Diese Arbeit wurde durch K12 HD068322 (SCM) unterstützt; R01 CA179921 und P51 OD011092 (AVM); und 14PRE20320014 aus Amerika Heart Association (SB).

Hinweis: alle in diesem Protokoll beschriebene Verfahren durchgeführt werden, unter Bedingungen der BSL-2.
 1. KSHV Lager Vorbereitung <ol><li>bereiten TNE Puffer: auflösen 292,24 mg EDTA in DdH 2 O, 225 mL bringen, und passen Sie auf pH 8. 605,7 mg Tris in DdH 2 O auflösen, bis 225 mL bringen und auf pH 8 anpassen. EDTA und Tris Lösungen kombinieren, hinzufügen 4,38 g NaCl, endgültige Lautstärke bis 500 mL, filtern, Sterilisation und Lagerung bei 4 ° C .</li>
	<li>Kultur KSHV-positiv, EBV-Negative primären Erguss Lymphome Zelllinie BCBL-1 in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C plus 5 % CO 2 in RPMI ergänzt mit 10 % Hitze-inaktivierten fetalen bovine Serum (FBS) und Antibiotika, ca. 1 1.2 x 10 6 Zellen pro mL.</li>
	<li>Induzieren KSHV Produktion aufgeteilt Kulturen 1:2 mit frischem Medium und eine Endkonzentration von 20 ng/mL Phorbol Myristate-12 13-Acetat (PMA) hinzu und inkubieren Sie Kulturen für 5 Tage. Als Alternative Behandlung von Zellen mit Natrium-Butyrat (NaB; 0,1 mM) für 3 Tage induzieren lytische Virusreplikation.</li>
	<li>Um Viruspartikel zu ernten, Zentrifugieren Sie zuerst die Kultur Überstand bei 300 X g für 5 min bei Raumtemperatur pellet-Zellen und Überstände auf frischen Rohre übertragen.</li>
	<li>Zur weiteren Klärung des Überstands um Zelltrümmer, vermeiden Zentrifugieren bei 2.500 x g für 10 min bei 4 ° c 
	Hinweis: als Alternative zu high-Speed Zentrifugation zur Klärung der Kultur Überstände, Filtration durch eine sterile 0,45 µm Filter durchgeführt werden kann. Wir haben einen deutlichen Rückgang der Titer mit Filtration beobachtet; Daher führen wir den zweiten Zentrifugationsschritt routinemäßig statt.</li>
	<li>5 mL 25 % Saccharoselösung in TNE Puffer mit etwa 30 mL der Überstand in 6 Ultrazentrifugen Rohre geklärte Kultur als nächstes überlagern.</li>
	<li>Zentrifuge ausgeglichen bei 75.000 x g für 2 h bei 4 ° C unter Vakuum Röhren.</li>
	<li>Kultur überstand abgießen und tupfen Sie den Rand des jedes Rohr, so viel überstand und Saccharose Lösung wie möglich zu entfernen, dann Aufschwemmen der Virus-Pellets, die möglicherweise nicht sichtbar, in 150 µL TNE Puffer.</li>
	<li>Alle Pool Nukleinsäuretablette Virus, vermengen, und frieren 25 µL-Aliquots bei-80 ° C .</li>
</ol> 2. Transduktion der EG mit E6 und E7 Papillomavirus Genes Hinweis: Wir verwenden routinemäßig standard Gewebe Kulturflaschen für den Anbau von primären EC Jedoch wenn unbefriedigende Wachstum der EG erhalten werden dann die Verwendung von kommerziellen Kulturflaschen berücksichtigt werden.
<ol><li>Kultur primären menschlichen dermalen mikrovaskuläre oder lymphatischen EG in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C plus 5 % CO 2 im EG Wachstumsmedium (EGM; enthält EG basal Medium [EBM] mit EGM-2 BulletKit [mit FBS, ergänzt Hydrocortison, menschlichen Fibroblasten-Wachstumsfaktor-B vaskulären EG Wachstumsfaktor, Insulin-ähnliche Wachstumsfaktor-1, Ascorbinsäure, menschliche epithelialen Wachstumsfaktor, Antibiotika und Heparin]) in einem T75 Zelle Kultur Kolben um ca. 50 % Zusammenfluss.</li>
	<li>Für die Transduktion, Kultur PA317 LXSN 16E6E7 Zellen 24 , 35 in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C zuzüglich 5 % CO 2 in DMEM mit 10 % FBS und Antibiotika in ergänzt eine T150 Zelle Kultur Flasche bis sie ca. 90 % Zusammenfluss sind. Dann über Nacht in 16 mL Medium inkubieren.</li>
	<li>Das PA317 Medium durch Zentrifugieren bei 300 X g für 5 min bei Raumtemperatur zu klären.</li>
	<li>Entfernen die EGM aus den EG-Kultur und Overlay-Zellen mit 12 mL des Mediums geklärte PA317 und inkubieren Sie für 4 Std. 
	Hinweis: Zentrifugieren 16 mL konditionierten Medium 300 X g für 5 min ergibt eine kompakte Kugel, die durch die sorgfältige nachträgliche Entfernung von 12 mL geklärte Überstand nicht gestört wird. Jedoch wenn Übertragung der PA317 LXSN 16E6E7 Zellen Primärkulturen EG ist ein Anliegen (die Verpackung-Zell-Linie wird schnell entwachsen EG), dann Filtration von konditionierten Überstand durch einen 0,45 µm-Filter vor dem Transfer erfolgen kann.</li>
	<li>6 mL des Mediums PA317 mit frischen EGM zu ersetzen und über Nacht inkubieren.</li>
	<li>Refeed EG mit 12 mL frische EGM und inkubieren Sie eine weitere 48 h.</li>
	<li>EG, Sub-Kultur Medium zu entfernen und waschen mit 12 mL PBS ohne kationen, und geben Sie 3 mL kommerzielle enzymatische Dissoziation Lösung (z.B. TrypLE) und Inkubation bei 37 ° C für 3 min.</li>
	<li>Zellsuspension auf eine 15 mL konische Rohr übertragen und Zentrifugieren bei 300 X g für 5 min bei Raumtemperatur. Aufschwemmen der daraus resultierenden Zelle Pellet in frischen EGM und teilen gleichmäßig in 3 x T75 Flaschen mit einem Endvolumen von 12 mL EGM pro Flasche.</li>
	<li>G418 hinzufügen um EG ausgestrahlt mit E6 und E7 zu wählen, eine Endkonzentration von 200 µg/mL für zwei Durchgänge, nach denen die transduced EG vernickelt für Infektion oder in flüssigem Stickstoff eingefroren.</li>
</ol> 3. Infektion der ausgestrahlt EG mit KSHV <ol><li>am Tag vor der Infektion ernten EG durch enzymatische Verdauung mit der kommerziellen enzymatische Dissoziation-Lösung, wie oben beschrieben. Aufschwemmen Sie Zelle Pellet in 1 mL der EGM. Verwenden Sie 5 µL Zellen, um eine 1/10-Verdünnung in Trypan blau vorzubereiten. Lebende Zellen mit einem Hemocytometer zu zählen und Samen 2,5 x 10 5 lebende Zellen in 2 mL EGM pro Bohrloch in 6-well-Platten.</li>
	<li>Am Tag der Infektion entfernen EGM waschen Zellen mit 3 mL PBS mit Calcium und Magnesium pro Bohrloch, und fügen Sie dann 2 mL EBM. 
	Hinweis: Es ist unerlässlich, EBM, anstatt EGM während der Infektion, zu verwenden, wie das Heparin in EGM Viruspartikel zu Bindung und anschließende Infektion des Ziels EC hemmen wird</li>
	<li>Zellen mit KSHV, infizieren 5 bis 20 µL Virus Brühe in jede Vertiefung und wirbeln Teller mischen. Für Mock-infizierten Zellen ein gleiches Volumen an TNE Puffer in jede Vertiefung hinzufügen.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie Platten bei 400 X g für 30 min bei Raumtemperatur und inkubieren Sie die Platten bei 37 ° C für 90 min.</li>
	<li>, Wenn das Ziel der Studie werden frühe Ereignisse erfordern eine synchrone virale Infektion, z.B. frühe Ereignisse in de Novo Infektion untersucht soll entfernen das virale Inokulum an dieser Stelle. Spülen und refeed Zellen mit 2 mL frische EGM. Andernfalls fügen 2 mL EGM und Kulturen über Nacht inkubieren.</li>
	<li>Zellen mit 2 mL EGM am Tag nach der Infektion und dann jeden zweiten Tag refeed.</li>
	<li>Wenn Zellen sind etwa 90 % Zusammenfluss Ernten durch enzymatische Verdauung mit kommerziellen enzymatische Dissoziation-Lösung wie oben beschrieben, dann die Zellen aus drei Brunnen in einem T75 unter Hinweis auf die gesamte Durchgangsnummer und die Passage zu bündeln nach der Infektion.</li>
	<li>Erweitern Mock und KSHV-infizierten EG mit 1:3 Zwischenzeiten für mindestens zwei weitere Passagen zu welchem Zeitpunkt Zellen in flüssigem Stickstoff eingefroren oder in Experimenten verwendet werden können. 
	Hinweis: Wie bei der Aufteilung der EG mit E6 und E7 ausgestrahlt, Wartung Kulturen von Mock und KSHV-infizierten Zellen sollte aufgeteilt werden vor dem Erreichen der Mündung (~ 85 bis 90 %).</li></ol>
 4. Bestätigung Infektion mit KSHV durch Immunfluoreszenz Hinweis: Erkennung von der KSHV Latenz-assoziierten nuclear Antigen (LANA-1/ORF73) bietet eine zuverlässige quantitative Messung der Infektion. Anti-LANA-Antikörper sind im Handel erhältlich.
<ol><li>Am Tag vor der Färbung, Platte zwei Brunnen, die jeweils mit Mock-KSHV-infiziert oder EG auf einer 24-Well-Platte 1 x 10 5 pro Zellen nun in 1 mL EGM und über Nacht inkubieren.</li>
	<li>Waschen Zellen zweimal mit 500 µL PBS plus Calcium und Magniseum. Waschen für 30 s auf einem schaukelnden Plattform.</li>
	<li>Zellen mit 500 µL 4 % Paraformaldehyd für 15 min bei Raumtemperatur in einem extern-beatmete Dampfhaube befestigen.</li>
	<li>Waschen Zellen dreimal mit 500 µL Waschpuffer (0,1 % Triton x-100 plus 0,02 % Ziegenserum in PBS plus kationen).</li>
	<li>Zellen mit 500 µL 2 % Ziegenserum in Waschpuffer für 30 min bei Raumtemperatur blockieren.</li>
	<li>Zellen dreimal mit 500 µL Waschpuffer waschen.</li>
	<li>Kennzeichnen einen Brunnen von Mock-KSHV-infiziert oder EG mit 200 µL Primärantikörper 01:10 verdünnt0 in Waschpuffer für 30 min bei Raumtemperatur auf einer Wippe. Inkubieren Sie die verbleibenden zwei Brunnen in 200 µL Waschpuffer nur.</li>
	<li>Zellen dreimal mit 500 µL Waschpuffer waschen.</li>
	<li>Beschriften aller vier Brunnen mit 200 µL Sekundärantikörper verdünnt 1: 100 in Waschpuffer für 30 min bei Raumtemperatur auf einem Rocker.</li>
	<li>Zellen dreimal mit 500 µL Waschpuffer waschen.</li>
	<li>In jede Vertiefung gelten 20 µL Montage mittlerer mit DAPI und ein Deckglas und bewerten Färbung mit einem inversen Mikroskop fluoreszierende.</li>
	<li>Bestimmen die prozentuale Infektion KSHV-infizierten Zellen durch zählen der Anzahl der LANA-positiven Kerne in mindestens 200 Zellen. Infektion mit rekombinanten KSHV-Bac16 sich auch durch Beobachtung der Kulturen für den Ausdruck der GLP lässt.</li>
</ol>

