41,42,43 ,44.
A coloração imunofluorescente demonstra que a morfologia do eixo de células infectadas KSHV está associada a expressão da proteína viral LANA-1/ORF73 (Figura 3A e 3B, vermelho). Como a concentração de vírus em ações pode variar entre preparações, o volume de vírus adicionado por bem deve ser ajustado para que culturas infectadas KSHV atingir &#62; 90% infecção dentro de uma ou duas passagens. Com passagem serial a porcentagem de infecção vai abordar a 100% e será mantida para a duração da cultura (aproximadamente 20 passagens). Menor quantidade de vírus pode ser usada se destina-se um estudo de influências parácrina, ou se as células não infectadas adjacentes são desejáveis como controles (por exemplo, para estudos de imunofluorescência, envolvendo outras proteínas de interesse). Culturas infectadas também oferecem suporte a expressão das proteínas virais líticas, mas, como é observado em lesões do KS, apenas uma minoria das células em cultura espontaneamente vai sofrer reativação lítica (Figura 3B, verde). Células infectadas com KSHV-BAC16, que é marcado com as boas práticas agrícolas, também desenvolveram uma morfologia do eixo (Figura 3 e 3D). Quando KSHV-BAC16 é usado, títulos virais podem ser obtidos por infectar as células com um estoque de vírus concentrado serialmente diluída e avaliando as células para expressão de GFP na infecção de 48 h post usando o fluxo cytometry30.
Para recombinante e vírus WT, genomas virais em preparações de estoque também podem ser medidas pela purificação de DNA de células infectadas, seguido de quantificação de PCR dos níveis de ADN KSHV; no entanto, um não deve presumir que todos os genomas são infecciosas45. Se o estudo do ciclo lítico KSHV destina-se, a reativação do vírus pode ser conseguida estimulando CE com indução de agentes como descrito acima para células BCBL-1, embora a eficiência de reativação é menor23. O ciclo lítico também pode ser induzido por transdução da CE com a proteína liberada KSHV ORF5046. Consistente com resultados de outros modelos de cultura celular de KS, ambos manifestação espontânea e indução química de KSHV líticas genes E6/E7-expressando CE diminui ao longo do tempo, apesar da manutenção de uma infecção latente estável11,16 .
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/54828/54828fig1.jpg"> 
Figura 1: morfologia de simulação - e KSHV infectado EC. (A) exposição de monocamadas CE Mock-infectado o godo clássico pedra aparência por microscópio de contraste de fase vital. Sem as ações dos genes KSHV estas células não são transformadas e serão portanto cessar dividindo e exibem inibição de contato ao atingir a confluência na cultura. (B) células infectadas por KSHV, em contraste, desenvolvem uma morfologia alongada "células" reminiscência de células fusiformes de KS. Este painel mostra a morfologia das células infectadas KSHV no dia 5 PI ao atingir a confluência. (C) células infectadas por em KSHV, grandes mudanças na expressão de gene de pilha de anfitrião levam a transformação celular, que se torna evidente quando células infectadas KSHV são cultivadas sem passagem. Sob tais condições, as células infectadas KSHV continuam proliferando mesmo depois de atingir a confluência, levando ao desenvolvimento de focos de várias camados de células. Este painel mostra a morfologia das células infectadas KSHV no dia 14 PI, cultivada por pós-confluência 9 dias. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54828/54828fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/54828/54828fig2.jpg"> 
Figura 2: crescimento independente de Anchorage. Sem transformação células normalmente passam por morte celular apoptótica, seguindo a perda de contato com um substrato, um processo chamado anoikis. (A) quando E6/E7-transfectadas mock-infectados CE, que não são transformadas, são suspensas em ágar macio e cultivadas por duas semanas, que eles não formam colônias. (B) CE KSHV infectados, que são vírus-transformadas, são resistente à anoikis e irá formar colônias em ágar macio. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54828/54828fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/54828/54828fig3.jpg"> 
Figura 3: demonstração da expressão da proteína viral. (A), a morfologia do eixo é evidente após infecção com KSHV (ampliação de 40 X). (B) coloração imunofluorescente do mesmo campo mostrado em (A) demonstra que a morfologia do eixo está associada a expressão da proteína viral latência ORF73 (vermelho). Células infectadas oferecer suporte à replicação viral lítica também, como demonstrado por uma pequena percentagem de células expressando o viral processivity factor ORF59 (verde). (A e B modificado da referência26.) A morfologia do eixo de células infectadas com vírus KSHV-BAC16 (C) está associada com a expressão de GFP (D) (ampliação de 20 X). <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54828/54828fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus

Sarcoma de Kaposi (KS) é um tumor induzido por infecção pelo herpesvírus oncogênicos vírus humano herpesvírus-8/KS (HHV-8/KSHV). O modelo de cultura de células endoteliais descrito aqui é especialmente adequado para estudar os mecanismos pelos quais KSHV transforma células hospedeiras.