Onkogenese ist ein mehrstufiger Prozess, der wichtige Sicherheitsvorkehrungen innerhalb eines Organismus36umgeht. KS-Läsionen entlang ein Spektrum der chronischen Entzündung zu wahren Sarkome bestehen, erfordert Aufklärung bestimmter pathophysiologischen Prozesse durch KSHV vermittelt, dass einige Studien in Zellmodellen Kultur durchgeführt werden, die Umwandlung9unterstützen. Es sollte angemerkt werden, dass Verlust von Kontakt-Hemmung und Anchorage-abhängigen Wachstum, Phänotypen indikativ der zellulären Transformation, nicht ohne weiteres entwickeln Infektionen des primären EG oder EC verewigt durch exogene Ausdruck der Telomerase. Deshalb, während der in-vitro- Modell der KS beschrieben hier nicht alle Aspekte der KS Tumor Mikroumgebung oder Verhalten von explantierten KS-Zellen rekapitulieren, ist es eindeutig geeignet für die Untersuchung von Veränderungen der Host Zelle Genexpression induziert durch eine Infektion mit KSHV, die KS Tumorgenese beitragen.
Die erste berichtet, dass gen-Expressions-profiling Studie hierin beschriebene Kultursystem mit der Rezeptor-Tyrosin-Kinase c-Kit als ein Beitrag zu den transformierten Phänotyp KSHV-infizierten Zellen25identifiziert. Von c-Kit-Ausdruck mit SiRNA niederzuschlagen oder Hemmung der c-Kit-Signal über eine dominante negative Konstrukt oder Tyrosin Kinase-Inhibitor STI 571 (Imatinib) beeinträchtigt die verwandelnde Fähigkeit der KSHV Manifest durch Verlust von Schwerpunkten Bildung nach längerem Kultur der infizierten Zellen. Spätere klinische Auswertung der Imatinib hat die Wirksamkeit dieses Medikaments bei Patienten mit epidemischer KS47,48,49gezeigt. Andere mögliche Behandlungsziele wurden auch einschließlich Häm Cyclooxygenase-126,50, CXCR727und der Beta-adrenergen Rezeptoren28, die eine im Wachstum oder in der Umwandlung der Rolle identifiziert, EG in-vitro-. Bestätigung dieser gen-Ausdruck-Muster in der primären EG sowie KS Biopsie Gewebe bestätigt die physiologische Relevanz dieses Systems und unterstreicht seinen Wert als der präklinischen Modell KS Therapeutik25,26 51,52,53,54,55.
Eine weitere Stärke des E6/E7 Transduktion Systems ist, dass die längere Lebensdauer im Vergleich zu primären EG ermöglicht die langfristige Erhaltung der Alter und Durchgang abgestimmt Mock-infizierten Kontrollzellen für vergleichende Bewertung der Ergebnisse der KSHV verewigt Infektion. Es ist wichtig zu beachten, dass zur Maximierung der Anzahl der Passagen der EG ausgestrahlt mit E6 und E7 ist es entscheidend für die Kulturen vor dem Erreichen der Mündung (~ 85 bis 90 %) aufgeteilt. Darüber hinaus vertragen diese Zellen serumfreien Bedingungen über einen längeren Zeitraum hinweg. Primäre EG schnell unterziehen programmierten Zelltod nach Wachstumsfaktor Zurücknahme und können daher kultiviert über lange Zeiträume ohne Serum oder rekombinanten Wachstumsfaktoren56,57. Diese Abhängigkeit macht autokrine Signalwege induziert durch eine Infektion mit KSHV schwer zu identifizieren und zu untersuchen, wie vor der vollständigen Umwandlung KSHV-infizierten Zellen auch programmierter Zelltod nach Wachstumsfaktor Zurücknahme (unveröffentlicht unterzogen werden (Beobachtung). Das Vorhandensein der E6 und E7 Proteine in diesem Modell, jedoch verhindern programmierten Zelltod nach Wachstumsfaktor Rückzug und ermöglichen längere (z.B.48 h) Kultur im niedrigen Serum oder Serum gratis mittlere25,26 , 28.
KS ist eine komplexe und ungewöhnliche Erkrankung mit chronischer Entzündung und zellulären Transformation. Der klinische Bedarf für neue therapeutische Strategien ist groß, und die hierin beschriebenen Zellmodell für Kultur hat einzigartige Eigenschaften, die Bewertung der Kandidaten Drogeziele.

Kaposi-Sarkom (KS) ist ein Multi-focal Angioproliferative Tumor Auswirkungen auf Haut, Schleimhaut und viszeralen Websites, der am häufigsten in der Umgebung von fortgeschrittenen Immununterdrückung1entwickelt. Vier epidemiologische Formen sind beschrieben worden: Classic, eine träge Form, das in der Regel ältere Menschen des Mittelmeerraums und des Nahen Ostens Erbes; iatrogene, durch Behandlung mit immunsuppressiven Medikamenten nach Organtransplantationen; Epidemie, eine AIDS-definierenden Krebs; und eine HIV-unabhängige Form häufig bei Kindern in endemischen Gebieten in Afrika endemisch. Mit dem Aufkommen der effektive Kombination Anti-retroviral Drogen-Therapien für die Behandlung von HIV ist Epidemie KS in Entwicklungsländern viel seltener diagnostiziert. Jedoch bleiben die klinisch aggressiven endemischen und epidemischen Formen unter die am häufigsten diagnostizierten Krebsarten in vielen afrikanischen Ländern2,3,4. Daher ist die Identifizierung von wirksame Pathogenese gezielt Medikamente zur Behandlung von KS Forschungsschwerpunkt.
Histologisch, zeichnen sich KS-Läsionen durch umfangreiche aber abnorme Neovaskularisation wobei Spindel Zellen EG Ursprungs diskontinuierliche vaskulären Netzwerken5bilden. Diese abnormen Gefäße ("vaskuläre Schlitze") erlauben Extravasation der Erythrozyten, die Läsionen ihre charakteristische Farbe geben. Darüber hinaus enthalten Läsionen zahlreiche Leukozyten, die chronischen Entzündung (z.B. Lymphozyten, Makrophagen und Plasmazellen) charakterisieren. Rückbildung der KS-Läsionen nach Immunrekonstitution wurde beschrieben, was darauf hindeutet, dass KS Funktionen einer hyper-proliferative Läsion und wahre Tumor6,7,8,9.
KS Herpesvirus (KSHV), dem Erreger der KS, wurde im Jahr 199410identifiziert. Seit dann viele in Vitro Zellkultur Modelle entwickelt worden um Pathogenese Studien ermöglichen, einschließlich der Zellen aus Biopsie Tumormaterial und primäre explantiert oder Telomerase exprimierenden EG infiziert mit KSHV in-vitro-11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18. keines der derzeit verfügbaren Modelle voll rekapituliert die KS Tumor Mikroumgebung, aber alle haben wertvolles Wissen zu unserem Verständnis der Pathobiologie KSHV Infektion beigetragen. Im Gegensatz zu den anderen bekannten tumorigenic menschliche Herpesvirus Epstein - Barr-Virus (EBV), KSHV nicht leicht transformiert Zellen in Kultur nach de Novo Infektion19,20,21, 22. aber diese Einschränkung überwunden durch transducing primären menschlichen EG entweder gemischt mikrovaskuläre oder lymphatischen Ursprungs mit der E6 und E7 Gene aus humanem Papillomavirus Typ 16 vor der Infektion mit KSHV23,24 . Ausdruck dieser exogene Onkogene erhöht drastisch das transformierende Potenzial der KSHV in-vitro- teilweise durch weitere Hemmung der Retinoblastoma Protein und p5323,24. Diese EG-Transduktion Methode hat mehrere Labore, wichtige Veränderungen im Host zu identifizieren erlaubt Zelle Genexpression, die durch KSHV Infektion hervorgerufen und, die Erleichterung der KS Zelle überleben und Verbreitung25,26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32. der hierin beschriebenen Protokolle sind unkompliziert und hoch reproduzierbare und führt zu der Generation von Alter und Durchgang abgestimmt KSHV-infizierten EG und Mock-infizierten Steuerelemente, können viel länger als primäre Zellen gezüchtet werden und werden, ermöglichen Sie die Untersuchung von onkogenen Mechanismen KSHV angestellt. Obwohl das Protokoll enthält ein Verfahren zur Herstellung von Wildtyp KSHV aus der primären Erguss Lymphome Zelllinie BCBL-1, E6/E7-verewigt EG sind auch sehr anfällig für Infektionen mit rekombinanten BACmid abgeleitet KSHV-BAC1630. Protokolle für die Vorbereitung des BAC16 sind an anderer Stelle beschrieben33,34.