Um modelo In Vitro para o estudo transformação celular por Herpesvirus Sarcoma de Kaposi

Kaposi sarcoma (KS) is an unusual tumor composed of proliferating spindle cells that is initiated by infection of endothelial cells (EC) with KSHV, and ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus

8.2K visualizações.  University of Minnesota Medical School. Sarcoma de Kaposi (KS) é um tumor induzido por infecção pelo herpesvírus oncogênicos vírus humano herpesvírus-8/KS (HHV-8/KSHV). O modelo de cultura de células endoteliais descrito aqui é especialmente adequado para estudar os mecanismos pelos quais KSHV transforma células hospedeiras.

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Identifying Dysregulated Genes Induced by Kaposi's Sarcoma-associated Herpesvirus (KSHV)

Currently KS is the most predominant HIV/AIDS related malignancy in Southern Africa and hence the world.1,2 It is characterized as an angioproliferative tumor of vascular endothelial cells and produces rare B cell lymphoproliferative diseases in the form of pleural effusion lymphomas (PEL) and some forms of multicentric Castleman's disease.3-5 Only 1-5% of cells in KS lesions actively support lytic replication of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV), the etiological agent associated with KS, and it is clear that cellular factors must interact with viral factors in the process of oncogenesis and tumor progression.6,7 Identifying novel host-factor determinants which contribute to KS pathology is essential for developing prognostic markers for tumor progression and metastasis as well as for developing novel therapeutics for the treatment of KS.8 The accompanying video details the methods we use to identify host cell gene expression programs altered in dermal microvascular endothelial cells (DMVEC) after KSHV infection and in KS tumor tissue.9 Once dysregulated genes are identified by microarray analysis, changes in protein expression are confirmed by immunoblot and dual labeled immunofluorescence. Changes in transcriptional expression of dysregulated genes are confirmed in vitro by quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR). Validation of in vitro findings using archival KS tumor tissue is also performed by dual labeled immunochemistry and tissue microarrays.8,10 Our approach to identifying dysregulated genes in the KS tumor tissue microenvironment will allow the development of in vitro and subsequently in vivo model systems for discovery and evaluation of potential novel therapeutic for the treatment of KS.

Identifying Dysregulated Genes Induced by Kaposi's Sarcoma-associated Herpesvirus KSHV

Host cell factors play a critical role in the establishment and maintenance of Kaposi's sarcoma (KS). We outline methods to identify host cell factors altered in KSHV-infected DMVEC cells, and in KS tumor tissue. Cellular genes altered by virus will serve as potential target(s) for novel therapeutics.

Identificação de genes desregulados Induzida pelo Herpesvirus sarcoma de Kaposi-associado (KSHV)

Currently KS is the most predominant HIV/AIDS related malignancy in Southern Africa and hence the world.1,2 It is characterized as an angioproliferative ...