<table><tbody><tr><td>BCBL-1 cells</td><td>NIH AIDS Reagent Program</td><td>3233</td><td></td></tr><tr><td>PA317 cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-2203</td><td></td></tr><tr><td>Neonatal dermal microvascular endothelial cells</td><td>Lonza</td><td>CC-2505</td><td></td></tr><tr><td>EBM-2 Basal Medium</td><td>Lonza</td><td>CC-3156</td><td></td></tr><tr><td>EGM-2 BulletKit</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td></td></tr><tr><td>anti-KSHV LANA/ORF 73</td><td>Advanced Biotechnologies</td><td>13-210-100</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt;Express, no phenol red</td><td>ThermoFisher</td><td>12604013</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS with calcium and magnesium</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

an in vitro model for studying cellular transformation by kaposi sarcoma herpesvirus

Kaposi-Sarkom (KS) ist eine ungewöhnliche Tumor bestehend aus wuchernden Spindel Zellen, die durch Infektion der Endothelzellen (EG) mit KSHV initiiert und entwickelt sich in den meisten Fällen im Rahmen der Immunsuppression. Trotz jahrzehntelanger Forschung optimale Behandlung von KS bleibt schlecht definiert und klinischen Ergebnisse sind besonders ungünstig in beschränkten Ressourcen. KS-Läsionen sind getrieben von pathologischen Angiogenese, chronische Entzündungen und Onkogenese und verschiedene in-vitro- Kultur Zellmodelle wurden entwickelt, um diese Prozesse zu studieren. KS ergibt sich aus KSHV-infizierten Zellen endothelialen Ursprungs, also EC-Linie Zellen am besten geeignete in-vitro- Surrogate von der Spindel Zelle Vorläufer zur Verfügung stellen. Da EG haben eine begrenzte in-vitro- Lebensdauer, und die onkogenen Mechanismen KSHV angestellt sind weniger effizient als die der anderen tumorigenic Viren, es war jedoch schwierig zu beurteilen, die Prozesse der Transformation in der PV oder Telomerase-verewigt EC Daher wurde ein neuartiger EG basierende Kultur-Modell entwickelt, die Transformation nach Infektion mit KSHV bereitwillig unterstützt. Ektopische Expression der Gene des menschlichen Papillomavirus Typ 16 E6 und E7 erweiterte Kultur von Alter und Durchgang abgestimmt Mock und KSHV-infizierten EG ermöglicht und unterstützt die Entwicklung einer wahrhaft transformierten (d. h. tumorigenic) Phänotyp in infizierten Zellkulturen . Diese gefügig und hoch reproduzierbare Modell KS hat die Entdeckung von mehreren wesentlichen Signalwege mit hohem Potenzial für die Übersetzung in klinischen Umgebungen erleichtert.

Die Morphologie der primären EG wird klassisch als "Kopfsteinpflaster" beschrieben, und diese Morphologie wird nicht durch Ausdruck der Papillomavirus E6 und E7 Gene (Abbildung 1A) verändert. Ausdruck der E6 und E7 Gene allein nicht dazu veranlassen, einen veränderten Phänotyp; so Zellen sind anfällig für Hemmung wenden Sie sich an und werden nicht mehr geteilt beim Zusammenfluss in Kultur zu erreichen. Die Zellen werden jedoch vermehren und nachwachsen, Zusammenfluss von Trypsinization und replating auf eine geringere Dichte, so dass für die Pflege Alter und Durchgang abgestimmt Kulturen für den Einsatz als Mock-infizierten Kontrollen.
Infektion der E6/E7-ausgestrahlt EG mit KSHV verursacht dramatische morphologische Veränderungen in Kultur, die erinnert an die "Spindel Zelle" Phänotyp in KS-Läsionen (Abbildung 1 b) beobachtet werden. Ein transformierter Phänotyp ist auch nach Infektion mit KSHV, induziert, was ist Manifest teilweise durch Verlust des Kontakt-Hemmung, wenn Zellen kultiviert nach dem Zusammenfluss (Abbildung 1) und Anchorage-unabhängige Wachstum in weichen Agar (Abbildung 2) sind. Kontakt-Hemmung und die Abhängigkeit der extrazellulären Matrix Interaktionen (Verankerung) während der Onkogenese sind zwei Kennzeichen des zellulären Transformation36. Es ist wichtig zu beachten, dass primäre EG sind auch anfällig für Infektionen mit KSHV und Primärsysteme EG äußerst wertvoll wurden für die Aufklärung diverse Aspekte von Virus-Wirt-Interaktion und deren Folgen. Solche Studien sind in der Literatur gut vertreten und einige Beispiele werden hier zitiert37,38,39,40,41,42,43 ,44.
Immunofluorescent Färbung zeigt, dass die Spindel Morphologie der KSHV-infizierten Zellen Expression der viralen Proteins LANA-1/ORF73 (Abbildung 3A und 3 b, rot) zugeordnet ist. Wie die Konzentration des Virus in Aktien zwischen Zubereitungen variieren, sollte das Volumen des Virus pro Bohrloch hinzugefügt angepasst werden, so dass KSHV-infizierten Kulturen erreichen &#62; 90 % Infektion innerhalb von ein oder zwei Passagen. Mit seriellen Passage der Prozentsatz der Infektion wird 100 % nähern und erhalten für die Dauer der Kultur (ca. 20 Stellen). Geringere Mengen des Virus können verwendet werden, wenn eine Studie parakrine Einflüsse werden soll oder wenn benachbarte nicht infizierte Zellen als Steuerelemente (z. B.für Immunfluoreszenz Studien mit anderen interessierenden Proteine) wünschenswert sind. Infizierten Kulturen unterstützen auch Ausdruck der lytischen virale Proteine, aber wie in KS-Läsionen beobachtet wird, wird nur eine Minderheit der Zellen in Kultur spontan lytische Reaktivierung (Abb. 3 b, grün) unterzogen. Zellen, die infizierte KSHV-BAC16, die mit GFP versehen ist, entwickeln auch eine Spindel Morphologie (Abbildung 3 und 3D). Wenn KSHV-BAC16 verwendet wird, können virale Titer durch Zellen mit einem seriell verdünnt konzentrierter Virus zu infizieren und Bewertung von Zellen für die GFP Expression bei 48 h Post Infektion mit Flow Cytometry30erreicht werden.
Für rekombinante und WT-Virus können viraler Genome in Lager Zubereitungen auch durch die Reinigung der DNA aus infizierten Zellen, gefolgt von PCR-Quantifizierung der KSHV DNA-Ebenen gemessen werden; Allerdings sollte man nicht davon ausgehen, dass alle Genome infektiöse45sind. Ist die Studie des KSHV lytischen Zyklus bestimmt, Virus-Reaktivierung lässt durch Stimulierung EG mit Induktion Agenten wie oben beschrieben für BCBL-1-Zellen, obwohl die Effizienz der Reaktivierung unteren23ist. Der lytische Zyklus kann auch durch Transduktion der EG mit dem KSHV Transaktivator Protein ORF5046induziert werden. Einklang mit Ergebnissen in anderen Kultur Zellmodellen KS, spontanen Ausdruck und chemische Induktion KSHV lytische Gene in E6/E7-Ausdruck EG sinkt im Laufe der Zeit trotz Wartung eine stabile latente Infektion11,16 .
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/54828/54828fig1.jpg"> 
Abbildung 1: Morphologie der Mock- und KSHV infiziert EC (A) Mock-infizierten EG Monolagen Ausstellung der klassischen Kopfsteinpflaster Stein Auftritt von lebenswichtigen Phasenkontrastmikroskopie. Ohne die Aktionen der KSHV Gene werden dieser Zellen werden nicht umgewandelt und daher nicht mehr geteilt und Kontakt Hemmung beim Zusammenfluss in Kultur zu erreichen. (B) KSHV-infizierten Zellen entwickeln dagegen eine längliche "Spindel" Zellmorphologie erinnert an KS Spindel Zellen. Dieses Fenster zeigt die Morphologie der KSHV-infizierten Zellen am Tag 5 PI beim Zusammenfluss erreichen. (C) In KSHV-infizierten Zellen führen umfangreiche Änderungen im Genausdruck Wirt Zelle zellulären Transformation, die offensichtlich werden, wenn KSHV-infizierten Zellen ohne Durchgang kultiviert werden. Unter diesen Bedingungen weiter KSHV-infizierten Zellen wuchern auch nach Zusammenfluss, die zur Entwicklung von mehrschichtigen Brennpunkte der Zellen zu erreichen. Dieses Fenster zeigt die Morphologie der KSHV-infizierten Zellen am 14. Tag PI, für 9 Tage nach dem Zusammenfluss kultiviert. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54828/54828fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/54828/54828fig2.jpg"> 
Abbildung 2: Anchorage unabhängiges Wachstum. Untransformierten Zellen durchlaufen in der Regel apoptotischen Zelltod nach Verlust des Kontaktes mit einem Substrat, einen Prozess namens Anoikis. (A) wenn E6/E7-ausgestrahlt Mock-infizierten EG, die nicht transformiert, in weiche Agar suspendiert und für zwei Wochen, die Sie nicht Kolonien bilden kultiviert. (B) KSHV-infizierten EG, der Virus verwandelt werden, sind resistent gegen Anoikis und bilden Kolonien in weichen Agar. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54828/54828fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/54828/54828fig3.jpg"> 
Abbildung 3: Demonstration der viralen Proteinexpression. (A) die Spindel Morphologie ist offensichtlich nach Infektion mit KSHV (40 X Vergrößerung). (B) Immunofluorescent Färbung desselben Feldes gezeigt in (A) zeigt, dass die Spindel Morphologie Expression des Proteins virale Latenz ORF73 (rot) zugeordnet ist. Infizierte Zellen unterstützen lytische Virusreplikation ebenso, wie ein kleiner Prozentsatz der Zellen, die mit dem Ausdruck der viralen Profis zeigtCessivity Faktor ORF59 (grün). (A und B von Referenz26geändert.) Die Spindel Morphologie der Zellen, die infizierte KSHV-BAC16 Virus (C) ist Ausdruck der GFP (D) zugeordnet (20 X Vergrößerung). <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54828/54828fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus

Kaposi-Sarkom (KS) ist ein Tumor induziert durch eine Infektion mit onkogenen Viren menschliche Herpesvirus-8/KS Herpesvirus (HHV-8/KSHV). Die Endothelzellen Kultur Modell hier beschriebenen eignet sich eindeutig für die Untersuchung der Mechanismen, mit denen KSHV Wirtszellen verwandelt.

Ein In-vitro- Modell für die Erforschung der zellulären Transformation von Kaposi-Sarkom-Herpesvirus

Kaposi sarcoma (KS) is an unusual tumor composed of proliferating spindle cells that is initiated by infection of endothelial cells (EC) with KSHV, and ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus

8.2K Aufrufe.  University of Minnesota Medical School. Kaposi-Sarkom (KS) ist ein Tumor induziert durch eine Infektion mit onkogenen Viren menschliche Herpesvirus-8/KS Herpesvirus (HHV-8/KSHV). Die Endothelzellen Kultur Modell hier beschriebenen eignet sich eindeutig für die Untersuchung der Mechanismen, mit denen KSHV Wirtszellen verwandelt.