Imunologia e Infecção

Dissecting Host-virus Interaction in Lytic Replication of a Model Herpesvirus

In response to viral infection, a host develops various defensive responses, such as activating innate immune signaling pathways that lead to antiviral cytokine production1,2. In order to colonize the host, viruses are obligate to evade host antiviral responses and manipulate signaling pathways. Unraveling the host-virus interaction will shed light on the development of novel therapeutic strategies against viral infection.
Murine &gamma;HV68 is closely related to human oncogenic Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus and Epsten-Barr virus3,4. &gamma;HV68 infection in laboratory mice provides a tractable small animal model to examine the entire course of host responses and viral infection in vivo, which are not available for human herpesviruses. In this protocol, we present a panel of methods for phenotypic characterization and molecular dissection of host signaling components in &gamma;HV68 lytic replication both in vivo and ex vivo. The availability of genetically modified mouse strains permits the interrogation of the roles of host signaling pathways during &gamma;HV68 acute infection in vivo. Additionally, mouse embryonic fibroblasts (MEFs) isolated from these deficient mouse strains can be used to further dissect roles of these molecules during &gamma;HV68 lytic replication ex vivo.
Using virological and molecular biology assays, we can pinpoint the molecular mechanism of host-virus interactions and identify host and viral genes essential for viral lytic replication. Finally, a bacterial artificial chromosome (BAC) system facilitates the introduction of mutations into the viral factor(s) that specifically interrupt the host-virus interaction. Recombinant &gamma;HV68 carrying these mutations can be used to recapitulate the phenotypes of &gamma;HV68 lytic replication in MEFs deficient in key host signaling components. This protocol offers an excellent strategy to interrogate host-pathogen interaction at multiple levels of intervention in vivo and ex vivo.
Recently, we have discovered that &gamma;HV68 usurps an innate immune signaling pathway to promote viral lytic replication5. Specifically, &gamma;HV68 de novo infection activates the immune kinase IKK&beta; and activated IKK&beta; phosphorylates the master viral transcription factor, replication and transactivator (RTA), to promote viral transcriptional activation. In doing so, &gamma;HV68 efficiently couples its transcriptional activation to host innate immune activation, thereby facilitating viral transcription and lytic replication. This study provides an excellent example that can be applied to other viruses to interrogate host-virus interaction.

We describe a protocol to identify key roles of host signaling molecules in lytic replication of a model herpesvirus, gamma herpesvirus 68 (&gamma;HV68). Utilizing genetically modified mouse strains and embryonic fibroblasts for &gamma;HV68 lytic replication, the protocol permits both phenotypic characterization and molecular interrogation of virus-host interactions in viral lytic replication.

Dissecando interação hospedeiro-vírus em replicação lítica de um herpesvírus modelo

In response to viral infection, a host develops various defensive responses, such as activating innate immune signaling pathways that lead to antiviral ...

Production of Replication-Defective Retrovirus by Transient Transfection of 293T cells

Our lab studies human myeloproliferative diseases induced by such oncogenes as Bcr-Abl or growth factor receptor-derived oncogenes (ZNF198-FGFR1, Bcr-PDGFR&#945;, etc.). We are able to model and study a human-like disease in our mouse model, by transplanting bone marrow cells previously infected with a retrovirus expressing the oncogene of interest. Replication-defective retrovirus encoding a human oncogene and a marker (GFP, RFP, antibiotic resistance gene, etc.) is produced by a transient transfection protocol using 293T cells, a human renal epithelial cell line transformed by the adenovirus E1A gene product. 293 cells have the unusual property of being highly transfectable by calcium phosphate (CaPO4), with up to 50-80% transfection efficiency readily attainable. Here, we co-transfect 293 cells with a retroviral vector expressing the oncogene of interest and a plasmid that expresses the gag-pol-env packaging functions, such as the single-genome packaging constructs kat or pCL, in this case the EcoPak plasmid. The initial transfection is further improved by use of chloroquine. Stocks of ecotropic virus, collected as culture supernatant 48 hrs. post-transfection, can be stored at -80&deg;C and used for infection of cell-lines in view of transformation and in vitro studies, or primary cells such as mouse bone marrow cells, that can then be used for transplant in our mouse model.

This technique demonstrates an efficient way to prepare replication-defective retroviral stocks encoding a human oncogene, and subsequently used for induction of myeloproliferative disease in the mouse model.

Produção de retrovírus replicação defeituosa por transfecção transiente das células 293T

Our lab studies human myeloproliferative diseases induced by such oncogenes as Bcr-Abl or growth factor receptor-derived oncogenes (ZNF198-FGFR1, ...

Biologia

Ex Vivo Organotypic Corneal Model of Acute Epithelial Herpes Simplex Virus Type I Infection