Serie: An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus

Identifying Dysregulated Genes Induced by Kaposi's Sarcoma-associated Herpesvirus (KSHV)

Currently KS is the most predominant HIV/AIDS related malignancy in Southern Africa and hence the world.1,2 It is characterized as an angioproliferative tumor of vascular endothelial cells and produces rare B cell lymphoproliferative diseases in the form of pleural effusion lymphomas (PEL) and some forms of multicentric Castleman's disease.3-5 Only 1-5% of cells in KS lesions actively support lytic replication of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV), the etiological agent associated with KS, and it is clear that cellular factors must interact with viral factors in the process of oncogenesis and tumor progression.6,7 Identifying novel host-factor determinants which contribute to KS pathology is essential for developing prognostic markers for tumor progression and metastasis as well as for developing novel therapeutics for the treatment of KS.8 The accompanying video details the methods we use to identify host cell gene expression programs altered in dermal microvascular endothelial cells (DMVEC) after KSHV infection and in KS tumor tissue.9 Once dysregulated genes are identified by microarray analysis, changes in protein expression are confirmed by immunoblot and dual labeled immunofluorescence. Changes in transcriptional expression of dysregulated genes are confirmed in vitro by quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR). Validation of in vitro findings using archival KS tumor tissue is also performed by dual labeled immunochemistry and tissue microarrays.8,10 Our approach to identifying dysregulated genes in the KS tumor tissue microenvironment will allow the development of in vitro and subsequently in vivo model systems for discovery and evaluation of potential novel therapeutic for the treatment of KS.

Identifying Dysregulated Genes Induced by Kaposi's Sarcoma-associated Herpesvirus KSHV

Host cell factors play a critical role in the establishment and maintenance of Kaposi's sarcoma (KS). We outline methods to identify host cell factors altered in KSHV-infected DMVEC cells, and in KS tumor tissue. Cellular genes altered by virus will serve as potential target(s) for novel therapeutics.

Identifizieren Dysregulated Gene von Kaposi-Sarkom-assoziierten Herpesvirus (KSHV) Induced

Currently KS is the most predominant HIV/AIDS related malignancy in Southern Africa and hence the world.1,2 It is characterized as an angioproliferative ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Dissecting Host-virus Interaction in Lytic Replication of a Model Herpesvirus

In response to viral infection, a host develops various defensive responses, such as activating innate immune signaling pathways that lead to antiviral cytokine production1,2. In order to colonize the host, viruses are obligate to evade host antiviral responses and manipulate signaling pathways. Unraveling the host-virus interaction will shed light on the development of novel therapeutic strategies against viral infection.
Murine &gamma;HV68 is closely related to human oncogenic Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus and Epsten-Barr virus3,4. &gamma;HV68 infection in laboratory mice provides a tractable small animal model to examine the entire course of host responses and viral infection in vivo, which are not available for human herpesviruses. In this protocol, we present a panel of methods for phenotypic characterization and molecular dissection of host signaling components in &gamma;HV68 lytic replication both in vivo and ex vivo. The availability of genetically modified mouse strains permits the interrogation of the roles of host signaling pathways during &gamma;HV68 acute infection in vivo. Additionally, mouse embryonic fibroblasts (MEFs) isolated from these deficient mouse strains can be used to further dissect roles of these molecules during &gamma;HV68 lytic replication ex vivo.
Using virological and molecular biology assays, we can pinpoint the molecular mechanism of host-virus interactions and identify host and viral genes essential for viral lytic replication. Finally, a bacterial artificial chromosome (BAC) system facilitates the introduction of mutations into the viral factor(s) that specifically interrupt the host-virus interaction. Recombinant &gamma;HV68 carrying these mutations can be used to recapitulate the phenotypes of &gamma;HV68 lytic replication in MEFs deficient in key host signaling components. This protocol offers an excellent strategy to interrogate host-pathogen interaction at multiple levels of intervention in vivo and ex vivo.
Recently, we have discovered that &gamma;HV68 usurps an innate immune signaling pathway to promote viral lytic replication5. Specifically, &gamma;HV68 de novo infection activates the immune kinase IKK&beta; and activated IKK&beta; phosphorylates the master viral transcription factor, replication and transactivator (RTA), to promote viral transcriptional activation. In doing so, &gamma;HV68 efficiently couples its transcriptional activation to host innate immune activation, thereby facilitating viral transcription and lytic replication. This study provides an excellent example that can be applied to other viruses to interrogate host-virus interaction.

We describe a protocol to identify key roles of host signaling molecules in lytic replication of a model herpesvirus, gamma herpesvirus 68 (&gamma;HV68). Utilizing genetically modified mouse strains and embryonic fibroblasts for &gamma;HV68 lytic replication, the protocol permits both phenotypic characterization and molecular interrogation of virus-host interactions in viral lytic replication.

Sezieren Host-Virus-Interaktion in Lytic Replikation von einem Modell Herpesvirus

In response to viral infection, a host develops various defensive responses, such as activating innate immune signaling pathways that lead to antiviral ...

Production of Replication-Defective Retrovirus by Transient Transfection of 293T cells

Our lab studies human myeloproliferative diseases induced by such oncogenes as Bcr-Abl or growth factor receptor-derived oncogenes (ZNF198-FGFR1, Bcr-PDGFR&#945;, etc.). We are able to model and study a human-like disease in our mouse model, by transplanting bone marrow cells previously infected with a retrovirus expressing the oncogene of interest. Replication-defective retrovirus encoding a human oncogene and a marker (GFP, RFP, antibiotic resistance gene, etc.) is produced by a transient transfection protocol using 293T cells, a human renal epithelial cell line transformed by the adenovirus E1A gene product. 293 cells have the unusual property of being highly transfectable by calcium phosphate (CaPO4), with up to 50-80% transfection efficiency readily attainable. Here, we co-transfect 293 cells with a retroviral vector expressing the oncogene of interest and a plasmid that expresses the gag-pol-env packaging functions, such as the single-genome packaging constructs kat or pCL, in this case the EcoPak plasmid. The initial transfection is further improved by use of chloroquine. Stocks of ecotropic virus, collected as culture supernatant 48 hrs. post-transfection, can be stored at -80&deg;C and used for infection of cell-lines in view of transformation and in vitro studies, or primary cells such as mouse bone marrow cells, that can then be used for transplant in our mouse model.

This technique demonstrates an efficient way to prepare replication-defective retroviral stocks encoding a human oncogene, and subsequently used for induction of myeloproliferative disease in the mouse model.

Produktion von replikationsdefekte Retrovirus durch transiente Transfektion von 293T-Zellen

Our lab studies human myeloproliferative diseases induced by such oncogenes as Bcr-Abl or growth factor receptor-derived oncogenes (ZNF198-FGFR1, ...

Biologie

Ex Vivo Organotypic Corneal Model of Acute Epithelial Herpes Simplex Virus Type I Infection

Herpes keratitis is one of the most severe pathologies associated with the herpes simplex virus-type 1 (HSV-1). Herpes keratitis is currently the leading cause of both cornea-derived and infection-associated blindness in the developed world. Typical presentation of herpes keratitis includes infection of the corneal epithelium and sometimes the deeper corneal stroma and endothelium, leading to such permanent corneal pathologies as scarring, thinning, and opacity 1.
Corneal HSV-1 infection is traditionally studied in two types of experimental models. The in vitro model, in which cultured monolayers of corneal epithelial cells are infected in a Petri dish, offers simplicity, high level of replicability, fast experiments, and relatively low costs. On the other hand, the in vivo model, in which animals such as rabbits or mice are inoculated directly in the cornea, offers a highly sophisticated physiological system, but has higher costs, longer experiments, necessary animal care, and a greater degree of variability. 
In this video article, we provide a detailed demonstration of a new ex vivo model of corneal epithelial HSV-1 infection, which combines the strengths of both the in vitro and the in vivo models. The ex vivo model utilizes intact corneas organotypically maintained in culture and infected with HSV-1. The use of the ex vivo model allows for highly physiologically-based conclusions, yet it is rather inexpensive and requires time commitment comparable to that of the in vitro model.

Ex Vivo Organotypic Corneal Model of Acute Epithelial Herpes Simplex Virus Type I Infection

In this video article we describe the use of a new ex vivo model of acute herpes simplex virus type I corneal epithelial infection.

Ex Vivo Organotypische Corneal Modell der akuten Epithelial Herpes Simplex Virus Typ I Infection

Herpes keratitis is one of the most severe pathologies associated with the herpes simplex virus-type 1 (HSV-1).  Herpes keratitis is currently the leading ...

Neurowissenschaften

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile conditions. Different tests seek to identify and quantify these hallmarks of cancerous cells; however, they often focus on a single aspect of cellular transformation and, in fact, multiple tests are required for their proper characterization. The purpose of this work is to provide researchers with a set of tools to assess cellular transformation in vitro from a broad perspective, thereby making it possible to draw sound conclusions.
A sustained proliferative signaling activation is the major feature of tumoral tissues and can be easily monitored under in vitro conditions by calculating the number of population doublings achieved over time. Besides, the growth of cells in 3D cultures allows their interaction with surrounding cells, resembling what occurs in vivo. This enables the evaluation of cellular aggregation and, together with immunofluorescent labeling of distinctive cellular markers, to obtain information on another relevant feature of tumoral transformation: the loss of proper organization. Another remarkable characteristic of transformed cells is their capacity to grow without attachment to other cells and to the extracellular matrix, which can be evaluated with the anchorage assay.
Detailed experimental procedures to evaluate cell growth rate, to perform immunofluorescent labeling of cell lineage markers in 3D cultures, and to test anchorage-independent cell growth in soft agar are provided. These methodologies are optimized for Breast Primary Epithelial Cells (BPEC) due to its relevance in breast cancer; however, procedures can be applied to other cell types after some adjustments.

This protocol provides experimental in vitro tools to evaluate the transformation of human mammary cells. Detailed steps to follow-up cell proliferation rate, anchorage-independent growth capacity, and distribution of cell lineages in 3D cultures with basement membrane matrix are described.

In Vitro-Bewertung der onkogenen Transformation in menschlichen Mammaepithelzellen

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

Krebsforschung

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

To enter its human host, herpes simplex virus type 1 (HSV-1) must overcome the barrier of mucosal surfaces, skin, or cornea. HSV-1 targets keratinocytes during initial entry and establishes a primary infection in the epithelium, which is followed by latent infection of neurons. After reactivation, viruses can become evident at mucocutaneous sites that appear as skin vesicles or mucosal ulcers. How HSV-1 invades skin or mucosa and reaches its receptors is poorly understood. To investigate the invasion route of HSV-1 into epidermal tissue at the cellular level, we established an ex vivo infection model of murine epidermis, which represents the site of primary and recurrent infection in skin. The assay includes the preparation of murine skin. The epidermis is separated from the dermis by dispase II treatment. After floating the epidermal sheets on virus-containing medium, the tissue is fixed and infection can be visualized at various times postinfection by staining infected cells with an antibody against the HSV-1 immediate early protein ICP0. ICP0-expressing cells can be observed in the basal keratinocyte layer already at 1.5 hr postinfection. With longer infection times, infected cells are detected in suprabasal layers, indicating that infection is not restricted to the basal keratinocytes, but the virus spreads to other layers in the tissue. Using epidermal sheets of various mouse models, the infection protocol allows determining the involvement of cellular components that contribute to HSV-1 invasion into tissue. In addition, the assay is suitable to test inhibitors in tissue that interfere with the initial entry steps, cell-to-cell spread and virus production. Here, we describe the ex vivo infection protocol in detail and present our results using nectin-1- or HVEM-deficient mice.

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

The skin is one target tissue of the human pathogen herpes simplex virus type 1 (HSV-1). To explore the invasion route of HSV-1 into tissue, we established an ex vivo infection model of murine epidermal sheets which represent the outermost layer of skin.

Ex vivo Infektion von murinen Epidermis mit Herpes Simplex Virus Typ 1

To enter its human host, herpes simplex virus type 1 (HSV-1) must overcome the barrier of mucosal surfaces, skin, or cornea. HSV-1 targets keratinocytes ...

Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice

Current astrocytoma models are limited in their ability to define the roles of oncogenic mutations in specific brain cell types during disease pathogenesis and their utility for preclinical drug development. In order to design a better model system for these applications, phenotypically wild-type cortical astrocytes and neural stem cells (NSC) from conditional, genetically engineered mice (GEM) that harbor various combinations of floxed oncogenic alleles were harvested and grown in culture. Genetic recombination was induced in vitro using adenoviral Cre-mediated recombination, resulting in expression of mutated oncogenes and deletion of tumor suppressor genes. The phenotypic consequences of these mutations were defined by measuring proliferation, transformation, and drug response in vitro. Orthotopic allograft models, whereby transformed cells are stereotactically injected into the brains of immune-competent, syngeneic littermates, were developed to define the role of oncogenic mutations and cell type on tumorigenesis in vivo. Unlike most established human glioblastoma cell line xenografts, injection of transformed GEM-derived cortical astrocytes into the brains of immune-competent littermates produced astrocytomas, including the most aggressive subtype, glioblastoma, that recapitulated the histopathological hallmarks of human astrocytomas, including diffuse invasion of normal brain parenchyma. Bioluminescence imaging of orthotopic allografts from transformed astrocytes engineered to express luciferase was utilized to monitor in vivo tumor growth over time. Thus, astrocytoma models using astrocytes and NSC harvested from GEM with conditional oncogenic alleles provide an integrated system to study the genetics and cell biology of astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo and may be useful in preclinical drug development for these devastating diseases.

Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice

Phenotypically wild-type astrocytes and neural stem cells harvested from mice engineered with floxed, conditional oncogenic alleles and transformed via viral Cre-mediated recombination can be used to model astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo by orthotopic injection of transformed cells into brains of syngeneic, immune-competent littermates.