Herpes keratitis is one of the most severe pathologies associated with the herpes simplex virus-type 1 (HSV-1). Herpes keratitis is currently the leading cause of both cornea-derived and infection-associated blindness in the developed world. Typical presentation of herpes keratitis includes infection of the corneal epithelium and sometimes the deeper corneal stroma and endothelium, leading to such permanent corneal pathologies as scarring, thinning, and opacity 1.
Corneal HSV-1 infection is traditionally studied in two types of experimental models. The in vitro model, in which cultured monolayers of corneal epithelial cells are infected in a Petri dish, offers simplicity, high level of replicability, fast experiments, and relatively low costs. On the other hand, the in vivo model, in which animals such as rabbits or mice are inoculated directly in the cornea, offers a highly sophisticated physiological system, but has higher costs, longer experiments, necessary animal care, and a greater degree of variability. 
In this video article, we provide a detailed demonstration of a new ex vivo model of corneal epithelial HSV-1 infection, which combines the strengths of both the in vitro and the in vivo models. The ex vivo model utilizes intact corneas organotypically maintained in culture and infected with HSV-1. The use of the ex vivo model allows for highly physiologically-based conclusions, yet it is rather inexpensive and requires time commitment comparable to that of the in vitro model.

Ex Vivo Organotypic Corneal Model of Acute Epithelial Herpes Simplex Virus Type I Infection

In this video article we describe the use of a new ex vivo model of acute herpes simplex virus type I corneal epithelial infection.

Ex Vivo modelo organotípico córnea de Agudos Herpes simplex vírus tipo epiteliais eu Infecção

Herpes keratitis is one of the most severe pathologies associated with the herpes simplex virus-type 1 (HSV-1).  Herpes keratitis is currently the leading ...

Neurociência

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile conditions. Different tests seek to identify and quantify these hallmarks of cancerous cells; however, they often focus on a single aspect of cellular transformation and, in fact, multiple tests are required for their proper characterization. The purpose of this work is to provide researchers with a set of tools to assess cellular transformation in vitro from a broad perspective, thereby making it possible to draw sound conclusions.
A sustained proliferative signaling activation is the major feature of tumoral tissues and can be easily monitored under in vitro conditions by calculating the number of population doublings achieved over time. Besides, the growth of cells in 3D cultures allows their interaction with surrounding cells, resembling what occurs in vivo. This enables the evaluation of cellular aggregation and, together with immunofluorescent labeling of distinctive cellular markers, to obtain information on another relevant feature of tumoral transformation: the loss of proper organization. Another remarkable characteristic of transformed cells is their capacity to grow without attachment to other cells and to the extracellular matrix, which can be evaluated with the anchorage assay.
Detailed experimental procedures to evaluate cell growth rate, to perform immunofluorescent labeling of cell lineage markers in 3D cultures, and to test anchorage-independent cell growth in soft agar are provided. These methodologies are optimized for Breast Primary Epithelial Cells (BPEC) due to its relevance in breast cancer; however, procedures can be applied to other cell types after some adjustments.

This protocol provides experimental in vitro tools to evaluate the transformation of human mammary cells. Detailed steps to follow-up cell proliferation rate, anchorage-independent growth capacity, and distribution of cell lineages in 3D cultures with basement membrane matrix are described.

Avaliação In Vitro da Transformação Oncogênica em Células Epiteliais Mamárias Humanas

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

Pesquisa do câncer

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

To enter its human host, herpes simplex virus type 1 (HSV-1) must overcome the barrier of mucosal surfaces, skin, or cornea. HSV-1 targets keratinocytes during initial entry and establishes a primary infection in the epithelium, which is followed by latent infection of neurons. After reactivation, viruses can become evident at mucocutaneous sites that appear as skin vesicles or mucosal ulcers. How HSV-1 invades skin or mucosa and reaches its receptors is poorly understood. To investigate the invasion route of HSV-1 into epidermal tissue at the cellular level, we established an ex vivo infection model of murine epidermis, which represents the site of primary and recurrent infection in skin. The assay includes the preparation of murine skin. The epidermis is separated from the dermis by dispase II treatment. After floating the epidermal sheets on virus-containing medium, the tissue is fixed and infection can be visualized at various times postinfection by staining infected cells with an antibody against the HSV-1 immediate early protein ICP0. ICP0-expressing cells can be observed in the basal keratinocyte layer already at 1.5 hr postinfection. With longer infection times, infected cells are detected in suprabasal layers, indicating that infection is not restricted to the basal keratinocytes, but the virus spreads to other layers in the tissue. Using epidermal sheets of various mouse models, the infection protocol allows determining the involvement of cellular components that contribute to HSV-1 invasion into tissue. In addition, the assay is suitable to test inhibitors in tissue that interfere with the initial entry steps, cell-to-cell spread and virus production. Here, we describe the ex vivo infection protocol in detail and present our results using nectin-1- or HVEM-deficient mice.