Modellierung Astrozytom Pathogenese<em&gt; In-vitro-</em&gt; Und<em&gt; In Vivo</em&gt; Verwenden kortikale Astrozyten oder neuralen Stammzellen aus dem Bedingten, gentechnisch veränderte Mäuse

Current astrocytoma models are limited in their ability to define the roles of oncogenic mutations in specific brain cell types during disease ...

Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) and Immunofluorescence (IF) of Specific Gene Products in KSHV-Infected Cells

Mechanistic insight arrives from careful study and quantification of specific RNAs and proteins. The relative locations of these biomolecules throughout the cell at specific times can be captured with fluorescence in situ hybridization (FISH) and immunofluorescence (IF). During lytic herpesvirus infection, the virus hijacks the host cell to preferentially express viral genes, causing changes in cell morphology and behavior of biomolecules. Lytic activities are centered in nuclear factories, termed viral replication compartments, which are discernable only with FISH and IF. Here we describe an adaptable protocol of RNA FISH and IF techniques for Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV)-infected cells, both adherent and in suspension. The method includes steps for the development of specific anti-sense oligonucleotides, double RNA FISH, RNA FISH with IF, and quantitative calculations of fluorescence intensities. This protocol has been successfully applied to multiple cell types, uninfected cells, latent cells, lytic cells, time-courses, and cells treated with inhibitors to analyze the spatiotemporal activities of specific RNAs and proteins from both the human host and KSHV.

Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization FISH and Immunofluorescence IF of Specific Gene Products in KSHV-Infected Cells

We describe a protocol utilizing fluorescence in situ hybridization (FISH) to visualize multiple herpesviral RNAs within lytically infected human cells, either in suspension or adherent. This protocol includes quantification of fluorescence producing a nucleocytoplasmic ratio and can be extended for simultaneous visualization of host and viral proteins with immunofluorescence (IF).

Quantitative Fluoreszenz In Situ Hybridisierung (FISH) und Immunfluoreszenz (IF) spezifischer Genprodukte in KSHV-infizierten Zellen

Mechanistic insight arrives from careful study and quantification of specific RNAs and proteins. The relative locations of these biomolecules throughout ...

Monitoring Plasmid Replication in Live Mammalian Cells over Multiple Generations by Fluorescence Microscopy

Few naturally-occurring plasmids are maintained in mammalian cells. Among these are genomes of gamma-herpesviruses, including Epstein-Barr virus (EBV) and Kaposi's Sarcoma-associated herpesvirus (KSHV), which cause multiple human malignancies 1-3. These two genomes are replicated in a licensed manner, each using a single viral protein and cellular replication machinery, and are passed to daughter cells during cell division despite their lacking traditional centromeres 4-8.
Much work has been done to characterize the replications of these plasmid genomes using methods such as Southern blotting and fluorescence in situ hybridization (FISH). These methods are limited, though. Quantitative PCR and Southern blots provide information about the average number of plasmids per cell in a population of cells. FISH is a single-cell assay that reveals both the average number and the distribution of plasmids per cell in the population of cells but is static, allowing no information about the parent or progeny of the examined cell.
Here, we describe a method for visualizing plasmids in live cells. This method is based on the binding of a fluorescently tagged lactose repressor protein to multiple sites in the plasmid of interest 9. The DNA of interest is engineered to include approximately 250 tandem repeats of the lactose operator (LacO) sequence. LacO is specifically bound by the lactose repressor protein (LacI), which can be fused to a fluorescent protein. The fusion protein can either be expressed from the engineered plasmid or introduced by a retroviral vector. In this way, the DNA molecules are fluorescently tagged and therefore become visible via fluorescence microscopy. The fusion protein is blocked from binding the plasmid DNA by culturing cells in the presence of IPTG until the plasmids are ready to be viewed.
This system allows the plasmids to be monitored in living cells through several generations, revealing properties of their synthesis and partitioning to daughter cells. Ideal cells are adherent, easily transfected, and have large nuclei. This technique has been used to determine that 84% of EBV-derived plasmids are synthesized each generation and 88% of the newly synthesized plasmids partition faithfully to daughter cells in HeLa cells. Pairs of these EBV plasmids were seen to be tethered to or associated with sister chromatids after their synthesis in S-phase until they were seen to separate as the sister chromatids separated in Anaphase10. The method is currently being used to study replication of KSHV genomes in HeLa cells and SLK cells. HeLa cells are immortalized human epithelial cells, and SLK cells are immortalized human endothelial cells. Though SLK cells were originally derived from a KSHV lesion, neither the HeLa nor SLK cell line naturally harbors KSHV genomes11. In addition to studying viral replication, this visualization technique can be used to investigate the effects of the addition, removal, or mutation of various DNA sequence elements on synthesis, localization, and partitioning of other recombinant plasmid DNAs.

A method of observing individual DNA molecules in live cells is described. The technique is based on the binding of a fluorescently tagged lac repressor protein to binding sites engineered into the DNA of interest. This method can be adapted to follow many recombinant DNAs in live cells over time.

Überwachung Plasmid-Replikation in lebenden Säugerzellen über mehrere Generationen durch Fluoreszenz-Mikroskopie

Few naturally-occurring plasmids are maintained in mammalian cells.  Among these are genomes of gamma-herpesviruses, including Epstein-Barr virus  (EBV) ...

Dual Bioluminescence Imaging of Tumor Progression and Angiogenesis

Angiogenesis, as a crucial process of tumor progression, has become a research hotspot and target of anti-tumor therapy. However, there is no reliable model for tracing tumor progression and angiogenesis simultaneously in a visual and sensitive manner. Bioluminescence imaging displays its unique superiority in living imaging due to its advantages of high sensitivity, strong specificity, and accurate measurement. Presented here is a protocol to establish a tumor-bearing mouse model by injecting a Renilla luciferase-labeled murine breast cancer cell line 4T1 into the transgenic mouse with angiogenesis-induced Firefly luciferase expression. This mouse model provides a valuable tool to simultaneously monitor tumor progression and angiogenesis in real-time by dual bioluminescence imaging in a single mouse. This model may be widely applied in anti-tumor drug screening and oncology research.

This protocol describes the establishment of a tumor-bearing mouse model to monitor tumor progression and angiogenesis in real-time by dual bioluminescence imaging.

Dual Biolumineszenz-Bildgebung der Tumorprogression und Angiogenese

Angiogenesis, as a crucial process of tumor progression, has become a research hotspot and target of anti-tumor therapy. However, there is no reliable ...