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

The skin is one target tissue of the human pathogen herpes simplex virus type 1 (HSV-1). To explore the invasion route of HSV-1 into tissue, we established an ex vivo infection model of murine epidermal sheets which represent the outermost layer of skin.

Ex Vivo Infecção de Murino Epiderme com vírus herpes simplex tipo 1

To enter its human host, herpes simplex virus type 1 (HSV-1) must overcome the barrier of mucosal surfaces, skin, or cornea. HSV-1 targets keratinocytes ...

Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice

Current astrocytoma models are limited in their ability to define the roles of oncogenic mutations in specific brain cell types during disease pathogenesis and their utility for preclinical drug development. In order to design a better model system for these applications, phenotypically wild-type cortical astrocytes and neural stem cells (NSC) from conditional, genetically engineered mice (GEM) that harbor various combinations of floxed oncogenic alleles were harvested and grown in culture. Genetic recombination was induced in vitro using adenoviral Cre-mediated recombination, resulting in expression of mutated oncogenes and deletion of tumor suppressor genes. The phenotypic consequences of these mutations were defined by measuring proliferation, transformation, and drug response in vitro. Orthotopic allograft models, whereby transformed cells are stereotactically injected into the brains of immune-competent, syngeneic littermates, were developed to define the role of oncogenic mutations and cell type on tumorigenesis in vivo. Unlike most established human glioblastoma cell line xenografts, injection of transformed GEM-derived cortical astrocytes into the brains of immune-competent littermates produced astrocytomas, including the most aggressive subtype, glioblastoma, that recapitulated the histopathological hallmarks of human astrocytomas, including diffuse invasion of normal brain parenchyma. Bioluminescence imaging of orthotopic allografts from transformed astrocytes engineered to express luciferase was utilized to monitor in vivo tumor growth over time. Thus, astrocytoma models using astrocytes and NSC harvested from GEM with conditional oncogenic alleles provide an integrated system to study the genetics and cell biology of astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo and may be useful in preclinical drug development for these devastating diseases.

Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice

Phenotypically wild-type astrocytes and neural stem cells harvested from mice engineered with floxed, conditional oncogenic alleles and transformed via viral Cre-mediated recombination can be used to model astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo by orthotopic injection of transformed cells into brains of syngeneic, immune-competent littermates.

Modelagem astrocitoma Patogênese<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em&gt; Usando Cortical astrócitos ou células-tronco neurais de condicional, Geneticamente Modificadas Ratos

Current astrocytoma models are limited in their ability to define the roles of oncogenic mutations in specific brain cell types during disease ...

Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) and Immunofluorescence (IF) of Specific Gene Products in KSHV-Infected Cells

Mechanistic insight arrives from careful study and quantification of specific RNAs and proteins. The relative locations of these biomolecules throughout the cell at specific times can be captured with fluorescence in situ hybridization (FISH) and immunofluorescence (IF). During lytic herpesvirus infection, the virus hijacks the host cell to preferentially express viral genes, causing changes in cell morphology and behavior of biomolecules. Lytic activities are centered in nuclear factories, termed viral replication compartments, which are discernable only with FISH and IF. Here we describe an adaptable protocol of RNA FISH and IF techniques for Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV)-infected cells, both adherent and in suspension. The method includes steps for the development of specific anti-sense oligonucleotides, double RNA FISH, RNA FISH with IF, and quantitative calculations of fluorescence intensities. This protocol has been successfully applied to multiple cell types, uninfected cells, latent cells, lytic cells, time-courses, and cells treated with inhibitors to analyze the spatiotemporal activities of specific RNAs and proteins from both the human host and KSHV.

Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization FISH and Immunofluorescence IF of Specific Gene Products in KSHV-Infected Cells

We describe a protocol utilizing fluorescence in situ hybridization (FISH) to visualize multiple herpesviral RNAs within lytically infected human cells, either in suspension or adherent. This protocol includes quantification of fluorescence producing a nucleocytoplasmic ratio and can be extended for simultaneous visualization of host and viral proteins with immunofluorescence (IF).

Hibridação in situ da fluorescência quantitativa (peixes) e immunofluorescence (se) de produtos específicos do gene em pilhas KSHV-infectadas

Mechanistic insight arrives from careful study and quantification of specific RNAs and proteins. The relative locations of these biomolecules throughout ...

Monitoring Plasmid Replication in Live Mammalian Cells over Multiple Generations by Fluorescence Microscopy

Few naturally-occurring plasmids are maintained in mammalian cells. Among these are genomes of gamma-herpesviruses, including Epstein-Barr virus (EBV) and Kaposi's Sarcoma-associated herpesvirus (KSHV), which cause multiple human malignancies 1-3. These two genomes are replicated in a licensed manner, each using a single viral protein and cellular replication machinery, and are passed to daughter cells during cell division despite their lacking traditional centromeres 4-8.
Much work has been done to characterize the replications of these plasmid genomes using methods such as Southern blotting and fluorescence in situ hybridization (FISH). These methods are limited, though. Quantitative PCR and Southern blots provide information about the average number of plasmids per cell in a population of cells. FISH is a single-cell assay that reveals both the average number and the distribution of plasmids per cell in the population of cells but is static, allowing no information about the parent or progeny of the examined cell.
Here, we describe a method for visualizing plasmids in live cells. This method is based on the binding of a fluorescently tagged lactose repressor protein to multiple sites in the plasmid of interest 9. The DNA of interest is engineered to include approximately 250 tandem repeats of the lactose operator (LacO) sequence. LacO is specifically bound by the lactose repressor protein (LacI), which can be fused to a fluorescent protein. The fusion protein can either be expressed from the engineered plasmid or introduced by a retroviral vector. In this way, the DNA molecules are fluorescently tagged and therefore become visible via fluorescence microscopy. The fusion protein is blocked from binding the plasmid DNA by culturing cells in the presence of IPTG until the plasmids are ready to be viewed.
This system allows the plasmids to be monitored in living cells through several generations, revealing properties of their synthesis and partitioning to daughter cells. Ideal cells are adherent, easily transfected, and have large nuclei. This technique has been used to determine that 84% of EBV-derived plasmids are synthesized each generation and 88% of the newly synthesized plasmids partition faithfully to daughter cells in HeLa cells. Pairs of these EBV plasmids were seen to be tethered to or associated with sister chromatids after their synthesis in S-phase until they were seen to separate as the sister chromatids separated in Anaphase10. The method is currently being used to study replication of KSHV genomes in HeLa cells and SLK cells. HeLa cells are immortalized human epithelial cells, and SLK cells are immortalized human endothelial cells. Though SLK cells were originally derived from a KSHV lesion, neither the HeLa nor SLK cell line naturally harbors KSHV genomes11. In addition to studying viral replication, this visualization technique can be used to investigate the effects of the addition, removal, or mutation of various DNA sequence elements on synthesis, localization, and partitioning of other recombinant plasmid DNAs.

A method of observing individual DNA molecules in live cells is described. The technique is based on the binding of a fluorescently tagged lac repressor protein to binding sites engineered into the DNA of interest. This method can be adapted to follow many recombinant DNAs in live cells over time.

Monitorando a replicação plasmídeo em células vivas de mamíferos longo de múltiplas gerações por microscopia de fluorescência

Few naturally-occurring plasmids are maintained in mammalian cells.  Among these are genomes of gamma-herpesviruses, including Epstein-Barr virus  (EBV) ...

Dual Bioluminescence Imaging of Tumor Progression and Angiogenesis

Angiogenesis, as a crucial process of tumor progression, has become a research hotspot and target of anti-tumor therapy. However, there is no reliable model for tracing tumor progression and angiogenesis simultaneously in a visual and sensitive manner. Bioluminescence imaging displays its unique superiority in living imaging due to its advantages of high sensitivity, strong specificity, and accurate measurement. Presented here is a protocol to establish a tumor-bearing mouse model by injecting a Renilla luciferase-labeled murine breast cancer cell line 4T1 into the transgenic mouse with angiogenesis-induced Firefly luciferase expression. This mouse model provides a valuable tool to simultaneously monitor tumor progression and angiogenesis in real-time by dual bioluminescence imaging in a single mouse. This model may be widely applied in anti-tumor drug screening and oncology research.

This protocol describes the establishment of a tumor-bearing mouse model to monitor tumor progression and angiogenesis in real-time by dual bioluminescence imaging.

Imagem de bioluminescência dupla de progressão tumoral e angiogênese

Angiogenesis, as a crucial process of tumor progression, has become a research hotspot and target of anti-tumor therapy. However, there is no reliable ...